Name: identifying protein-protein interaction sites using peptide arrays
Uploaded: 2014-11-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays at JoVE.com

AF Avrupa Topluluğu Yedinci Çerçeve Programı kapsamında Avrupa Araştırma Konseyi bir başlangıç ​​hibe ile desteklenmiştir (FP7 / 2007-2013) / ERC Hibe sözleşmesi n 203.413 ° ve karmaşık systems.HA Bio-hibrid ve AI için Minerva Merkezi tarafından desteklenen Kudüs İbrani Üniversitesi&#39;nde ileri derecesi olan öğrenciler için Dalia ve Dan Maydan Kardeşliği tarafından.

1. Peptid dizisi Tasarımı <ol><li> Kısmen, 10-20 kalıntıları çakışan peptidler halinde hedef proteinin dizisini bölün. Belirli bir deney üzerinde örtüşme miktarı ve performans laboratuar kaynakları, ancak ilke olarak uzun örtüşme iyi Vary. Peptidler etkileşiminden sorumlu olabilir protein hesap bilinen ikincil yapı elemanları içine alır tasarımı. </li><li> Ticari satıcıları aracılığıyla tasarlanmış peptid dizisi sipariş. Burada kullanımı peptidler kovalent olarak C-terminali dizi haline bağlandı. </li></ol> Cilt 2. Engelleme Non-spesifik <ol><li> % 0.05 Tween 20 (TBST / PBST) içeren bir 50 mM Tris veya fosfat tampon çözeltisi oluşturunuz ve (tam iyonik kuvvet öğrenmek amacıyla) HCI veya NaOH, ölçülü bir miktarı ve NaCl ile arzu edilen iyonik gücü ile istenen pH değerine ayarlamak . Burada, 7.5 bir pH değerine ve 150 mM arasında bir iyonik gücünü kullanır. </li><li> Bir bloke edici çözelti yapmak% 2.5 (ağırlık / hacim) TBST / PBST içinde yağsız süt tozu. </li><li> Spesifik olmayan bağlanma, önlemek için, bloke etme çözeltisi 5 ml dizi bırakın. 2-4 saat oda sıcaklığında karıştırıldı ve gece boyunca bir çalkalayıcı üzerinde 4 ° C&#39;de için dizi inkübe edin. </li></ol> 3. protein ile kuluçkalanarak <ol><li> Oda sıcaklığında, bir çalkalayıcı üzerinde 5 dakika boyunca 5 ml TBST&#39;ye / PBST ile iki kez, daha sonra 30 saniye için çözüm engelleme ve 5 ml ilk dizi yıkayın. </li><li> (Ağırlık / hacim), spesifik olmayan bağlanmayı önlemek için kaymağı alınmış süt tozu% 2.5 ihtiva eden His-takılı protein çözeltisinin 5 ml&#39;si ile yıkanmıştır dizi inkübe edin. Burada tarif edilen bloke çözeltisi içinde çözülmüş protein çözeltisinin 4.5 uM (Stil 500-650) kullanın. Not: Genellikle 5-10 uM proteininin taranması için kullanılır, ancak protein konsantrasyonu, bağlama eğilimi ve yerel dizi bağlanmış peptidlerin konsantrasyonları (etkinliğine bağlı olarak, daha düşük 2-3 uM olabilir sentezi). Tampon hangi proteinin,değişebilir çözündürüldü, ancak yukarıda tarif edilen engelleme çözeltisi kullanılarak protein seyreltilmesi yaygın olan bir virüstür. </li><li> Oda sıcaklığında ya da gece boyunca 4 ° C&#39;de 3-8 saat için protein çözeltisi içinde dizi inkübe edin. </li></ol> 4. antikorla enkübe <ol><li> 5 ml TBST&#39;dir / PBST&#39;yle dizi üç kez yıkayın. Birinci yıkama, oda sıcaklığında bir karıştırıcı üzerinde iki adet 5 dakikalık yıkama ve ardından 30 saniye içindir. </li><li> Oda sıcaklığında, bir çalkalayıcı üzerinde 1 saat süre ile, bloklama çözeltisi olarak aynı konsantrasyonlarda ile aynı katkı maddeleri ihtiva eden bir kültür ortamı tamponunda: seyreltilmiş HRP ile konjüge edilmiş antikor, 5 ml (1.500 1) ile yıkandı, dizi inkübe edin. Antikor, hedef proteini ya da etiketi ya da bağlanabilmektedir. </li><li> Ste olmadan aynı protokol tekrarlayarak dizi hedef proteinin (örneğin, oligomerizasyonu çalışmaları) peptidler ihtiva ettiği takdirde, dizideki peptidler ile antikorun etkileşimi test kontrol deneyleri gerçekleştirmekp = 3, bir protein ile kuluçkalanarak. </li><li> 5 ml TBST&#39;dir / PBST&#39;yle dizi üç kez yıkayın. Birinci yıkama, oda sıcaklığında bir karıştırıcı üzerinde iki adet 5 dakikalık yıkama ve ardından 30 saniye içindir. </li></ol> 5. Array Okuma <ol><li> Bir ECL batı lekeleme substrat kiti ile bir kemiluminesens geliştirme yürütmek. </li><li> Bir parlak görüntü analiz cihazı ile algılamayı gerçekleştirin. </li><li> Sonuçlarını analiz. Dizi hem çiftleri aynı sinyalleri gösterir, bu yüzden sonuçların güvenilir olduğundan emin olun. Protein ortağının yapısı eğer biliniyorsa, bağlama peptidleri için yapısına arama ve bağlanma siteleri için bir nokta. Sekansında uzakta bile peptidler üçüncül yapı birbirine yakın olacak ve bağlama sahası oluşturabilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Benyamini, H., Friedler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+peptides+to+study+protein&#8211;protein+interactions.">Using peptides to study protein&#8211;protein interactions.</a> Future Medicinal Chemistry. 2 (6), 989-1003 (2010).</li><li>Geysen, H. M., Wagner, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotope+or+mass+encoding+of+combinatorial+libraries.">Isotope or mass encoding of combinatorial libraries.</a> Chemistry &amp; Biology. 3 (8), 679-688 (1996).</li><li>Frank, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spot-synthesis:+an+easy+technique+for+the+positionally+addressable,+parallel+chemical+synthesis+on+a+membrane+support.">Spot-synthesis: an easy technique for the positionally addressable, parallel chemical synthesis on a membrane support.</a> Tetrahedron. 48 (42), 9217-9232 (1992).</li><li>Katz, C., Levy-Beladev, L., Rotem-Bamberger, S., Rito, T., Rudiger, S. G., Friedler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+protein-protein+interactions+using+peptide+arrays.">Studying protein-protein interactions using peptide arrays.</a> Chem Soc Rev. 40 (5), 2131-2145 (2011).</li><li>Hansen, L. B., Buus, S., Schafer-Nielsen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+Mapping+of+Linear+Antibody+Epitopes+in+Human+Serum+Albumin+Using+High-Density+Peptide+Arrays.">Identification and Mapping of Linear Antibody Epitopes in Human Serum Albumin Using High-Density Peptide Arrays.</a> PLoS ONE. 8 (7), (2013).</li><li>Uecker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+substrate+peptide+for+the+FLT3+receptor+tyrosine+kinase.">A substrate peptide for the FLT3 receptor tyrosine kinase.</a> British Journal of Haematology. 144 (1), 127-130 (2009).</li><li>Gabizon, R., Faust, O., Benyamini, H., Nir, S., Loyter, A., Friedler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-activity+relationship+studies+using+peptide+arrays:+the+example+of+HIV-1+Rev-integrase+interaction.">Structure-activity relationship studies using peptide arrays: the example of HIV-1 Rev-integrase interaction.</a> Med. Chem. Commun. 4 (1), 252-259 (2013).