القياس الكمي للكريات البيض الملتصقة الناجمة عن مرض السكري في الأوعية الدموية الشبكية

نوضح طريقة لتسمية جدران الأوعية الدموية الشبكية والكريات البيض الملتصقة. يمكن بعد ذلك حساب هذه الكريات البيض الملتصقة تحت المجهر الفلوري كمعامل للالتهاب أو استجابة هذا الالتهاب للعلاجات.

يشير داء الطلاوة إلى ارتباط الكريات البيض بالجدار اللمعي للأوعية. هذا التفاعل بين الكريات البيض وجدار الأوعية الدموية هو سمة من سمات الالتهاب وقد تم ربطه سببيا بالانسداد الشعري في مجموعة متنوعة من الأنسجة والأمراض ، بما في ذلك اعتلال الشبكية السكري.

تم الإبلاغ عن داء الطلاوة لسنوات كمضاعفات تهدد الحياة لفرط كريات الكريات البيضاء ولا يمكن تشخيصه إلا سريريا. ونظرا لأهمية هذه الظاهرة، أجريت بحوث مكثفة لفهم الآلية (الآليات) المحتملة التي تؤدي إلى ظهورها؛ ومع ذلك ، لا توجد تقنية معيارية ذهبية في إعدادات المختبر لتصور وتحديد شدة الحدث.

في الطريقة الملخصة أدناه ، يتم تغذية الأوعية الدموية في البداية بمخزن مؤقت لإزالة الدم ، وبعد ذلك ، يتم نفخ كونكانافالين أ في الأوعية الدموية حيث يرتبط بجميع جدران الخلايا المكشوفة ويسبب تلطيخا ساطعا بشكل خاص للكريات البيض. إذا نجح التروية لإزالة جميع خلايا الدم غير المرتبطة ، فإن الكريات البيض المتبقية المسماة بالفلورسنت مرتبطة بالأوعية الدموية ، ويمكن قياسها يدويا باستخدام أي مجهر مضان متاح.

تلعب الكريات البيض (خلايا الدم البيضاء ، كرات الدم البيضاء ) دورا مهما في الوظيفة المثلى للأوعية الدموية مثل الحفاظ على سيولة الدم وتنظيم قرار الجلطة¹. كما أنها تلعب دورا رئيسيا في بعض الحالات المرضية ، مثل الالتصاق بالجدار اللمعي للأوعية الدموية لفترات طويلة من الزمن مما يؤدي إلى انسداد الأوعية الدموية ، على الأقل مؤقتا ، وهي ظاهرة تعرف باسم الكريات البيض^2،3.

اعتلال الشبكية السكري هو أحد أكثر المضاعفات شيوعا لمرض السكري طويل الأمد وأحد الأسباب الرئيسية لضعف البصر والعمى في الولايات المتحدة وجميع أنحاء العالم للأفراد الذين تتراوح أعمارهم بين 20 و 75 عاما^{من سن 4}. يعد التنكس البطيء والتدريجي لالأوعية الدموية في الشبكية مكونا ذا مغزى سريريا في المراحل المبكرة من المرض ، والذي يؤدي في بعض المرضى إلى نقص تروية الشبكية مع^{الناتج عن ذلك} ، 5^،6. تشير الأدلة التراكمية إلى أن الالتهاب يلعب دورا مهما في تطور اعتلال الشبكية⁷ ، ويعتبر التهاب البيضاء: استجابة التهابية داخل الأوعية الدموية تحت الإكلينيكية. يحدث داء الطلاوة في المراحل المبكرة من مرض السكري ، قبل وقت طويل من تطور أي مظاهر سريرية يمكن^{اكتشافها 8،9،10}. قد يساهم الانسداد المتكرر للأوعية الشبكية بواسطة الكريات البيض الملتصقة على مدى أشهر إلى سنوات (الكريات البيض المزمنة) في مرض السكري في انسداد الأوعية الدموية وتنكس الشعيرات^{الدموية 11،12،13}. شدة هذا الالتهاب البيضاء، ذات أهمية مرضية ويمكن استخدامها لمراقبة شدة عملية المرض أو لتقييم فعالية العلاج في أماكن البحث.

لمزيد من الدراسة للتأثيرات المحددة للبيئة المكروية لارتفاع السكر في الدم على داء الكريات البيضاء ، تم تصميم نماذج في المختبر . يمكن زراعة الخلايا البطانية للأوعية الدموية الدقيقة المعزولة في الشبكية وترتيبها إما في نماذج ثقافات ثنائية أو ثلاثية الأبعاد (الأوعية الدموية الدقيقة على رقاقة¹⁴) لتكرار بطانة الأوعية الدموية (طبقة خلية أحادية تمهد تجويف الأوعية). ومع ذلك ، فإن التباين بين التجارب لهذه النماذج يحد من استخدامها. لا تزال دراسة داء الكريات البيض في الأوعية الدموية الشبكية البشرية في الجسم الحي محدودة ، وبالتالي ، فإن معظم المعرفة الحالية حول سرطان الشبكية مشتقة من النماذج الحيوانية لاعتلال الشبكية السكري^13،15.

