Bu protokol, organize edilmiş ve kümelenmiş mikro RNA genlerini moleküler olarak incelemek için yüksek verimli bir CRISPR gen düzenleme iş akışı kullanır. Ve bu kodlamayan RNA ağlarının kanser ilerleme yollarını nasıl koordine ettiğini belirlemek. Bu CRISPR gen düzenleme prosedürü, araştırmacının zaman alıcı DNA vektörü alt klonlamasından kaçınırken, benzersiz mikro RNA kümesi delesyon kombinasyonlarını taşıyan tüm hücre hatları panelini hızlı bir şekilde oluşturmasını sağlar.
Bu yöntem, kümelenmiş mikro RNA'ların, mikro RNA'ları terapötik ve tanısal araçlar olarak kliniğe çevirmeden önce tümör büyümesini, saldırganlığını ve ilaç direncini düzenlemek için işbirliği içinde nasıl işlev gördüğünün daha net bir şekilde anlaşılmasını sağlayacaktır. Prosedürü gösteren, laboratuvarımda araştırma görevlisi olan Grace Yi olacak. Başlamak için, bir DNA dizisi ek açıklama yazılımı programı kullanarak, çevredeki genomik bölgelerin en az bir kilobaytında ilgilenilen mikro RNA kümesi bölgesinin tam genomik dizisini içeren bir DNA dosyası oluşturun.
Daha sonra, hedeflenen her mikro RNA lokusu için dört benzersiz CRISPR RNA'sı tasarlayın. Mikro RNA saç tokası kümesinin hemen beş primini ücretsiz DNA dizilerini hedeflemek için tasarlanmış iki CRISPR RNA ve mikro RNA saç tokası kümesinin hemen üç primini ücretsiz DNA dizilerini hedeflemek için tasarlanmış iki CRISPR RNA'sı. Sentezlenecek her tasarlanmış CRISPR RNA'sı için DNA hedef dizisini işaretlemek üzere oluşturulan DNA dosyasında bir özellik düzenleme aracı kullanın.
CRISPR hücre hatlarının genotiplendirilmesi için hedeflenen mikro RNA küme bölgelerini çevreleyen tasarlanmış ve sentezlenmiş PCR primerleri. Cas9 protein indüksiyonu için en uygun koşulları belirlemek için yeni üretilen mercimeği ile indüklenebilir Cas9 hücre hatları üzerinde bir doksisiklin konsantrasyon eğrisi gerçekleştirin. Her altı kuyu plakasının kuyusu başına dördüncü hücrelerin beş çarpı 10'unu plakalayın ve 24 saat boyunca tercih edilen ortamda% 5 karbondioksit olan 37 santigrat derecede büyür.
Dox'u, mili litre başına 0 5100, 150, 250 ila 500 nanogram arasında değişen son bir dox konsantrasyon eğrisi ile tercih edilen ortamda seyreltin. Her oturmuş altı kuyu plakasının kuyularını bir ila altı arasında etiketleyin. Ortamı çıkarın ve uygun doks konsantrasyonlarıyla değiştirin.
Plakaları 24 saat, 48 saat ve 72 saat doks indüksiyonu ve dox çekilmesinden 120 saat sonrasına kadar bir ila dört arasında büyütün. Her zaman noktasında plakanın kuyularını hasat edin. Lisat izolasyonu için hücre peletlerini ve ripa tamponunu işleyin.
Cas9 protein indüksiyonunu ölçmek ve optimal Cas9 konsantrasyonunu belirlemek için 40 mikrogram protein ile batı lekesi analizi yapın. Kağıt üzerinde, tüm mikro RNA kümesini, çeşitli kümelenmiş mikro RNA gen kombinasyonlarını ve bireysel mikro RNA küme üyelerini hedefleyen 24 kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna dönüştürülecek beş asal ve üç asal CRISPR RNA çifti kombinasyonunu haritalandırın. Lenti'yi indüklenebilir plaka, optimize edilmiş dox konsantrasyonunu içeren tercih edilen ortamda, 24 kuyucuklu bir plakanın kuyusu başına dördüncü hücrelere beş kez 10 kat dokuz hücre çizgisi döker.
Cas9 protein ekspresyonunu indüklemek için hücreleri 37 santigrat derecede,% 5 karbondioksitte 24 ila 48 saat büyütün. Lenti ile indüklenebilir Cas9 hücrelerini hazırlanmış beş asal ve üç asal kılavuz RNA ile transfekte edin. Hedeflenen mikro RNA lokusu başına dört adet 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpünü etiketleyin.