</li><li>Frank, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SPOT-synthesis+technique:+Synthetic+peptide+arrays+on+membrane+supports&#8212;principles+and+applications.">The SPOT-synthesis technique: Synthetic peptide arrays on membrane supports&#8212;principles and applications.</a> Journal of Immunological Methods. 267 (1), 13-26 (2002).</li><li>Falsey, J. R., Renil, M., Park, S., Li, S., Lam, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+and+Small+Molecule+Microarray+for+High+Throughput+Cell+Adhesion+and+Functional+Assays.">Peptide and Small Molecule Microarray for High Throughput Cell Adhesion and Functional Assays.</a> Bioconjugate Chemistry. 12 (3), 346-353 (2001).</li><li>Castiel, A., Danieli, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Stil+protein+regulates+centrosome+integrity+and+mitosis+through+suppression+of+Chfr.">The Stil protein regulates centrosome integrity and mitosis through suppression of Chfr.</a> Journal of Cell Science. 124 (4), 532-539 (2011).</li><li>Amartely, H., David, A., Lebendiker, M., Benyamini, H., Izraeli, S., Friedler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+STIL+protein+contains+intrinsically+disordered+regions+that+mediate+its+protein-protein+interactions.">The STIL protein contains intrinsically disordered regions that mediate its protein-protein interactions.</a> Chemical Communications. 50, 5245-5247 (2013).</li><li>Izraeli, S., Lowe, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SIL+gene+is+required+for+mouse+embryonic+axial+development+and+left-right+specification.">The SIL gene is required for mouse embryonic axial development and left-right specification.</a> Nature. 399 (6737), 691-694 (1999).</li><li>Izraeli, S., Colaizzo-Anas, T., Bertness, V. L., Mani, K., Aplan, P. D., Kirsch, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+SIL+gene+is+correlated+with+growth+induction+and+cellular+proliferation.">Expression of the SIL gene is correlated with growth induction and cellular proliferation.</a> Cell Growth Differ. 8 (11), 1171-1179 (1997).</li><li>Arquint, C., Sonnen, K. F., Stierhof, Y. -. D., Nigg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Cell-cycle-regulated+expression+of+STIL+controls+centriole+number+in+human+cells.">a Cell-cycle-regulated expression of STIL controls centriole number in human cells.</a> Journal of Cell Science. 125 (5), 1342-1352 (2012).</li><li>Tang, C. J., Lin, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+microcephaly+protein+STIL+interacts+with+CPAP+and+is+required+for+procentriole+formation.">The human microcephaly protein STIL interacts with CPAP and is required for procentriole formation.</a> Embo J. 30 (23), 4790-4804 (2011).</li><li>Vulprecht, J., David, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STIL+is+required+for+centriole+duplication+in+human+cells.">STIL is required for centriole duplication in human cells.</a> Journal of Cell Science. 125 (5), 1353-1362 (2012).</li><li>Campaner, S., Kaldis, P., Izraeli, S., Kirsch, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sil+phosphorylation+in+a+Pin1+binding+domain+affects+the+duration+of+the+spindle+checkpoint.">Sil phosphorylation in a Pin1 binding domain affects the duration of the spindle checkpoint.</a> Mol Cell Biol. 25 (15), 6660-6672 (2005).</li><li>Kasai, K., Inaguma, S., Yoneyama, A., Yoshikawa, K., Ikeda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCL/TAL1+interrupting+locus+derepresses+GLI1+from+the+negative+control+of+suppressor-of-fused+in+pancreatic+cancer+cell.">SCL/TAL1 interrupting locus derepresses GLI1 from the negative control of suppressor-of-fused in pancreatic cancer cell.</a> Cancer Res. 68 (19), 7723-7729 (2008).</li><li>Chaturvedi, P., Sudakin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chfr+regulates+a+mitotic+stress+pathway+through+its+RING-finger+domain+with+ubiquitin+ligase+activity.">Chfr regulates a mitotic stress pathway through its RING-finger domain with ubiquitin ligase activity.</a> Cancer Res. 62 (6), 1797-1801 (2002).</li><li>Olaussen, K. a., Commo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+proapoptotic+effects+of+the+two+tyrosine+kinase+inhibitors+pazopanib+and+lapatinib+on+multiple+carcinoma+cell+lines.">Synergistic proapoptotic effects of the two tyrosine kinase inhibitors pazopanib and lapatinib on multiple carcinoma cell lines.</a> Oncogene. 28 (48), 4249-4260 (2009).</li><li>Reingewertz, T. H., Britan-Rosich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+Vif&#8211;A3G+interaction+using+peptide+arrays:+A+basis+for+anti-HIV+lead+peptides.">Mapping the Vif&#8211;A3G interaction using peptide arrays: A basis for anti-HIV lead peptides.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry. 21 (12), 3523-3532 (2013).</li><li>Katz, C., Benyamini, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+the+interaction+between+the+antiapoptotic+Bcl-2+family+proteins+and+the+proapoptotic+protein+ASPP2.">Molecular basis of the interaction between the antiapoptotic Bcl-2 family proteins and the proapoptotic protein ASPP2.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (34), 12277-12282 (2008).</li><li>Katz, C., Zaltsman-Amir, Y., Mostizky, Y., Kollet, N., Gross, A., Friedler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Basis+of+the+Interaction+between+Proapoptotic+Truncated+BID+(tBID)+Protein+and+Mitochondrial+Carrier+Homologue+2+(MTCH2)+Protein:+KEY+PLAYERS+IN+MITOCHONDRIAL+DEATH+PATHWAY.">Molecular Basis of the Interaction between Proapoptotic Truncated BID (tBID) Protein and Mitochondrial Carrier Homologue 2 (MTCH2) Protein: KEY PLAYERS IN MITOCHONDRIAL DEATH PATHWAY.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (18), 15016-15023 (2012).</li><li>Rosenberg, M. M., Ronen, D., Lahav, N., Nazirov, E., Ravid, S., Friedler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+characterization+of+myosin+IIC+tailpiece+and+its+effect+on+filament+assembly.">High resolution characterization of myosin IIC tailpiece and its effect on filament assembly.