Nosso laboratório investiga a regulação espacial e temporal do AMP cíclico para entender quais condições desencadeiam eventos específicos a jusante. Para imitar efetivamente a ativação subcelular e a inibição da sinalização de AMP cíclico, caracterizamos a distribuição de uma ferramenta optogenética chamada bPAC-nanoluciferase. Para testar a validade dos modelos atuais de sinalização de AMP cíclico, desenvolvemos ferramentas para avaliar, imitar e bloquear a sinalização de AMP cíclico de compartimentos subcelulares em células vivas.
Este protocolo pode ser usado para estimular e avaliar a distribuição e função de ferramentas optogenéticas de maneira sistemática. Bem, nosso objetivo era testar se o processo de luz de foco pode ativar com precisão proteínas optogenéticas em zonas celulares específicas, evitando assim o impacto nas proteínas circundantes. Este método será vital para estudar proteínas com distribuições difusas ou se o efeito pretendido for gerar aumentos localizados no AMP cíclico ou outras moléculas de sinalização.
Em experimentos optogenéticos, a abordagem típica envolve estimular um campo inteiro de células ou, às vezes, áreas designadas menores. No entanto, a seleção dessa área e intensidade é muitas vezes arbitrária. Nossa abordagem sistemática permite que os investigadores conduzam experimentos mais precisos, ajudando a imitar padrões de vias de sinalização.
Para este estudo, use células co-transfectadas com um sensor AMP cíclico direcionado ao nuclear e uma proteína optogenética direcionada ao nuclear, NLS-bPAC-nanoluciferase. Cultive e manipule as células que expressam o bPAC nuclear em um ambiente escuro. Use uma lâmpada vermelha de luz de segurança para evitar a exposição a comprimentos de onda inferiores a 500 nanômetros.
Realize os experimentos de imagem em um microscópio motorizado de dois decks equipado com um mecanismo de luz multi-LED, uma roda de filtro de emissão, platina XY motorizada, uma câmera CMOS digital ORCA-Fusion e uma objetiva de óleo com ampliação de 100x com abertura numérica de 1,4. Para capturar imagens, use um software de microscopia digital. Esta configuração é capaz de estimular células e realizar medições de FRET simultaneamente usando um caminho de luz independente equipado com um filtro dicróico ZT458rdc.
Depois de ligar o geossistema UGA-42 e os lasers LDI-7, ligue o microscópio para configurá-lo adequadamente para adquirir dados com o sensor H208 FRET. Em seguida, abra sequencialmente o software de imagem e o software SysCon que controla o microscópio. Para calibrar o sistema antes de cada uso, navegue até a janela Câmera e selecione a guia Calibração.
Defina o comprimento de onda do laser compatível com a proteína optogenética. Escolha 445 nanômetros para estimular a bPAC-nanoluciferase. Selecione a guia Câmera e clique em Iniciar aquisição para iniciar a aquisição a partir do software de imagem.
Selecione a guia Calibração novamente. Clique no botão Iniciar calibração. Na lista suspensa exibida, selecione o modo de calibração adequado.
Siga as etapas de calibração indicadas pelo fabricante. Se necessário, altere as configurações do software de imagem para realizar a calibração adequada. Certifique-se de realizar a calibração em uma área livre de células da amostra.
Em seguida, usando o software de imagem, adquira uma imagem de fluorescência. As células fluorescentes aparecerão na janela do Visualizador de imagens. Posicione a célula que será estimulada usando os controles do microscópio XY dentro da área de influência, de preferência em seu centro.
Antes de iniciar o experimento real, use o modo Clique e dispare para avaliar rapidamente a capacidade de resposta de uma célula individual. Na janela Linha do tempo, ajuste os parâmetros de estimulação celular, incluindo a fonte de luz, a duração e a intensidade do estímulo. Na janela Visualizador de imagens, clique aproximadamente no centro da célula e avalie a resposta.
Na janela Visualizador de imagens, selecione o ícone redondo na barra de ferramentas à esquerda e, no menu suspenso, clique em Preenchido para desenhar objetos de estimulação circular preenchidos. Repita esta etapa para criar vários círculos idênticos e distribuí-los uniformemente, garantindo uma cobertura homogênea de todo o citoplasma da célula a ser estimulada. Na janela Visualizador de imagens, clique no ícone do ponteiro do mouse à esquerda e, em seguida, clique com o botão direito do mouse em um dos objetos de estimulação para verificar e editar suas propriedades.
Como alternativa, selecione todos os objetos de estimulação desenhados e, em seguida, clique com o botão direito do mouse para editar as propriedades de todos os objetos de estimulação selecionados juntos. Na subjanela Exibir, clique no botão Ajustar à Grade. Essa grade pode ajudar a manter o espaçamento e o alinhamento uniformes dos círculos para formar uma matriz ou matriz adequada.
Além disso, personalize as propriedades da grade com o botão Definir grade. Distribua os objetos de estimulação uniformemente com a ajuda da grade. Adicione mais objetos de estimulação, se necessário, para cobrir toda a célula.
Certifique-se de que todos tenham as mesmas propriedades. Cada objeto de estimulação criado anteriormente na janela Visualizador de imagens estará presente na janela Linha do tempo, onde é possível editar um conjunto diferente de propriedades, incluindo hora de início, duração, atraso, intensidade e muito mais. Para visualizar corretamente os objetos de estimulação, primeiro expanda a janela Linha do tempo.
Agora, pode-se ver as propriedades temporais dos objetos de estimulação na janela Linha do tempo. Selecione todos os objetos de estimulação e edite seu atraso e duração na subjanela Tempo do objeto. Na subjanela Fonte de luz, configure os comprimentos de onda e intensidades do objeto.
Garanta comprimento de onda e intensidade idênticos para todos. Para evitar a sobreposição do efeito de dois ou mais estímulos, defina horários de início diferentes para cada objeto ou varie o atraso entre eles, dependendo do resultado esperado. Em seguida, na janela Linha do tempo, altere a sequência na qual cada objeto de estimulação será ativado, se necessário.
Configure a sequência de estímulos em um padrão regular ou aleatório, dependendo do experimento. Depois de carregar a sequência no sistema, configure o número de ciclos ou execuções de sequência que o sistema executará na subjanela Sequência. Para medir as mudanças de fluorescência da célula estimulada, coloque as regiões de interesse no software de imagem nas posições desejadas.
Comece a adquirir imagens de fluorescência. Por fim, pressione Play na janela UGA-42 para começar a estimular as células. Observe os feixes de estimulação reais que também podem ser capturados pela câmera e sua correlação com os objetos de estimulação.
Observe apenas a mudança na intensidade do traço verde, que mostra o aumento na concentração de AMP cíclico medida pelo sensor. Isso ocorre especificamente quando o feixe atinge uma parte da célula com a quantidade mínima de bPAC-nanoluciferase. A fluorescência YFP de H208 foi usada para determinar a posição do núcleo.
Uma região de interesse cobrindo todo o núcleo foi usada para medir as mudanças na razão FRET do sensor H208 devido à estimulação nos pontos azuis indicados. Isso revelou que aumentos transitórios no AMP cíclico ocorreram apenas quando a luz azul foi direcionada para áreas contendo a bPAC-nanoluciferase. Isso confirmou que a bPAC-nanoluciferase direcionada ao núcleo foi expressa exclusivamente no compartimento nuclear das células HC-1.