الهدف من هذا التقرير هو وصف بروتوكول قياسي يعتمد على الطرق الموصوفة في مكان آخر¹⁶ لتقدير الكريات البيض المرتبطة بالأوعية الدموية الشبكية كمعامل لالتهاب الكريات البيض. يمكن استخدام هذا الاختبار لدراسة أمراض الأوعية الدموية الأخرى التي تظهر أيضا الإصابة بالتهاب البيضاء, مثل الأورام الخبيثة 3,17,18,19 وبعض الحالات المعدية والحساسية 20. يمكن تنفيذ هذا البروتوكول في أي مختبر أبحاث أساسي دون الحاجة إلى معدات متخصصة. في الطريقة الملخصة أدناه ، يتم تعثر الأوعية الدموية في البداية بمخزن مؤقت لإزالة الدم ، وبعد ذلك ، يتم نفخ concanavalin A في الأوعية الدموية حيث يرتبط بجميع جدران الخلايا المكشوفة ويسبب تلطيخا ساطعا بشكل خاص للكريات البيض^21،22،23. إذا نجح التروية لإزالة جميع خلايا الدم غير المرتبطة ، فيمكن قياس كمية الكريات البيض المتبقية المصنفة بالفلورسنت والتي ترتبط بالأوعية الدموية يدويا باستخدام أي مجهر مضان في متناول اليد.

تمت مراجعة البروتوكول والموافقة عليه من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامها (IACUC) في جامعة كاليفورنيا إيرفين ويتوافق مع اللوائح الحكومية المتعلقة برعاية واستخدام المختبر. لا توجد نقاط توقف في هذا البروتوكول. متوسط الوقت لكل ماوس هو 30 دقيقة.

1. تحضير مرحلة التروية

1. قم بتسخين كيس المحلول الملحي بنسبة 0.9٪ ومحلول كونكانافالين أ في حمام مائي 37 ^{درجة مئوية}لمدة 20-30 دقيقة قبل الاستخدام.
   ملاحظة: حماية concanavalin A من التعرض للضوء (قم بتغطيتها بورق الألمنيوم).
2. قم بإعداد صينية لاحتواء الدم والسوائل من التساقط على السطح حيث سيتم الإجراء. في الجزء العلوي من الدرج ، ضع وسادة تسخين مغطاة بغطاء سفلي ماص أو أي مادة ماصة.
   ملاحظة: الهدف هو تجنب فقدان جسم الفأر للحرارة أثناء العملية ، لأن التبريد يجعل إزالة الدم أكثر صعوبة أثناء التروية.

2. إعداد مصفاة الضغط

1. قم بتوصيل كيس المحلول الملحي بنسبة 0.9٪ ، ومجموعة القسطرة IV ، ومحبس الصمام ذو 4 اتجاهات ، وإبرة التزقيم.
2. أدخل الكيس الملحي بنسبة 0.9٪ بين الشبكة والمثانة الهوائية لمصفاة الضغط. الكيس الملحي على الخطاف الموجود في الجزء الخلفي من المثانة الهوائية. استخدم حلقة القطب IV لتعليق مصفاة الضغط في عمود IV.
3. قم بتطهير الخطوط والمنافذ من جميع فقاعات الهواء عن طريق ترك النظام يفتح (يعمل) لبضع دقائق واضبط معدل التدفق على 18-20 مل / دقيقة²⁴. لتضخيم المثانة الهوائية لمصفاة الضغط ، أدر مقبض المحبس للإشارة نحو فتحة التثبيت المفتوحة ، ثم قم بضخ لمبة النفخ حتى يشير مقياس الضغط إلى الضغط المطلوب. أعد ضبط الضغط قبل تحريك كل ماوس. لتفريغ الهواء ، أدر مقبض المحبس لأسفل مباشرة باتجاه لمبة النفخ.
   ملاحظة: إذا كان الكيس الملحي 0.9٪ جديدا ، فعادة ما يوفر ضغط 150 مم زئبق معدل التدفق المطلوب ؛ ومع ذلك ، يجب تعديل الضغط تجريبيا بسبب الاختلافات في العلامات التجارية لمصفاة الضغط وعلى مدار فترة استخدام كيس المحلول الملحي بنسبة 0.9٪.
4. قم بتوصيل حقنة سعة 10 مل مملوءة بمحلول كونكانافالين A الدافئ بالصمام رباعي الاتجاهات.
   ملاحظة: حماية المحقنة من التعرض للضوء (قم بتغطيتها بورق الألمنيوم).