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (14), 9779-9789 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Peptid dizisi tarama ortaklarının bir hedef proteinin bağlanma mevkilerinin belirlenmesi için mükemmel bir araçtır. Bu testin gerçekleştirilmesi için, hızlı ve kolay ve sonuçlar, bir veya iki gün içinde elde edilebilir. Peptid dizisi tarama çok yönlüdür ve birçok amaç için kullanılabilir. Bu fosforilasyon gibi post çeviri modifikasyonlar tanımlanması ve kinazların alt tabakaların tanımlanması için de kullanılabilir. Örneğin: miyeloid lösemi, akut ilgilidir FLT3 kinaz, bir peptit dizisi 6 tarama tarafından bulunan Tir-ihtiva eden alt-tabaka peptidler fosforile eder. Tirosin kinaz inhibitörleri pazopanib ve lapatinibin önleyici özellikleri 23 tarama peptid dizisi kullanılarak test edilmiştir. Peptidler dizisi, protein-protein etkileşimlerine aracılık siteleri belirlemek için kullanılabilir. Bu yöntemi kullanarak, laboratuarımızda çalışılan Bu tür proteinlerin örnekleri: HIV-1 Vif proteinine ve hücresel A3G protein arasındaki etkileşimi bize karakterizebir peptit dizisi 24 ing; peptid dizisi tarama pro-apoptotik ASPP2 protein 25 ile anti-apoptotik BCL-2 ailesinin etkileşimleri incelemek ve mitokondriyal protein MTCH2 26, tBID, BCL-2 ailesinin bir üyesinin bağlama incelemek için kullanılan; Miyozin IIC etki alanları arasında intra-moleküler etkileşim 27 eleme peptid dizisi kullanılarak analiz edildi. Burada biz Stil-CHFR etkileşimi, proliferasyon ve kanser 14 önemli bir protein-protein etkileşiminin aracılık mevkilerinin belirlenmesi için tarama peptiti kullanılan bir örnek sunulmuştur. Tam bağlanma sitesini ortaya çıkarılması çalışılan etkileşimin inhibitörlerinin rasyonel tasarımı için baz olarak kullanılabilir. Peptid dizisi tarama kantitatif bir deney değildir. Dizinin her nokta peptidin miktarı sentez verimi, ve peptit saflığı farkı nedeniyle değişir çünkü yarı-kantitatif. Sırayla Bu Pept bağlıdırvs de yanlış negatif ya da yanlış pozitif sonuçlara bazen yol açabilir verim ve saflıkta varyasyon ide sekansı, uzunluğu,. Aynı dizi içindeki yoğunluğu arasındaki karşılaştırma, yarı nicel sıralamasında sonuçlanan yapılabilir. Aynı dizisi ile farklı diziler veya farklı deneyler arasındaki Ancak böyle bir karşılaştırma güvenilir değildir. Bağlanma miktarının ölçülmesi için, peptit dizisi taramada bulunan peptidler Bu gibi deneyler olan floresan anizotropi, izotermal titrasyon kalorimetrisi (ITC), yüzey plazmon rezonans (SPR) gibi biyo-fiziksel yöntemler kullanılarak hedef protein bağlanması için sentezlenmiş ve test edilmelidir bu tür bir bağlanma tespit etmek için, proteinin yüksek bir konsantrasyonunun gerektirdiği için bağlanma ile zayıf arası her zaman hassas değildir. Peptid dizisi tarama, diğer yandan, zayıf bağlanma karşı çok hassastır. Bu durumda, dizi tarama gözlenen etkileşimler gibi bazı floresan anisot gibi yöntemler kullanılarak gözlenen veya tespit edilememiştir<html> 14 vıcık vıcık. Peptid dizi tarama deneyinin yüksek hassasiyet ile birlikte proteininin çok düşük konsantrasyonlarda ihtiyaç olması peptid dizisi afinitelere geniş bir protein-peptid etkileşimlerinin taranmasına yönelik faydalı bir yöntem tercih. Yalancı negatif sonuç aynı zamanda doğrusal peptidlerin uygun bir şekilde protein bağlanma yerinin 3 boyutlu yapısını temsil edemezler gerçeğine bağlı olabilir. Bu ne kadar iyi peptidler tarafından temsil edilen doğal olarak düzensiz proteinler ile bir sorun değildir. Yanlış pozitif sonuçları dizi antikorun bağlanmasının neden olabilir. Bu protokol, Bölüm 4.3 de tarif edildiği gibi, bir kontrol deneyi yapılarak tespit edilebilir. Antikor tarafından tanınan bir proteini epitop peptit dizisine bağlanması üzerine maruz kalmamış olur, yanlış negatif sonuçlar da elde edilebilir. Bu sorun, yaygın değildir ama proteinine karşı bir poliklonal antikor ile çözülebilir. jove_content &quot;&gt; peptid dizisi tarama ayrıca, kurşun peptidler geliştirmek Alanin tarama SAR 7 çalışma da dahil olmak üzere kullanılabilir. hedef bağlanma bölgesi bilinmektedir zaman, bunun sekansının dayanan bir dizi, her değiştirilmesi de dahil olmak üzere çok sayıda modifikasyonlar ile tasarlanabilir alanin (Ala tarama) Tortu, etkileşim için önemli kalıntılarını belirlemek için. Benzer bir şekilde, SAR çalışmalar bağlama peptidleri farklı özelliklerini değiştirerek gerçekleştirilebilir. Bunlar, peptidin uzunluğu değişen, karşılık gelen D kalıntılarının değiştirilmesi bulunmaktadır a-amino asitler ve doğal olmayan amino asitler ile metilasyon, glikosilasyon ve değiştirme gibi diğer değişiklikleri de yapılabilir. Bu tür modifiye edilmiş peptidlerin, tek bir hedef sekansı üzerine oturtulmuş, bir dizi sentez edilebilir ve bir hızlı ve kolay bir deney, hedef protein bağlanma açısından taranır potansiyel bir inhibitörü iyileştirilmesi ve etkileşimin moleküler mekanizmasını anlamak için bir bilgi zenginliği sağlamak. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; peptid dizi tarama için yöntem son derece esnektir ve gerektiğinde protokolde değişiklikler uygulanabilir. Özellikle, sığır serumu albümini (BSA) veya sukroz gibi süt yanında diğer engelleyici bileşikler, kullanılabilir. Spesifik olmayan bağlanma tespit edildiğinde, süt / BSA / sakaroz yüksek konsantrasyonu kullanılmalıdır. Protein arzu edilen herhangi bir tampon maddesi içinde bir dizi ile kuluçkalanmıştır, ancak spesifik olmayan bağlanmasını önlemek üzere, tampon süt / BSA / sakaroz veya bloklama çözeltisi olarak kullanılan herhangi bir başka engelleyici eklemek için önemlidir edilebilir. Protein konsantrasyonu nispeten düşük kalması ve güçlü bir bağlanma hatta 3-5 uM proteini ile gözlenebilir. (Protein ya da antikor ile yıkama ile, inkübasyon engelleme) her aşamasında inkübasyon hacmi tam dizisini karşılamak için yeterli olmalıdır. Genellikle 4-5 ml yeterlidir. Birincil antikor, saptanabilir değilse ikinci bir antikor kullanılabilir. Bu durumda 6 adımları ve 7 seyreltme ve inkübasyon süreleri ile tekrarlanmalıdır içindeBu belirli bir ikincil antikor uygun. Saptama işlemi, antikorun bağlıdır. Bu protokolde tarif edildiği gibi yaban turpu peroksidaz (HRP) konjüge edilmiş antikorlar için, kemilüminesans yaygın olarak kullanılır. Farklı alternatif örneğin floresan ya da elektro-kimyasal aydınlatma 4 gibi farklı antikor için de kullanılabilir. Burada tarif edilen peptid dizisi tek kullanımlıktır ve yeniden edilemez. Burada sunulan protokol peptid dizilerinin geniş yararlılığını göstermektedir. Doğru tasarlanmış bir dizi kullanarak, iki protein arasındaki bağlanma yerleri, detaylı bir şekilde tespit edilebilir. Bağlanma yeri de karakterize etmektedir kez ilgili protein-protein etkileşimini inhibe etmek için, bir ilaç hedef alan olarak kullanılabilir. Dizi tarama bulunan bağlama peptidleri göre, engelleyici küçük moleküller tasarlanabilir ve ilaç potansiyel olarak gösterildi.

