我们的实验室研究了环状 AMP 的空间和时间调控，以了解哪些条件触发了特定的下游事件。为了有效地模拟亚细胞激活和抑制环 AMP 信号传导，我们表征了一种称为 bPAC-纳米荧光素酶的光遗传学工具的分布。为了测试当前环状 AMP 信号转导模型的有效性，我们开发了工具来评估、模拟和阻断来自活细胞亚细胞区室的环状 AMP 信号转导。
该协议可用于系统地刺激和评估光遗传学工具的分布和功能。嗯，我们的目标是测试聚焦光过程是否可以精确激活特定细胞区的光遗传学蛋白质，从而避免对周围蛋白质的影响。这种方法对于研究具有弥散分布的蛋白质或预期效果是在环 AMP 或其他信号分子中产生局部增加至关重要。
在光遗传学实验中，典型的方法包括刺激整个细胞区域或有时更小的指定区域。然而，这个区域和强度的选择通常是任意的。我们的系统方法使研究人员能够进行更准确的实验，帮助模拟信号通路的模式。
在本研究中，使用与核靶向环 AMP 传感器和光遗传学核靶向蛋白 NLS-bPAC-纳米荧光素酶共转染的细胞。在黑暗环境中培养和作表达核 bPAC 的细胞。使用红色安全灯，避免暴露在小于 500 纳米的波长下。
在配备多 LED 光引擎、发射滤光片轮、电动 XY 载物台、ORCA-Fusion 数字 CMOS 相机和具有 1.4 数值孔径的 100 倍放大油物镜的电动双层显微镜中进行成像实验。要捕获图像，请使用数字显微镜软件。该设置能够使用配备 ZT458rdc 二向色滤光片的独立光路刺激细胞并同时进行 FRET 测量。
打开 UGA-42 Geosystem 和 LDI-7 激光器后，打开显微镜以对其进行适当设置，以便使用 H208 FRET 传感器采集数据。然后，依次打开成像软件和控制显微镜的 SysCon 软件。要在每次使用前校准系统，请导航到 Camera （摄像机） 窗口并选择 Calibration （校准） 选项卡。
设置与光遗传学蛋白兼容的激光波长。选择 445 纳米来刺激 bPAC-纳米荧光素酶。选择 Camera 选项卡，然后单击 Start Acquisition 开始从成像软件进行采集。
再次选择 Calibration 选项卡。单击 Start Calibration 按钮。在显示的下拉列表中，选择适当的校准模式。
按照制造商指示的校准步骤进行作。如果需要，请更改成像软件设置以执行正确的校准。确保在样品的无细胞区域进行校准。
接下来，使用成像软件获取一张荧光图像。荧光细胞将显示在 Image Viewer 窗口中。将要使用显微镜控制 XY 刺激的细胞定位在影响区域内，最好位于其中心。
在开始实际实验之前，请使用 Click-And-Fire 模式快速评估单个单元的响应能力。在 Timeline （时间轴） 窗口中，调整细胞刺激参数，包括刺激的光源、持续时间和强度。在 Image Viewer 窗口中，单击单元格的大约中心并评估响应。
在 Image Viewer 窗口中，选择左侧工具栏中的圆形图标，然后在下拉菜单中单击 Filled 以绘制填充的圆形刺激对象。重复此步骤以创建多个相同的圆圈并均匀分布它们，确保均匀覆盖要刺激的细胞的整个细胞质。在 Image Viewer 窗口中，单击左侧的鼠标指针图标，然后右键单击其中一个刺激对象以检查和编辑其属性。
或者，选择绘制的所有刺激对象，然后右键单击以一起编辑所有选定刺激对象的属性。在 View 子窗口中，单击 Snap to Grid 按钮。这个网格可以帮助保持圆圈的均匀间距和对齐方式，以形成适当的矩阵或数组。
此外，使用 Set Grid （设置网格） 按钮自定义网格的属性。在网格的帮助下均匀分布刺激对象。如有必要，添加更多刺激对象以覆盖整个细胞。
确保所有 Pod 具有相同的属性。之前在 Image Viewer 窗口中创建的每个刺激对象都将出现在 Timeline 窗口中，您可以在其中编辑一组不同的属性，包括开始时间、持续时间、延迟、强度等。要正确可视化刺激对象，请首先展开 Timeline （时间轴） 窗口。
现在，您可以在 Timeline （时间轴） 窗口中查看刺激对象的临时属性。选择所有刺激对象，并在 Object Timing 子窗口中编辑它们的延迟和持续时间。在 Lightsource 子窗口中，配置对象波长和强度。
确保所有波长和强度相同。为防止 super 施加两个或多个刺激的效果，请为每个对象设置不同的开始时间，或者根据预期结果改变它们之间的延迟。接下来，在 Timeline （时间轴） 窗口中，根据需要更改每个刺激对象的激活顺序。
根据实验以常规或随机模式配置刺激序列。将序列上传到系统后，在 Sequence 子窗口中配置系统将执行的序列周期数或运行数。为了测量受刺激细胞的荧光变化，请将成像软件中感兴趣的区域放在所需位置。
开始采集荧光图像。最后，在 UGA-42 窗口按 Play 开始刺激细胞。观察相机也可以捕获的实际刺激光束及其与刺激对象的相关性。
仅注意绿色迹线的强度变化，它显示了传感器测得的环状 AMP 浓度的增加。当光束以最少量的 bPAC-纳米荧光素酶到达细胞的一部分时，尤其会发生这种情况。H208 的 YFP 荧光用于确定细胞核的位置。
覆盖整个细胞核的感兴趣区域用于测量由于在指示的蓝色点受到刺激而导致的 H208 传感器 FRET 比率的变化。这表明，只有当蓝光对准含有 bPAC-纳米荧光素酶的区域时，才会发生环状 AMP 的瞬时增加。这证实了核靶向 bPAC-纳米荧光素酶仅在 HC-1 细胞的核区室中表达。