3. التخدير

1. تقديم التخدير عن طريق حقن الكيتامين: الزيلازين داخل الصفاق (IP) ؛ الجرعة الأكثر استخداما لجراحة / إجراء الفئران هي 100: 10 مجم / كجم من وزن الجسم²⁵. تقييم التخدير عن طريق منعكس الدواسة (قرصة إصبع القدم الثابتة).
   ملاحظة: توفر هذه الجرعة بداية من 4-6 دقائق مع مدة 45-60 دقيقة من التخدير الجراحي. يمكن تخزين كوكتيل التخدير في درجة حرارة الغرفة لمدة أقصاها أسبوعين.

4. نضح عبر القلب والتلوين مع كونكانافالين أ

1. ضع الفأر على مرحلة التروية في وضع ضعيف للسماح بتعرض تجويف الصدر والبطن.
2. حدد بصريا عملية الخنجري ، ومع وجود الإرقاء في اليد المهيمنة ، قم بتثبيت الجلد وقفله. بمجرد تأمين الإرقاء ، انقله إلى اليد غير المهيمنة وارفع الجلد.
3. استخدم المقص في اليد المهيمنة واقطع ، بزاوية 90 درجة على العمود الفقري ، رقعة من الجلد للكشف عن جدار البطن الخارجي.
4. مع ظهور عملية الخنجري والقفص الصدري الآن ، قم بتشريح جدار البطن بشكل ثنائي ، مع الحرص على تجنب قطع أي أعضاء أو أوعية رئيسية.
5. مع ظهور الحجاب الحاجز الآن ، تخيل بطينات القلب والرئتين من خلال الحجاب الحاجز. باستخدام طرف المقص ، قم بقطع الحجاب الحاجز في أحد الأجنحة ، بالقرب من العمود الفقري ، مع الحرص على تجنب قطع أي أعضاء أو أوعية رئيسية.
   ملاحظة: سيؤدي هذا "الثقب" الموجود في الحجاب الحاجز إلى موازنة الضغط السلبي داخل الصدر مع الضغط الجوي ، وسيحدث استرواح الصدر الذي ينهار الرئتين ويتراجع القلب ، مما يسهل تشريح الحجاب الحاجز دون الإضرار بالرئتين أو القلب.
6. استمر في تشريح الأضلاع وبالتوازي مع الرئتين لإنشاء "سديلة" في الصدر. حرر الإرقاء وقطع عملية الخنجري في المستوى السهمي. افتح عملية الخنجري يدويا برفق. راقب غرف القلب الأربع.
7. باستخدام اليد غير المهيمنة وباستخدام الملقط ، أمسك القلب بالقرب من قمته. باستخدام اليد المهيمنة، أمسك إبرة التزقيم (المتصلة بالقسطرة الوريدية) وثقب قمة القلب. لتجنب الانثقاب الكامل للبطين الأيسر أو الوصول إلى الأوعية الدموية الرئوية ثم ضعف نضح الأوعية الدموية الجهازية ، تحقق من وضع نهاية طرف الكرة لإبرة التزقيم ، والتي يجب أن تكون على حافة موقع البزل بارزة قليلا من القلب. قم بتثبيت إبرة التزقيم في مكانها باستخدام ملقط البعوض المنحني أو ببساطة أمسكها باليد أثناء التلاعب بجهاز التثبيت IV.
8. افتح محبس المحبس على محلول ملحي بنسبة 0.9٪ وفي نفس الوقت تقريبا ، افتح البطين الأيمن بالمقص ؛ perfuse لمدة 2-3 دقائق. خلال وقت التروية ، حرك الإبرة برفق من جانب إلى آخر ولأعلى ولأسفل لتقليل التواء الأوعية الدموية وزيادة خروج الدم من القلب.
9. بعد الترشيح بالمحلول الملحي ، أدر مقبض المحبس لإغلاق التدفق من المحلول الملحي والسماح بالتدفق من المحقنة إلى إبرة التزقيم. Perfuse باليد مع حل concanavalin A بمعدل حالة ثابتة. تأكد من توزيع 10 مل من محلول كونكانافالين أ في 30-35 ثانية.
10. بعد الترشيح باستخدام concanavalin A ، أدر الصمام لإيقاف التدفق من المحقنة والسماح بالتدفق من محلول ملحي بنسبة 0.9٪ إلى إبرة التزقيم مرة أخرى. قم بتسخين المحلول الملحي بنسبة 0.9٪ لمدة 2-3 دقائق إضافية. إزالة إبرة التزقيم من القلب.
    ملاحظة: يتم اقتران كونكانافالين أ المقترح في هذا البروتوكول مع الفلوريسين (الأخضر). ومع ذلك ، يتوفر أيضا كونكانافالين أ المتصل بالفلوروكرومات الأخرى.