Protein-protein etkileşimleri canlı hücrenin içinde işlemlerinin çoğunun aracılık eder. Engelliler protein etkileşimleri protein etkileşimlerini önemli ilaç hedeflerini, yapım hastalığına neden olabilir. Bu, moleküler seviyede, bu etkileşimleri anlamak için bu nedenle çok önemlidir. Protein etkileşimleri, hücresel ve biyokimyasal tahlilleri kantitatif biyofiziksel deneylerinde değişen çeşitli teknikler kullanılarak incelenmiştir ve bu protein alanları ile ya da peptidler ile, tam uzunlukta proteinler ile gerçekleştirilebilir. Peptidler protein etkileşimleri çalışmak için mükemmel araçlar hizmet vermektedir. Peptidler kolayca sentezlenebilen ve bir taraftan ve diğer taraftan 1,2 üzerinde yüksek verimli bir şekilde birden fazla protein hedefleri üzerinde belirli bir etkileşim sitesi odaklanarak izin edilebilir olmasıdır. Peptid dizisi tarama bir hızlı, kısa bir süre 3 çok sayıda ortakları ile bir hedef protein etkileşimleri ile ilgili verilerin büyük miktarda elde edilmesi için bir metodu gerçekleştirmek için kullanımı kolay. Protein-protein etkileşimlerini tespit etmek ve analiz etmek için diğer biyokimyasal ve biyofiziksel yöntemlerden farklı olarak, peptid dizi tarama protein çok düşük bir konsantrasyonu gerektirir ve nihai çok zayıf algılayabilir. Peptid dizileri enzim aktivitelerini 6 ve yüksek verim inceleyerek, protein-protein ya da reseptör-ligand etkileşim bölgeleri 4, homo veya hetero-oligomerizasyon arayüzleri eşleme gibi peptid-protein etkileşimleri birçok uygulama için karakterize edici antikorlar 5 epitoplar kullanılabilir Yapısal aktivite ilişkisi (SAR) 7 inceler. Peptit dizisi tarama hakkında derinlemesine bir inceleme için Katz ve arkadaşları bkz. 4 Peptid dizilerin çeşitli tipleri şu anda mevcuttur. Peptidlerin sentezi esas olarak spot tekniği 4,8 kullanarak, doğrudan katı destek üzerindeki peptit, katı destek veya sentezine tutturulmadan önce: peptid dizilerini hazırlamak için, iki büyük sentetik stratejiler vardır.peptidler, 9-florenilmetiloksikarbonil (FMOC) 8, genellikle katı bir destek üzerinde sentezlenir. Yaygın sentetik şemalarda arasında Cı ucu yoluyla peptid N ucu yoluyla bağlantı (ör JPT pepstar dizileri 9) ve peptit bağlanma (örneğin, PepScan pepchip dizileri 10, JPT pepspot diziler 9 ve INTAVIS celluspot dizileri 11) 4. Katı destek değişir ve böylece kendisine peptit bağlama kimyasını neden olmamaktadır. Cys-sonlu peptidler tiol grubu 12 ile cam slaytlar bağlı olabilir. Bir peptidin N sonu bir birlik oluşturacak amino asidin esterifikasyonu yoluyla selüloz zar üzerinde bir hidroksil grubuna bağlı olabilir 8 eklenmiş. Burada, protein-protein etkileşimlerini incelemek için olan bir yöntem olarak peptid dizileri taranması için ayrıntılı bir protokol sunmaktır. Biz kullanılan dizi büyük amo içeren bir mikro-dizi Celluspots dizidirBir cam slayt tarafından desteklenen küçük bir selüloz zarı üzerine noktalar (384 noktalar çiftleri) ve unt. Bu düşük protein hacmi ve antikorlar ile çalışan ve tek bir deneyde başına veri önemli miktarda elde edilmesini mümkün kılmaktadır. Bu dizi aynı zamanda düşük bağlanma afinite algılanmasını sağlayan yüksek peptid yoğunluğu içerir. Dizi, normal hücre çoğalması 13 kontrol etmek için son derece önemli olan Stil-CHFR etkileşim haritalama için kullanılmıştır. İki protein arasındaki Kontrolsüz etkileşim kanser gelişimine yol açabilir. Bu etkileşimi haritalama biz spesifik bağlanma yeri ve artıklarını 14 bağlayıcı bulundu. Bu, protein-protein etkileşimini inhibe rasyonel inhibitörleri tasarımı için önünü açıyor.

