Notre laboratoire étudie la régulation spatiale et temporelle de l’AMP cyclique pour comprendre quelles conditions déclenchent des événements spécifiques en aval. Pour imiter efficacement l’activation subcellulaire et l’inhibition de la signalisation AMP cyclique, nous caractérisons la distribution d’un outil optogénétique appelé bPAC-nanoluciférase. Pour tester la validité des modèles actuels de signalisation AMP cyclique, nous avons développé des outils pour évaluer, imiter et bloquer la signalisation AMP cyclique à partir de compartiments subcellulaires dans des cellules vivantes.
Ce protocole peut être utilisé pour stimuler et évaluer la distribution et la fonction des outils optogénétiques de manière systématique. Eh bien, notre objectif était de tester si le processus de lumière focale peut activer avec précision des protéines optogénétiques dans des zones cellulaires spécifiques, évitant ainsi l’impact sur les protéines environnantes. Cette méthode sera essentielle pour étudier les protéines à distributions diffuses ou si l’effet recherché est de générer des augmentations localisées de l’AMP cyclique ou d’autres molécules de signalisation.
Dans les expériences optogénétiques, l’approche typique consiste à stimuler soit un champ entier de cellules, soit parfois des zones désignées plus petites. Cependant, le choix de cette zone et de cette intensité est souvent arbitraire. Notre approche systématique permet aux chercheurs de mener des expériences plus précises, aidant à imiter les modèles de voies de signalisation.
Pour cette étude, utilisez des cellules co-transfectées avec un capteur AMP cyclique à cible nucléaire et une protéine optogénétique ciblée nucléaire, NLS-bPAC-nanoluciférase. Cultiver et manipuler les cellules exprimant le bPAC nucléaire dans un environnement sombre. Utilisez une lampe rouge pour éviter l’exposition à des longueurs d’onde inférieures à 500 nanomètres.
Réalisez les expériences d’imagerie dans un microscope motorisé à deux étages équipé d’un moteur de lumière multi-LED, d’une roue à filtres d’émission, d’une platine XY motorisée, d’une caméra CMOS numérique ORCA-Fusion et d’un objectif à huile de grossissement 100x avec une ouverture numérique de 1,4. Pour capturer des images, utilisez un logiciel de microscopie numérique. Cette configuration est capable de stimuler les cellules et d’effectuer des mesures FRET simultanément en utilisant un trajet lumineux indépendant équipé d’un filtre dichroïque ZT458rdc.
Après avoir allumé le géosystème UGA-42 et les lasers LDI-7, allumez le microscope pour le configurer de manière appropriée pour l’acquisition de données avec le capteur FRET H208. Ensuite, ouvrez séquentiellement le logiciel d’imagerie et le logiciel SysCon qui contrôle le microscope. Pour calibrer le système avant chaque utilisation, accédez à la fenêtre Appareil photo et sélectionnez l’onglet Étalonnage.
Réglez la longueur d’onde du laser compatible avec la protéine optogénétique. Choisissez 445 nanomètres pour stimuler la bPAC-nanoluciférase. Sélectionnez l’onglet Appareil photo et cliquez sur Démarrer l’acquisition pour commencer l’acquisition à partir du logiciel d’imagerie.
Sélectionnez à nouveau l’onglet Calibrage. Cliquez sur le bouton Démarrer l’étalonnage. Dans la liste déroulante qui s’affiche, sélectionnez le mode d’étalonnage approprié.
Suivez les étapes d’étalonnage indiquées par le fabricant. Si nécessaire, modifiez les paramètres du logiciel d’imagerie pour effectuer un étalonnage correct. Assurez-vous d’effectuer l’étalonnage sur une zone exempte de cellules de l’échantillon.
Ensuite, à l’aide du logiciel d’imagerie, acquérez une image de fluorescence. Les cellules fluorescentes apparaîtront dans la fenêtre du visualiseur d’images. Positionnez la cellule qui sera stimulée à l’aide des commandes du microscope XY dans la zone d’influence, de préférence en son centre.