5. استئصال وعزل شبكية العين الطازجة

1. أدر الماوس على جانبه ، وباستخدام اليد غير المهيمنة ، ضع السبابة والإبهام على الجفون العلوية والسفلية ، على التوالي. اسحب الجفون والجلد برفق بالأصابع وقم بإخراج العين ، مما يجعلها منتفخة جزئيا خارج التجويف.
2. أثناء تركيب العين ، استخدم مقصا منحنيا في اليد المهيمنة واغرف تحت العين بزاوية 45 درجة. قطع الملحق العضلي والعصب البصري. باستخدام نفس المقص مثل الملعقة ، انقل العين إلى وعاء صغير أو مباشرة إلى مرحلة مجهر التشريح.
   ملاحظة: احرص على عدم قطع الجزء الخلفي من العين وتجنب شد العين أثناء هذه الخطوة.
3. ضع العين على شمع الأسنان لفتح الكرة الأرضية. تحت مجهر التشريح وباستخدام اليد غير المهيمنة ، أمسك الطية الصلبة أو بقايا العضلات التي لا تزال متصلة خارجيا بالعين الخلفية باستخدام ملقط دقيق ، ووجه العين بحيث تواجه القرنية جانبا.
   ملاحظة: لمنع العين من الحركة / الانزلاق أثناء فتح الكرة الأرضية ، يمكن وضع قطعة من المناديل الورقية الخالية من النسالة فوق شمع الأسنان.
4. باستخدام إحدى الزوايا الحادة لشفرة الحلاقة المطلية بالتفلون ، قم بعمل شق 1-2 مم خلف الأطراف وبالتوازي معها (تقاطع القرنية والصلبة). أمسك الطية الصلبة أو العضلة بالملقط الصغير ، وارسم الشفرة عبر الأطراف بأقل قدر من القوة الهابطة. استمر في القص باستخدام ماكينة الحلاقة لفصل الجزء الأمامي تماما (القرنية والقزحية والعدسة والجسم الزجاجي) عن الجزء الخلفي (كوب العين).
   ملاحظة: لا تشاهد ذهابا وإيابا.
5. انقل كوب العين المقسم إلى طبق بتري صغير مع PBS.
   ملاحظة: تجنب ملامسة شبكية العين بالمناديل الورقية (لاحظ في الخطوة 5.3) لأنها ستلتصق بإحكام بالورق ويصبح من المستحيل استردادها.
6. أمسك بطية صلبية أو العضلة المتبقية على السطح الخارجي للصلبة باستخدام ملقط دقيق. افصل شبكية العين تماما عن الصلبة عن طريق كسر جميع الوصلات الموجودة في الطرف حول محيط كوب العين باستخدام ملعقة دقيقة. أخرج شبكية العين من الصلبة باستخدام الملعقة الدقيقة. إذا كانت شبكية العين لا تزال متصلة بالصلبة بواسطة العصب البصري، فقم بتحريك المقص الدقيق بين الشبكية والصلبة لقطع العصب البصري.
7. إزالة أي بقايا من الجسم الزجاجي والعضلات الهدبية في محيط شبكية العين. انقل شبكية العين المعزولة على الفور إلى شريحة مع بعض PBS.
   ملاحظة: يمكن استخدام أي تقنية أخرى لعزل شبكية العين حسب تفضيل الباحث.

6. تركيب مسطح لشبكية العين

1. ضع شبكية العين غير الثابتة على شريحة بكمية صغيرة من PBS. باستخدام الملعقة الدقيقة ، قم بتوجيه شبكية العين برفق مع الجانب الزجاجي لأعلى. إذا كانت شبكية العين مطوية إلى الداخل ، فاستخدم ملقطا دقيقا لتثبيت حواف الشبكية أثناء فتح الشبكية باستخدام الملعقة الدقيقة.
2. قم بعمل 4-5 قطع شعاعية في شبكية العين بحيث تكون مسطحة (نمط أوراق البرسيم).
3. باستخدام منديل خال من النسالة ، جفف فائض PBS بعيدا عن شبكية العين.
   ملاحظة: لا تلمس شبكية العين بالأنسجة. خلاف ذلك ، ستفقد العينة. من المستحسن أن يكون الغطاء مسطحا للحفاظ على شبكية العين مسطحة.