<table><tbody><tr><td>Peptide array</td><td>INTAVIS Bioanalytical Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>His-probe Antibody (H-3) HRP</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8036 HRP</td><td></td></tr><tr><td>EZ-ECL Kit</td><td>Biological industries</td><td>20-500-120</td><td></td></tr><tr><td>Skim Milk</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>232100</td><td></td></tr><tr><td>LAS-3000 camera&amp;nbsp;</td><td>FUJI film</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

identifying protein-protein interaction sites using peptide arrays

Protein-protein etkileşimleri, organizmanın canlı hücresi ve kontrol homeostazında işlemlerinin çoğunun aracılık eder. Engelliler protein etkileşimleri protein etkileşimlerini önemli ilaç hedeflerini, yapım hastalığına neden olabilir. Bu, moleküler seviyede, bu etkileşimleri anlamak için bu nedenle çok önemlidir. Protein etkileşimleri, hücresel ve biyokimyasal tahlilleri kantitatif biyofiziksel deneylerinde değişen çeşitli teknikler kullanılarak incelenmiştir ve bu protein alanları ile ya da peptidler ile, tam uzunlukta proteinler ile gerçekleştirilebilir. Peptitler peptitler kolaylıkla sentez edilebilir çünkü protein etkileşimleri çalışma ve belirli etkileşim siteleri odaklanarak izin olarak mükemmel araçlar hizmet vermektedir. Peptid dizileri tedavi amacıyla hedef proteini bağlanan peptidleri, iki protein arasındaki etkileşim bölgeleri tespitine olarak elenmesini sağlamak. Onlar da yüksek kapasiteli SAR çalışmaları sağlar. Bağlanma yerleri, bir tipik ola tanımlanması içinCal peptid dizisi genellikle, kısmen istenilen hedef proteinin bir veya daha fazla ortak proteinlerin tam dizilerinden türetilen 10-20 kalıntıları çakışan peptidler içerir. Hedef bağlama proteini için bir dizi tarama proteinin sadece az miktarda kullanarak kolay ve hızlı bir yöntem ortak proteinlerin bağlanma bölgeleri, karşılık gelen bağlanan peptitleri göstermektedir. Bu yazıda, bir hedef protein ve ortakları arasındaki etkileşim siteleri haritalanması için peptid dizileri taranması için bir protokol açıklar. Peptid dizisi hesaba kendi ikincil yapılar alan ortak proteinlerin dizileri temel alınarak tasarlanmıştır. Bu protokolde kullanılan diziler INTAVIS Biyoanalitik Instruments tarafından hazırlanan Celluspots diziler vardı. Dizi özgül olmayan bağlanma ve üzerinde çalışılan protein ile kuluçkaya önlemek için bloke edilir. Bir antikor kullanılarak saptanması, proteinler arasındaki özel etkileşim sahalarına karşılık gelen bağlanan peptitleri göstermektedir.

