Laboratuvarımız, hangi koşulların belirli aşağı akış olaylarını tetiklediğini anlamak için döngüsel AMP'nin uzamsal ve zamansal düzenlemesini araştırır. Siklik AMP sinyalinin hücre altı aktivasyonunu ve inhibisyonunu etkili bir şekilde taklit etmek için, bPAC-nanolusiferaz adı verilen bir optogenetik aracın dağılımını karakterize ediyoruz. Mevcut döngüsel AMP sinyal modellerinin geçerliliğini test etmek için, canlı hücrelerdeki hücre altı bölmelerden döngüsel AMP sinyalini değerlendirmek, taklit etmek ve engellemek için araçlar geliştirdik.
Bu protokol, optogenetik araçların dağılımını ve işlevini sistematik bir şekilde uyarmak ve değerlendirmek için kullanılabilir. Amacımız, odak ışığı işleminin belirli hücre bölgelerindeki optogenetik proteinleri tam olarak aktive edip edemeyeceğini test etmek ve böylece çevredeki proteinler üzerindeki etkiyi önlemekti. Bu yöntem, dağınık dağılımlara sahip proteinleri incelemek için veya amaçlanan etkinin döngüsel AMP veya diğer sinyal moleküllerinde lokalize artışlar oluşturmak olması durumunda hayati önem taşıyacaktır.
Optogenetik deneylerde, tipik yaklaşım, ya tüm bir hücre alanını ya da bazen daha küçük belirlenmiş alanları uyarmayı içerir. Bununla birlikte, bu alanın ve yoğunluğun seçimi genellikle keyfidir. Sistematik yaklaşımımız, araştırmacıların daha doğru deneyler yapmalarını sağlayarak sinyal yollarının modellerini taklit etmeye yardımcı olur.
Bu çalışma için, nükleer hedefli bir döngüsel AMP sensörü ve optogenetik nükleer hedefli bir protein olan NLS-bPAC-nanolusiferaz ile birlikte transfekte edilmiş hücreleri kullanın. Karanlık bir ortamda nükleer bPAC'ı ifade eden hücreleri kültürleyin ve manipüle edin. 500 nanometreden daha düşük dalga boylarına maruz kalmamak için kırmızı bir güvenlik lambası kullanın.
Görüntüleme deneylerini, çok LED'li ışık motoru, emisyon filtre çarkı, motorlu XY aşaması, ORCA-Fusion Dijital CMOS kamera ve 1,4 sayısal açıklığa sahip 100x büyütmeli yağ objektifi ile donatılmış motorlu iki katlı bir mikroskopta gerçekleştirin. Görüntüleri yakalamak için dijital mikroskopi yazılımı kullanın. Bu kurulum, bir ZT458rdc dikroik filtre ile donatılmış bağımsız bir ışık yolu kullanarak hücreleri uyarabilir ve FRET ölçümlerini aynı anda gerçekleştirebilir.
UGA-42 Geosystem ve LDI-7 lazerlerini açtıktan sonra, H208 FRET sensörü ile veri almak için uygun şekilde ayarlamak üzere mikroskobu açın. Ardından, görüntüleme yazılımını ve mikroskobu kontrol eden SysCon yazılımını sırayla açın. Her kullanımdan önce sistemi kalibre etmek için Kamera penceresine gidin ve Kalibrasyon sekmesini seçin.
Optogenetik protein ile uyumlu lazer dalga boyunu ayarlayın. bPAC-nanolusiferazı uyarmak için 445 nanometre seçin. Kamera sekmesini seçin ve görüntüleme yazılımından alma işlemini başlatmak için Alımı Başlat'a tıklayın.
Kalibrasyon sekmesini tekrar seçin. Kalibrasyonu Başlat düğmesine tıklayın. Görüntülenen açılır listede, uygun kalibrasyon modunu seçin.
Üretici tarafından belirtilen kalibrasyon adımlarını izleyin. Gerekirse, uygun kalibrasyonu gerçekleştirmek için görüntüleme yazılımı ayarlarını değiştirin. Kalibrasyonu numunenin hücresiz bir alanında gerçekleştirdiğinizden emin olun.
Ardından, görüntüleme yazılımını kullanarak bir floresan görüntüsü elde edin. Floresan hücreler Image Viewer (Görüntü Görüntüleyici) penceresinde görünecektir. Mikroskop kontrolleri XY kullanılarak uyarılacak hücreyi etki alanı içinde, tercihen merkezinde konumlandırın.
Gerçek deneye başlamadan önce, tek bir hücrenin yanıt verme hızını hızlı bir şekilde değerlendirmek için Tıkla ve Çalıştır Modunu kullanın. Zaman Çizelgesi penceresinde, uyaranın ışık kaynağı, süresi ve yoğunluğu dahil olmak üzere hücre stimülasyon parametrelerini ayarlayın. Görüntü Görüntüleyici penceresinde, yaklaşık olarak hücrenin ortasına tıklayın ve yanıtı değerlendirin.