7. الفحص المجهري

ملاحظة: يمكن استخدام أي مجهر مضان مزود بقناة GFP / FITC (480/530 نانومتر) لهذه الخطوة. في هذا العمل ، استخدمنا المجهر المشار إليه مع 488 قناة والبرامج المرتبطة بها للحصول على الصور.

1. راقب شبكية العين المسطحة مؤخرا تحت المجهر بتكبير 100x (هدف 10x) وقم بحساب الكريات البيض المصنفة بالفلورسنت (يدويا) عن طريق المسح المنهجي للأنسجة بأكملها (من اليمين إلى اليسار أو من أعلى إلى أسفل).
   ملاحظة: الكريات البيض هي نقاط فلورية مفردة يمكن أن تعرض شكلا دائريا أو بيضاويا. يبلغ قطرها 12-15 ميكرومتر ولا تبرز من الشعيرات الدموية في الشبكية (الهيكل مقيد تماما بتجويف الوعاء).
2. الحصول على صور تمثيلية بالتكبير المطلوب وإجراء المعالجة اللاحقة للصور باستخدام البرنامج الذي تختاره (على سبيل المثال ، ImageJ [فيجي]).
3. عبر عن العدد على أنه كريات البيض لكل شبكية العين. رسم بياني للبيانات بمتوسط ± الانحراف المعياري.

سيظهر بروتوكول التروية والتلوين الجيد التنفيذ الأوعية الدموية الشبكية الكاملة المحددة باستخدام كونكانافالين أ (الشكل 1). يمنع ضعف نضح الفأر وضع العلامات على شجرة الأوعية الدموية بأكملها والتحليل اللاحق للكريات البيض الملتصقة بالتجويف (الشكل 2) ، في حين أن الضغط المفرط من الضغط السريع للحقنة (أقل من 30-35 ثانية) يمكن أن يسبب نفاذية الأوعية الدموية وانفجار الأوعية الدموية (الشكل 3). يمكن أن يتسبب الكونكانافالين A المتسرب في تسمية خاطئة للهياكل الخارجية مما يؤدي إلى القياس الكمي المربك للكريات البيض الملتصقة.

يجب أن يتم تقييم الأوعية الدموية في الشبكية والقياس الكمي للكريات البيض المرفقة عن طريق الفحص المجهري الفلوري فور تركيب شبكية العين (الشكل 4). يجب على المرء توخي الحذر عند عرض شبكية العين تحت تكبير عال لأن الانحناءات في الشعيرات الدموية يمكن أن تبدو وكأنها كريات البيض الملتصقة بالأوعية الدموية (الشكل 4 ب ، دائرة متقطعة). عادة ما يسمح تركيز المجهر لأعلى ولأسفل أثناء مراقبة المنطقة المعنية بتمايز القرصة البيضاء عن السفينة التي تغوص في شبكية العين. يمكن للمستخدم تغيير / اختيار الفلوروفور المترافق مع كونكانافالين أ الذي يطابق مكعب التألق المتاح في المجهر المراد استخدامه. داء الكريات البيضاء في اعتلال الشبكية السكري ليس حدثا دراماتيكيا ويجب على الباحث تقييم شجرة الأوعية الدموية بأكملها عن طريق مسح شبكية العين بأكملها بحثا عن الكريات البيض الملتصقة. عادة ، هناك 1-3 كريات البيض لكل شبكية العين من غير المصابة بالسكري و 3-12 كريات البيض لكل شبكية للحيوانات المصابة بالسكري ، والحد الأدنى لحجم العينة للوصول إلى فرق ذي دلالة إحصائية هو 10-12 لكل مجموعة (الشكل 4 أ ، ب والشكل 5). بالنظر إلى هذا النمط الظاهري ، من غير المألوف العثور على 2 أو أكثر من الكريات البيض على مقربة (الشكل 4 ب ، ج). لا ينطبق الشيء نفسه على النماذج الحادة للالتهاب مثل تحدي عديدات السكاريد الدهنية (LPS) حيث لوحظت ظاهرة الكريات البيض القوية (الشكل 4C والشكل 5). للحصول على بروتوكول مفصل لنموذج تحدي LPS ، ارجع إلى ²⁶.