Stil, çok önemli centrosomal proteindir. 19 - Normal hücre bölünmesi ve hücre proliferasyonu 13,15 denetler. STİL çeşitli proteinlerin 18,20,21 ile etkileşime girer ve bu etkileşimlerin en doğası gereği düzensiz bölgesi (IDR) 14, merkezi bölümü aracılığıyla meydana gelir. Biz STİL bağlayıcı protein CHFR türetilen peptidlerin oluşan bir dizi tasarlanmıştır. CHFR stres 22 mitotik yanıt olarak oluşturulan bir tümör bastırıcıdır. CHFR en STİL bağlanma alanının yapısı anda bilinmemektedir olduğu için protokol aşama 1.1 &#39;de tarif edildiği gibi, 7 tortularının çakışmayla 15 artık uzunluğundadır peptidlere protein domaini ayrılır. Yukarıdaki protokole detaylı olarak, Şekil 1&#39;de gösterildiği gibi, biz CHFR-stil bağlanma mevkilerinin belirlenmesi için tarama, bir peptit dizisi gerçekleştirilmiştir. Bir sağlayabilir iki kopya halinde 384 peptidlerinden oluşan bir INTAVIS Celluspot dizi, kullanılan<html> büyük bilgi miktarı, Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi. onun bağlayıcı proteinin CHFR (Şekil 3) STIL için bağlanma siteleri bulundu, bu peptid bir dizi kullanılması. Dizideki her siyah nokta hala bağlı bir CHFR türetilmiş peptid temsil eder. Bu sonuçların güvenilirliğini doğrular nüsha, söz konusu olduğundan her peptid iki kez göründüğünü unutmayın. STIL ve CHFR arasındaki etkileşim daha önce protein seviyesinde 13,14 gösterilmiştir. Peptid dizisi tarama STİL IDR bağlanmış, 7 ile CHFR türetilen peptitlerin ortaya, 500-650 kalıntıları (Şekil 3, Amartely ve ark. 14). Bu sonuçlar, CHFR üzerindeki Stil, bağlanma sitesi harita bırakıldı. CHFR primer dizi bu 7 peptitlerin mesafe rağmen bunlar (Şekil 4) 14 CHFR olarak STIL için iyi tanımlanmış bir bağlama bölgesi oluşturur. <html> 7 / 52097fig1highres.jpg &quot;/&gt; Şekil 1: peptid dizisi bir tarama şeması A, bir ya da daha fazla ortak proteinlerden türetilen kısmen çakışan peptitler oluşan bir peptiti tasarlanması hesabı ikincil yapıları önüne alınarak. Hedef bir protein ile kuluçkalanarak, B; Tespiti için bir antikor ile enkübe C-&#39;dir; D Algılama (kimyevi aydınlatma, floresan, vb yapılabilir); E- sonuçlarını incelemek bağlayıcı sitelerinin proteini ortaya çıkarmak için. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52097/52097fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52097/52097fig2highres.jpg" /> Şekil 2:. Peptid dizi tarama Algılama bir örneği, kimyasal ışıl ısı kullanılarak elde slayt aynısı gibi iki aynı dizileri içerir..es / ftp_upload / 52.097 / 52097fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52097/52097fig3highres.jpg" /> Şekil 3: CHFR proteine ​​STİL IDR bağlanması için bir peptit dizisini Tarama: 4.5 uM His ile etiketlenmiş STİL 500-650 dizisini bağlanması için taranmıştır. Her siyah nokta STIL fragmanı ve CHFR türetilmiş peptid 14 arasında bağlayıcı gösterir. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52097/52097fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52097/52097fig4highres.jpg" /> Şekil 4: CHFR Cys zengin alanının yapısı, gösterilen CHFR bölgesindeki STİL bağlanma yeri (kalıntılar 424-661 PDB İD: 2XPO) yedi.peptid dizisi taramasında halen bağlı peptitlerin birincil sekansında uzakta bulunan ama bir bağlanma yeri oluşturma 3D yapı birbirine yakındır pembe, turuncu ve kırmızı boyalı üç bölgelere bölünebilir. Bu, tam bölge dimer CHFR 14 STIL için bağlayıcı bir cep oluşturur. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52097/52097fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays at JoVE.com

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

Peptit Diziler protein-protein etkileşim Siteleri belirlenmesi

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

identifying-protein-protein-interaction-sites-using-peptide-arrays

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

17.9K Görüntüleme.  The Hebrew University of Jerusalem. Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

Video: Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The mass production and distribution of antibodies specific to histone PTMs has greatly facilitated research on these marks. As histone PTM antibodies are key reagents for many chromatin biochemistry applications, rigorous analysis of antibody specificity is necessary for accurate data interpretation and continued progress in the field. This protocol describes an integrated pipeline for the design, fabrication and use of peptide microarrays for profiling the specificity of histone antibodies. The design and analysis aspects of this procedure are facilitated by ArrayNinja, an open-source and interactive software package we recently developed to streamline the customization of microarray print formats. This pipeline has been used to screen a large number of commercially available and widely used histone PTM antibodies, and data generated from these experiments are freely available through an online and expanding Histone Antibody Specificity Database. Beyond histones, the general methodology described herein can be applied broadly to the analysis of PTM-specific antibodies.

This manuscript describes methods for applying peptide microarray technology to specificity profiling of antibodies that recognize histones and their post-translational modifications.