Görüntü Görüntüleyici penceresinde, soldaki araç çubuğunda bulunan yuvarlak simgeyi seçin ve açılır menüde, doldurulmuş dairesel stimülasyon nesneleri çizmek için Doldurulmuş'a tıklayın. Birden fazla özdeş daire oluşturmak ve bunları eşit olarak dağıtmak için bu adımı tekrarlayın, böylece uyarılacak hücrenin tüm sitoplazmasının homojen bir şekilde kaplanmasını sağlayın. Görüntü Görüntüleyici penceresinde, soldaki fare işaretçisi simgesini tıklatın ve ardından özelliklerini denetlemek ve düzenlemek için stimülasyon nesnelerinden birini sağ tıklatın.
Alternatif olarak, çizilen tüm stimülasyon nesnelerini seçin ve ardından seçilen tüm stimülasyon nesnelerinin özelliklerini birlikte düzenlemek için sağ tıklayın. Görünüm alt penceresinde, Kılavuza Yapış düğmesine tıklayın. Bu ızgara, uygun bir matris veya dizi oluşturmak için dairelerin eşit aralığını ve hizalamasını korumaya yardımcı olabilir.
Ek olarak, Izgarayı Ayarla düğmesiyle ızgaranın özelliklerini özelleştirin. Izgara yardımıyla stimülasyon nesnelerini eşit olarak dağıtın. Tüm hücreyi kaplamak için gerekirse daha fazla stimülasyon nesnesi ekleyin.
Hepsinin aynı özelliklere sahip olduğundan emin olun. Daha önce Görüntü Görüntüleyici penceresinde oluşturulan her stimülasyon nesnesi, başlangıç zamanı, süre, gecikme, yoğunluk ve daha fazlası dahil olmak üzere farklı bir özellik kümesinin düzenlenebileceği Zaman Çizelgesi penceresinde bulunur. Stimülasyon nesnelerini düzgün bir şekilde görselleştirmek için önce Zaman Çizelgesi penceresini genişletin.
Artık, Zaman Çizelgesi penceresinde stimülasyon nesnelerinin zamansal özelliklerini görebilirsiniz. Tüm stimülasyon nesnelerini seçin ve Nesne Zamanlaması alt penceresinde gecikmelerini ve sürelerini düzenleyin. Işık Kaynağı alt penceresinde, nesne dalga boylarını ve yoğunluklarını yapılandırın.
Herkes için aynı dalga boyunu ve yoğunluğu sağlayın. İki veya daha fazla stimülasyonun etkisinin aşırı uygulanmasını önlemek için, her nesne için farklı başlangıç zamanları ayarlayın veya beklenen sonuca bağlı olarak aralarındaki gecikmeyi değiştirin. Ardından, Zaman Çizelgesi penceresinde, gerekirse her bir stimülasyon nesnesinin etkinleştirileceği sırayı değiştirin.
Deneye bağlı olarak stimülasyon sırasını düzenli veya rastgele bir düzende yapılandırın. Diziyi sisteme yükledikten sonra, Sıra alt penceresinde sistemin gerçekleştireceği dizi döngülerinin veya çalıştırmaların sayısını yapılandırın. Uyarılan hücrenin floresan değişikliklerini ölçmek için, görüntüleme yazılımındaki ilgili bölgeleri istenen konumlara yerleştirin.
Floresan görüntüleri almaya başlayın. Son olarak, hücreleri uyarmaya başlamak için UGA-42 penceresinde Oynat'a basın. Kamera tarafından da yakalanabilen gerçek stimülasyon ışınlarını ve bunların stimülasyon nesneleriyle korelasyonunu gözlemleyin.
Yalnızca sensör tarafından ölçülen döngüsel AMP konsantrasyonundaki artışı gösteren yeşil izin yoğunluğundaki değişikliğe dikkat edin. Bu, özellikle ışın minimum miktarda bPAC-nanolusiferaz ile hücrenin bir kısmına ulaştığında meydana gelir. Çekirdeğin konumunu belirlemek için H208'in YFP floresansı kullanıldı.
Belirtilen mavi noktalardaki stimülasyon nedeniyle H208 sensörünün FRET oranındaki değişiklikleri ölçmek için tüm çekirdeği kapsayan bir ilgi alanı kullanıldı. Bu, döngüsel AMP'deki geçici artışların yalnızca mavi ışık bPAC-nanolusiferaz içeren alanlara yönlendirildiğinde meydana geldiğini ortaya koydu. Bu, nükleer hedefli bPAC-nanolusiferazın yalnızca HC-1 hücrelerinin nükleer bölmesinde eksprese edildiğini doğruladı.