الشكل 1: صورة تمثيلية لوعاء شبكية جيد الملطخ والملطخ. صورة واسعة المجال لالأوعية الدموية الشبكية لفأر C57Bl / 6J سليم (4 أشهر من العمر) بعد ضخ كونكانافالين A-FITC. يقوم Concanavalin A-FITC بتلطيخ شبكة الأوعية الدموية الشبكية الكاملة بشكل موحد إذا تم تحقيق التروية المثلى. بعد ضبط السطوع والتباين ، تم تحويل الصورة إلى RGB. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: صورة تمثيلية لضعف التروية وتلوين الأوعية الدموية في الشبكية. قد يؤدي ضعف نضح إلى وصول محدود للكونكانافالين أ إلى أوعية الشبكية مما يؤدي إلى نقص تلطيخ شبكة الأوعية الدموية في الشبكية. ستظهر مناطق واسعة من شبكية العين نقصا في التلوين (مستطيل متقطع) ، مما يحد من تصور الكريات البيض المرتبطة بتلك الأوعية الدموية. قد تظهر الأوعية التي تلقت كونكانافالين أ كريات البيض المرفقة (الأسهم) ، لكنها لا تمثل العدد الإجمالي لشبكية العين. عندما يحدث هذا ، يجب التخلص من العينة. قد يؤدي التحديد الناقص أيضا إلى ثقب اصطناعي (دوائر متقطعة) بسبب الفحص المجهري منخفض الجودة (قناة قسرية لاكتشاف بعض إشارات الفلورسنت). بعد ضبط السطوع والتباين ، تم تحويل الصورة إلى RGB. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: صورة تمثيلية توضح انفجار الشعيرات الدموية في الشبكية. يمكن أن يتسبب الضغط المفرط الناتج عن الضغط السريع لحقنة التحميل A (أقل من 30-35 ثانية) في نفاذية الأوعية الدموية المستحثة تجريبيا وانفجار الأوعية الدموية (الدوائر المتقطعة) مما يؤدي إلى وضع العلامات على الهياكل الخارجية أو القطع الأثرية الأخرى (المربعات المتقطعة). بعد ضبط السطوع والتباين ، تم تحويل الصورة إلى RGB. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: أمثلة على الانحناء الشعري والقرصة البيضاء في الفئران غير المصابة بالسكري والسكري والفئران التي تعاني من LPS. أمثلة على ركن بيضاء الشبكية في فأر C57Bl / 6J (4 أشهر من العمر) بعد تسريب كونكانافالين A-FITC. (أ) لا تظهر الفئران غير المصابة بالسكري الإصابة بالكريات البيض ، ولكن ليس من غير المألوف مواجهة 1-3 كريات البيض المرتبطة بالأوعية الدموية في الشبكية بعد مسح شبكية العين بأكملها (السهم). (ب) قد تتراوح الكريات البيض المرتبطة بالأوعية الدموية الشبكية في الفئران المصابة بالسكري (نموذج الالتهاب تحت الإكلينيكي) من 3 إلى 12 ومن غير المألوف العثور على كريات البيض المرتبطة على مقربة (الأسهم). الهيكل المحاط بدائرة اندفاعة هو مثال على الغوص الشعري المنحني في شبكية العين. (ج) يمكن إجراء تحدي الفئران المصابة ب LPS (نموذج الالتهاب الحاد) مع كل تجربة كتحكم إيجابي في الإصابة بسرطان البيضاء. في هذا النموذج ، من الشائع العثور على العديد من الكريات البيض المرتبطة بالأوعية الدموية على مقربة (الأسهم). بعد ضبط السطوع والتباين ، تم تحويل الصورة إلى RGB. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. اختصار: LPS = عديدات السكاريد الدهونية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: رسم بياني تمثيلي للإبلاغ عن النتائج. يتم التعبير عن عدد الكريات البيض لكل شبكية العين ويتم رسم البيانات بيانيا باستخدام المتوسط والانحراف المعياري. الاختصارات: N = غير مريض بالسكري. د = مرض السكري. LPS = عديدات السكاريد الدهنية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

يشير داء الكريات البيض في البشر إلى الأعراض والنتائج السريرية المرتبطة بفرط الكريات البيضاء (عدد الكريات البيض الكلية (WBCs) >100،000 / ميكرولتر) وهو حالة طبية طارئة²⁰. تخضع الآلية (الآليات) التي تؤدي إلى الإصابة بداء الكريات البيض لأبحاث مكثفة. حتى الآن ، لم تكن دراسة داء الكريات البيض في الجسم الحي ممكنة بعد ويحتاج الباحثون إلى الاعتماد على النماذج الحيوانية لفهم هذه العملية. تظهر الأمراض المختلفة الإصابة بسرطان الدم ، ويمكن أن يكون وجود بروتوكول مفصل لتصور الظاهرة خارج الجسم الحي مفيدا للباحثين في المختبر. تم تحسين البروتوكول المقدم في هذا التقرير لدراسة الأوعية الدموية في الشبكية. ومع ذلك ، يمكن تحسينه تجريبيا لدراسة أسرة الأوعية الدموية المناسبة الأخرى مثل الأوعية الدموية في عضلة Cremaster²⁷.