Histon Antikor Özgüllüğünün Peptit Mikroarraylerle Analizi

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

Biyokimya

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling cascades during homeostasis and disease, and as such represent prime therapeutic targets. Despite their relevance, these interaction networks remain significantly underrepresented in current databases; therefore, most extracellular proteins have no documented binding partner. This discrepancy is primarily due to the challenges associated with the study of the extracellular proteins, including expression of functional proteins, and the weak, low affinity, protein interactions often established between cell surface receptors. The purpose of this method is to describe the printing of a library of extracellular proteins in a microarray format for screening of protein-protein interactions. To enable detection of weak interactions, a method based on multimerization of the query protein under study is described. Coupled to this microbead-based multimerization approach for increased multivalency, the protein microarray allows robust detection of transient protein-protein interactions in high throughput. This method offers a rapid and low sample consuming-approach for identification of new interactions applicable to any extracellular protein. Protein microarray printing and screening protocol are described. This technology will be useful for investigators seeking a robust method for discovery of protein interactions in the extracellular space.

Here, we present a protocol to screen extracellular protein microarrays for identification of novel receptor-ligand interactions in high throughput. We also describe a method to enhance detection of transient protein-protein interactions by using protein-microbead complexes.

Hücre dışı Protein Mikroarray teknoloji yüksek işlem hacmi düşük benzeşme reseptör-Ligand etkileşimleri algılanması için

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Peptide-based Identification of Functional Motifs and their Binding Partners

Specific short peptides derived from motifs found in full-length proteins, in our case HIV-1 Nef, not only retain their biological function, but can also competitively inhibit the function of the full-length protein. A set of 20 Nef scanning peptides, 20 amino acids in length with each overlapping 10 amino acids of its neighbor, were used to identify motifs in Nef responsible for its induction of apoptosis. Peptides containing these apoptotic motifs induced apoptosis at levels comparable to the full-length Nef protein. A second peptide, derived from the Secretion Modification Region (SMR) of Nef, retained the ability to interact with cellular proteins involved in Nef's secretion in exosomes (exNef). This SMRwt peptide was used as the "bait" protein in co-immunoprecipitation experiments to isolate cellular proteins that bind specifically to Nef's SMR motif. Protein transfection and antibody inhibition was used to physically disrupt the interaction between Nef and mortalin, one of the isolated SMR-binding proteins, and the effect was measured with a fluorescent-based exNef secretion assay. The SMRwt peptide's ability to outcompete full-length Nef for cellular proteins that bind the SMR motif, make it the first inhibitor of exNef secretion. Thus, by employing the techniques described here, which utilize the unique properties of specific short peptides derived from motifs found in full-length proteins, one may accelerate the identification of functional motifs in proteins and the development of peptide-based inhibitors of pathogenic functions.

Techniques to dissect the mechanisms underlying the secretion of HIV-1 Nef in exosomes are described. Specific short peptides derived from Nef and protein transfection were exploited to determine the structure, function, and binding partners of Nef&#x2019;s Secretion Modification Region. These procedures have general relevance in many mechanistic studies.

Fonksiyonel Motifler ve Bağlama Ortaklar peptid bazlı Kimlik

Specific short  peptides derived from motifs found in full-length proteins, in our case HIV-1  Nef, not only retain their biological function, but can ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

<meta charset="utf8"></head><body>Protein-Protein Bağlanma Arayüzlerinin Amino Asit Tercihlerini Tahmin Etmek

Computational Prediction of Amino Acid Preferences of Potentially Multispecific Peptide-Binding Domains Involved in Protein-Protein Interactions

Many protein-protein interactions involve the binding of short protein segments to peptide-binding domains. Usually, such interactions require the recognition of linear motifs with variable conservation. The combination of highly conserved and more variable regions in the same ligands often contributes to the multispecificity of binding, a common property of enzymes and cell signaling proteins. Characterization of amino acid preferences of peptide-binding domains is important for the design of mediators of protein-protein interactions (PPIs). Computational methods are an efficient alternative to the often costly and cumbersome experimental techniques, enabling the design of potential mediators that can be later validated in downstream experiments. Here, we described a methodology using the Pepspec application of the Rosetta molecular modeling package to predict the amino acid preferences of peptide-binding domains. This methodology is useful when the structure of the receptor protein and the nature of the peptide ligand are both known or can be inferred. The methodology starts with a well-characterized anchor from the ligand, which is extended by randomly adding amino acid residues. The binding affinity of peptides generated this way is then evaluated by flexible-backbone peptide docking in order to select the peptides with the best predicted binding scores. These peptides are then used to calculate amino acid preferences and to optionally compute a position-weight matrix (PWM) that can be used in further studies. To illustrate the application of this methodology, we used the interaction between subunits of human interferon regulatory factor 5 (IRF5), previously known to be multispecific but globally guided by a short conserved motif called pLxIS. The estimated amino acid preferences were consistent with previous knowledge about the IRF5 binding surface. Positions occupied by phosphorylatable serine residues exhibited a high frequency of aspartate and glutamate, likely because their negatively charged side chains are similar to phosphoserine.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: Çok Spesifik Protein-Protein Etkileşimlerinde Amino Asit Tercihlerini Deşifre Etmek İçin Hesaplamalı Bir Yaklaşım

We describe a methodology based on sequence diversification to estimate the amino acid preferences of multispecific binding sites in protein-protein interactions (PPIs). In this strategy, thousands of potential peptide ligands are generated and screened in silico, thus overcoming some limitations of available experimental methods.

Protein-Protein Etkileşimlerinde Görev Alan Potansiyel Olarak Çok Spesifik Peptit Bağlayıcı Alanların Amino Asit Tercihlerinin Hesaplamalı Tahmini

Many protein-protein interactions involve the binding of short protein segments to peptide-binding domains. Usually, such interactions require the ...