Avant de commencer l’expérience proprement dite, utilisez le mode Click-And-Fire pour évaluer rapidement la réactivité d’une cellule individuelle. Dans la fenêtre Chronologie, ajustez les paramètres de stimulation des cellules, notamment la source lumineuse, la durée et l’intensité du stimulus. Dans la fenêtre du visualiseur d’images, cliquez approximativement au centre de la cellule et évaluez la réponse.
Dans la fenêtre de la visionneuse d’images, sélectionnez l’icône ronde dans la barre d’outils de gauche, et dans le menu déroulant, cliquez sur Rempli pour dessiner des objets de stimulation circulaires remplis. Répétez cette étape pour créer plusieurs cercles identiques et les répartir uniformément, en assurant une couverture homogène de l’ensemble du cytoplasme de la cellule à stimuler. Dans la fenêtre du visualiseur d’images, cliquez sur l’icône du pointeur de la souris sur la gauche, puis cliquez avec le bouton droit sur l’un des objets de stimulation pour vérifier et modifier ses propriétés.
Vous pouvez également sélectionner tous les objets de stimulation dessinés, puis cliquer avec le bouton droit de la souris pour modifier les propriétés de tous les objets de stimulation sélectionnés. Dans la sous-fenêtre Affichage, cliquez sur le bouton Aligner sur la grille. Cette grille peut aider à maintenir un espacement et un alignement uniformes des cercles pour former une matrice ou un réseau approprié.
De plus, personnalisez les propriétés de la grille à l’aide du bouton Définir la grille. Répartissez uniformément les objets de stimulation à l’aide de la grille. Ajoutez plus d’objets de stimulation si nécessaire pour couvrir toute la cellule.
Assurez-vous qu’ils ont tous les mêmes propriétés. Chaque objet de stimulation précédemment créé dans la fenêtre du visualiseur d’images sera présent dans la fenêtre Chronologie, où l’on peut modifier un ensemble différent de propriétés, notamment l’heure de début, la durée, le délai, l’intensité, etc. Pour visualiser correctement les objets de stimulation, développez d’abord la fenêtre Chronologie.
Maintenant, on peut voir les propriétés temporelles des objets de stimulation dans la fenêtre Chronologie. Sélectionnez tous les objets de stimulation et modifiez leur retard et leur durée dans la sous-fenêtre Synchronisation des objets. Dans la sous-fenêtre Source de lumière, configurez les longueurs d’onde et les intensités des objets.
Assurer une longueur d’onde et une intensité identiques pour tous. Pour éviter de super-imposer l’effet de deux stimulations ou plus, définissez des heures de début différentes pour chaque objet ou variez le délai entre eux en fonction du résultat attendu. Ensuite, dans la fenêtre Chronologie, modifiez l’ordre dans lequel chaque objet de stimulation sera activé si nécessaire.
Configurez la séquence de stimulations selon un schéma régulier ou aléatoire en fonction de l’expérience. Après avoir téléchargé la séquence sur le système, configurez le nombre de cycles ou d’exécutions de séquence que le système effectuera dans la sous-fenêtre Séquence. Pour mesurer les changements de fluorescence de la cellule stimulée, placez les régions d’intérêt dans le logiciel d’imagerie aux positions souhaitées.
Commencez à acquérir des images de fluorescence. Enfin, appuyez sur Play dans la fenêtre UGA-42 pour commencer à stimuler les cellules. Observez les faisceaux de stimulation réels qui peuvent également être capturés par la caméra et leur corrélation avec les objets de stimulation.
Notez le changement d’intensité de la trace verte uniquement, qui montre l’augmentation de la concentration cyclique de l’AMP mesurée par le capteur. Cela se produit spécifiquement lorsque le faisceau atteint une partie de la cellule avec la quantité minimale de bPAC-nanoluciférase. La fluorescence YFP de H208 a été utilisée pour déterminer la position du noyau.
Une région d’intérêt couvrant l’ensemble du noyau a été utilisée pour mesurer les changements dans le rapport FRET du capteur H208 dus à la stimulation aux points bleus indiqués. Cela a révélé que les augmentations transitoires de l’AMP cyclique ne se produisaient que lorsque la lumière bleue était dirigée vers des zones contenant la bPAC-nanoluciférase. Cela a confirmé que la bPAC-nanoluciférase ciblée sur le nucléaire était exprimée exclusivement dans le compartiment nucléaire des cellules HC-1.