عند إجراؤها بشكل صحيح ، تسمح هذه التقنية بالتروية ووضع العلامات على شجرة الأوعية الدموية في الشبكية بأكملها ووضع العلامات على الكريات البيض الملتصقة بجدار الأوعية الدموية وقياسها كميا. شبكية العين مناسبة بشكل خاص لهذه الطريقة لأن الأوعية الدموية تقتصر على مستويات محددة في الأنسجة (على عكس معظم الأنسجة حيث تكون الأوعية الدموية أقل تنظيما). تعطي هذه الطريقة تباينا جيدا مع الأنسجة غير الملطخة عند استخدام الأنسجة الشفافة (شبكية العين) أو الأنسجة الرقيقة جدا (مثل عضلة^{الكريماستر 27}). تعتبر الأنسجة السميكة أو الأنسجة التي تحتوي على أعصاب نخاعية وفيرة أو خلايا غير شفافة ومصطبغة مواقع سيئة للتقييم باستخدام هذه الطريقة.

الشرط الحاسم في الإجراء هو التروية الجيدة للأوعية. يسهل النفخ أثناء ضخ القلب التروية الجيدة ووضع العلامات على الأوعية الدموية الدقيقة. غالبا ما يكون ضعف نضح الأوعية الدموية بسبب استخدام السوائل الباردة التي تؤدي إلى تضيق الأوعية الدموية ، أو التواء الأوعية الدموية بسبب وزن ووضع إبرة التروية أو الملقط. أثناء التنشيد ، من المهم إيلاء اهتمام وثيق للأعضاء المختلفة أثناء العملية لأنها يمكن أن توفر بعض الأدلة على كفاءة التروية. على سبيل المثال ، إذا تم إدخال الإبرة في الوريد الرئوي ، فسوف تمتلئ الرئتان ويغيران لونهما (التبييض) فور بدء التدفق ، مما يشير إلى أن التروية ستكون دون المستوى الأمثل بسبب عزل جميع السوائل في الشجرة الرئوية. لوحظ ابيضاض في اللسان, الكلى, والكبد أثناء التروية, مما قد يشير إلى الإجراء الأمثل; ومع ذلك ، فإن هذه الأعضاء هي في اتجاه مجرى الأوعية الدموية التي تغذي العينين ، وبالتالي ، فإن ابيضاض الأعضاء يضمن نضحا جيدا للجسم ولكن ليس دائما لشبكية العين.

المشاكل المحتملة الأخرى التي تم تحديدها والتي تؤثر على التروية هي: أنا) فقاعات الهواء المحاصرة في خط التروية التي تدخل في الأوعية الدقيقة وتمنع التروية بصبغة الفلورسنت. ب) إذا تم تمديد إبرة التزقيم التي يتم إدخالها في القلب بعيدا جدا في قوس الأبهر ، فمن الممكن سد الشريان السباتي الأيمن ، وبالتالي منع تدفق الصبغة إلى شبكية العين اليمنى ؛ و ج) إذا كان التروية قويا جدا ، فإن الزيادة الناتجة في الضغط داخل الأوعية الدموية يمكن أن تؤدي إلى نفاذية الأوعية الدموية المستحثة تجريبيا وقد تتسبب في احتجاز بعض الكريات البيض بشكل مصطنع في الأوعية الدموية الدقيقة. يتم تصور نفاذية الأوعية الدموية المستحثة تجريبيا تحت المجهر على أنها انفجار موضعي من كونكانافالين أ في الأنسجة المحيطة بالوعاء الدموي ، بينما تقدم نفاذية الأوعية الدموية المرضية نمطا منتشرا دقيقا. في السيناريو الأول ، قد يحدث وضع العلامات على الهياكل الخارجية أو القطع الأثرية الأخرى مما قد يؤدي إلى إرباك القياس الكمي للكريات البيض الملتصقة. في هذه الظروف ، يجب على المراقب الاعتماد على المؤشرات الموضوعية التي تحدد الكريات البيض من الناحية النسيجية: الشكل والحجم والتوطين (داخل تجويف السفينة).

الحالات المرضية التي تظهر الشعيرات الدموية اللاخلوية (المتدهورة) مثل اعتلال الشبكية السكري لا تمنع استخدام هذه التقنية. الشعيرات الدموية في المراحل المبكرة من التنكس ، تلك التي فقدت البطانة ولكن الخلايا الجدارية سليمة ، لا تزال حاصلة على براءة اختراع ، في حين أن الشعيرات الدموية في المرحلة المتأخرة من التنكس ، على الرغم من أنها لم تعد حاصلة على براءة اختراع ، إلا أنها تبقى في موقعها الأصلي (التنكس البؤري) ولا لوحظت تغييرات ملحوظة في الأوعية المجاورة ²⁸.  تسمح كلتا الحالتين بوضع العلامات على الأوعية الدموية المحيطة وتقييم داء الكريات البيض.