Identification of Protein Interaction Partners in Mammalian Cells Using SILAC-immunoprecipitation Quantitative Proteomics

Quantitative proteomics combined with immuno-affinity purification, SILAC immunoprecipitation, represent a powerful means for the discovery of novel protein:protein interactions. By allowing the accurate relative quantification of protein abundance in both control and test samples, true interactions may be easily distinguished from experimental contaminants. Low affinity interactions can be preserved through the use of less-stringent buffer conditions and remain readily identifiable. This protocol discusses the labeling of tissue culture cells with stable isotope labeled amino acids, transfection and immunoprecipitation of an affinity tagged protein of interest, followed by the preparation for submission to a mass spectrometry facility. This protocol then discusses how to analyze and interpret the data returned from the mass spectrometer in order to identify cellular partners interacting with a protein of interest. As an example this technique is applied to identify proteins binding to the eukaryotic translation initiation factors: eIF4AI and eIF4AII.

SILAC immunoprecipitation experiments represent a powerful means for discovering novel protein:protein interactions. By allowing the accurate relative quantification of protein abundance in both control and test samples, true interactions may be easily distinguished from experimental contaminants, and low affinity interactions preserved through use of less-stringent buffer conditions.

SILAC-immunoprecipitation Kantitatif PROTEOMİK kullanma Memeli Hücrelerde Protein Etkileşim Ortakların Kimlik

Quantitative proteomics combined with immuno-affinity purification, SILAC immunoprecipitation, represent a powerful means for the discovery of novel ...

Biyoloji

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

Yüksek yoğunluklu Fonksiyonel Protein mikrodizileri Probing Protein-protein Etkileşimleri Algılama

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Specificity Analysis of Protein Lysine Methyltransferases Using SPOT Peptide Arrays

Lysine methylation is an emerging post-translation modification and it has been identified on several histone and non-histone proteins, where it plays crucial roles in cell development and many diseases. Approximately 5,000 lysine methylation sites were identified on different proteins, which are set by few dozens of protein lysine methyltransferases. This suggests that each PKMT methylates multiple proteins, however till now only one or two substrates have been identified for several of these enzymes. To approach this problem, we have introduced peptide array based substrate specificity analyses of PKMTs. Peptide arrays are powerful tools to characterize the specificity of PKMTs because methylation of several substrates with different sequences can be tested on one array. We synthesized peptide arrays on cellulose membrane using an Intavis SPOT synthesizer and analyzed the specificity of various PKMTs. Based on the results, for several of these enzymes, novel substrates could be identified. For example, for NSD1 by employing peptide arrays, we showed that it methylates K44 of H4 instead of the reported H4K20 and in addition H1.5K168 is the highly preferred substrate over the previously known H3K36. Hence, peptide arrays are powerful tools to biochemically characterize the PKMTs.

Peptide arrays synthesized by the SPOT method can be used to analyze the substrate specificity of Protein lysine methyltransferases (PKMTs) and to define the substrate spectrum of PKMTs to understand their biological role. This protocol describes how to synthesize peptide arrays, methylate them with PKMTs, and analyze the results.

SPOT Peptit Diziler Protein Lizin Methyltransferases Özgünlüğü Analizi

Lysine methylation is an emerging post-translation modification and it has been identified on several histone and non-histone proteins, where it plays ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This protocol provides step-by-step instructions for the development and application of quantitative assays using selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry (MS). First, likely quantotypic target peptides are identified based on numerous criteria. This includes identifying proteotypic peptides, avoiding sites of posttranslational modification, and analyzing the uniqueness of the target peptide to the target protein. Next, crude external peptide standards are synthesized and used to develop SRM assays, and the resulting assays are used to perform qualitative analyses of the biological samples. Finally, purified, quantified, heavy isotope labeled internal peptide standards are prepared and used to perform isotope dilution series SRM assays. Analysis of all of the resulting MS data is presented. This protocol was used to accurately assay the absolute abundance of proteins of the chemotaxis signaling pathway within RAW 264.7 cells (a mouse monocyte/macrophage cell line). The quantification of Gi2 (a heterotrimeric G-protein &#945;-subunit) is described in detail.

This protocol describes how to perform absolute quantification assays of target proteins within complex biological samples using selected reaction monitoring. It was used to accurately quantify proteins of the mouse macrophage chemotaxis signaling pathway. Target peptide selection, assay development, and qualitative and quantitative assays are described in detail.

Mutlak Protein Niceleme Kütle Spektrometresi İzleme Seçilen Tepki

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...

Peptit Diziler protein-protein etkileşim Siteleri belirlenmesi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Histon Antikor Özgüllüğünün Peptit Mikroarraylerle Analizi

Hücre dışı Protein Mikroarray teknoloji yüksek işlem hacmi düşük benzeşme reseptör-Ligand etkileşimleri algılanması için

Fonksiyonel Motifler ve Bağlama Ortaklar peptid bazlı Kimlik

Protein-Protein Etkileşimlerinde Görev Alan Potansiyel Olarak Çok Spesifik Peptit Bağlayıcı Alanların Amino Asit Tercihlerinin Hesaplamalı Tahmini

Protein-Protein Etkileşimlerinde Görev Alan Potansiyel Olarak Çok Spesifik Peptit Bağlayıcı Alanların Amino Asit Tercihlerinin Hesaplamalı Tahmini

Protein-Protein Etkileşimlerinde Görev Alan Potansiyel Olarak Çok Spesifik Peptit Bağlayıcı Alanların Amino Asit Tercihlerinin Hesaplamalı Tahmini

SILAC-immunoprecipitation Kantitatif PROTEOMİK kullanma Memeli Hücrelerde Protein Etkileşim Ortakların Kimlik

Yüksek yoğunluklu Fonksiyonel Protein mikrodizileri Probing Protein-protein Etkileşimleri Algılama

SPOT Peptit Diziler Protein Lizin Methyltransferases Özgünlüğü Analizi

Mutlak Protein Niceleme Kütle Spektrometresi İzleme Seçilen Tepki