خطوة حاسمة في عزل شبكية العين هي استئصال العين دون قطع الجزء الخلفي من العين. نظرا لأن العصب البصري يحتوي على الأوعية الدموية الواردة والصادرة التي تعمل على الأوعية الدموية في طبقات الشبكية والخلايا العصبية ، فإن قطع العصب البصري بالقرب من مدخله إلى مقلة العين يضمن تقريبا انهيار شجرة الأوعية الدموية في الشبكية ، مما يؤدي إلى رؤية دون المستوى الأمثل للأوعية الدموية والتحليل اللاحق لظاهرة الكريات البيض. يجب إيلاء اهتمام إضافي لشفرات الحلاقة المستخدمة لإزالة الجزء الأمامي للعين ؛ يجب تغييرها بشكل متكرر (من الناحية المثالية شفرة حلاقة لكل 1-2 عين) لأن الشفرات الباهتة تقطع بشكل سيئ وقد تؤدي إلى شد وشد العين وشبكية العين ، مما يؤدي بدوره إلى إتلاف الأوعية الدموية. عند إزالة الجزء الأمامي من العين ، يقترح تدوير العين أثناء القطع عند الأطراف وإزالة العدسة. تكون الإزالة الأولية للجزء الأمامي من العين أسهل عند إجراؤها على ورق مبلل خال من الوبر. ومع ذلك ، يجب إزالة الورق مباشرة بعد إزالة الجزء الأمامي ، وإلا فقد تلتصق شبكية العين المعزولة حديثا بالورق ولا يمكن استردادها.

نحن نقر بأن هذا البروتوكول له العديد من القيود. أولا ، قد يزيل التروية الأولية الكريات البيض المرتبطة بشكل فضفاض بالأوعية الدموية ، مما يدفع الباحث إلى الإبلاغ عن عدم وجود الكريات البيض في حين أن هذا قد لا يكون هو الحال في الواقع. يمكن أن يساعد تضمين التحكم الإيجابي في داء الكريات البيض ، مثل نموذج حاد للالتهاب²⁶ ، في تحديد أن التروية لم تكن قاسية جدا من خلال إظهار وجود القرصة الجنسية. وثانيا ، سيكون من الصعب على المراقب غير المدرب تحديد ما إذا كان هيكل الفلورسنت القوي هو في الواقع الخلية ذات الأهمية وليس قطعة أثرية. للتغلب على هذه المشكلة ، يجب أن يتعرف الباحث على الشكل (عادة ما يكون مستديرا أو بيضاوي عند التعلق الأولي بالأوعية الدموية) والحجم (12-15 ميكرومتر) للكريات البيض²⁹.  إذا كان هناك شك في أن الهيكل المرصود هو أو ليس كريات البيض ، فمن المستحسن عدم تضمينه في القياس الكمي ، ولكن يجب على الباحث إجراء المكالمة النهائية بمجرد أن يصبح أكثر دراية بالفحص. من الناحية المثالية ، يمكن أن يسهل القياس الكمي التلقائي باستخدام برنامج معين القياس الكمي اليدوي كثيف العمالة للكريات البيض المرتبطة بالأوعية الدموية ، ومع ذلك ، حتى نعرف ، لا يمكن التمييز بين الكريات البيض والتحف إلا من خلال معرفة وخبرة الباحث. يعد تطوير أو تحسين المنصات الحالية لتحديد كمية كثرة الكريات البيضاء بطريقة تلقائية أو شبه آلية خيارا يجب استكشافه.

في الختام ، قد يكون هذا البروتوكول الذي تم التحقق من صحته لتقييم داء الكريات البيض أداة مفيدة للباحثين الذين يجرون دراسات حول اعتلال الشبكية السكري وأمراض الأوعية الدموية العينية وغير المعينة الأخرى ولاختبار التدخلات العلاجية الجديدة.

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

تم دعم هذا العمل من قبل منح المعاهد الوطنية للصحة (NIH) R01EY022938 و R01EY022938-S1 و K99EY034928. يقر المؤلفون بخدمات مركز أبحاث العلوم البصرية CWRU (P30EY11373) و UCI (P30EY034070) ، بالإضافة إلى دعم الإدارات من منحة غير مقيدة من Research to Prevention Blindness لمعهد Gavin Herbert Eye Institute في جامعة كاليفورنيا إيرفين.