Her tüpte, iki mikromolar kılavuz RNA kompleksini oluşturmak için izleyici RNA'nın bir ila bir molar oranını ve benzersiz CRISPR RNA'larını karıştırın. 1,5 mililitrelik santrifüj tüpüne 2,5 mikrolitre izleyici RNA, beş asal konumlandırılmış CRISPR RNA'nın 1,25 mikrolitresi, üç asal konumlandırılmış CRISPR RNA'nın 1,25 mikrolitresi ve beş mikrolitre 10 milimolar tris hcl pH 7,5 tamponu ekleyin. Mikro santrifüjü 30 saniye boyunca 16.000 kez G'de karıştırın.
Oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Her tüpe 40 mikrolitre indirgenmiş serum ortamı, 10 mikrolitre kılavuz RNA kompleks reaksiyonuna. Yukarı ve aşağı pipetle çekerek hafifçe karıştırın.
Temiz bir 1,5 mililitrelik santrifüj tüpünde, iki mikrolitre transfeksiyon reaktifi ve 48 mikrolitre azaltılmış serum ortamı, yukarı ve aşağı pipetleme ile nazikçe karıştırılır. Oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. 50 mikrolitre kılavuz RNA karışımını içeren her tüpe, seyreltilmiş transfeksiyon reaktifinin 50 mikrolitresini ekleyin.
Pipetle karışımı karıştırmak için yavaşça yukarı ve aşağı bir kez yukarı ve aşağı doğru karıştırın. Oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Kılavuz RNA transfeksiyon karışımının 100 mikrolitresini içeren her tüpe doksisiklin takviyeli 400 mikrolitre antibiyotiksiz ortam ekleyin.
Pipetleri nazikçe karıştırın. Ortamı doksisiklin ile indüklenen lenti indüklenebilir Cas9 hücrelerinden çıkarın. 24 kuyu plakası deney haritasına dayanarak 500 mikrolitre medya doksisiklin kılavuz RNA dönüşüm karışımı ekleyin.
Transfekte edilen hücreleri% 5 karbondioksit içinde 37 santigrat derecede 48 saat boyunca inkübe edin. Ortamı doksisiklin içermeyen taze hazırlanmış ortamla değiştirin. Hücrelerin 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte 24 ila 48 saat daha iyileşmesine izin verin.
Transfekte hücreleri toplayın ve genotipleme ve tek hücre sanrıları için hazırlanın. 150 mikrolitre yeniden askıya alınmış hücreyi üç parçaya ayırın. Transfekte hücrelerin üçte birini orta artı %10 DMSO'yu uzun süreli depolama için kriyo şişelerde dondurun.
Transfekte hücrelerin üçte birini, genotipleme için temiz bir 0.2 mililitrelik PCR tüpüne aktarın. Transfekte hücrelerin son üçte birini, tek hücreli koloniler oluşturmak için 96 kuyucuklu bir plaka formatında sayma ve seyreltme için hazırlayın. 12 kanallı çok borulayıcı ve steril bir reaktif haznesi kullanarak, her seyreltme için plakanın iki sırasına kuyu başına 100 mikrolitre seyreltilmiş hücre ekleyin.
Hücrelerin tek hücreli koloni genişlemesi için akıcılığa büyümesi için dört ila altı hafta bekleyin. Genotipleme için yaklaşık 10 ila 15 tek hücreli koloni toplayın. Hedeflenen her mikro RNA lokusu için en az üç bağımsız nakavt tek hücreli koloni hattı tanımlayın.
Wild tip tek hücreli satırları denetim olarak saklayın. Resuspend, hücre peletini dört mikrolitre beş X DNA polimeraz tamponu, bir mikrolitre proteinaz K, bir mikrolitre RNaz A ve toplam 20 mikrolitre hacme kadar nükleaz içermeyen suda askıya aldı. Termo siklikçideki hücreleri 30 dakika boyunca 56 santigrat derecede ve beş dakika boyunca 96 santigrat derecede bitirin.
PCR genotiplemesine hazır olana kadar hücre lizatlarını eksi 20 santigrat derecede saklayın. Kılavuz RNA beş asal ve üç asal kılavuz RNA hedeflenen bölgeleri çevreleyen tasarlanmış PCR primerlerini kullanarak bir PCR genotipleme reaksiyonu gerçekleştirin. Metin makalesinde belirtilen programı kullanarak PCR reaksiyonunu bir termosikler içinde çalıştırın.
PCR ürünlerini elektroforez analizi için% 1 agaroz jeli üzerine yükleyin. Nakavt genotipleri için öngörülen moleküler boyutun izole PCR fragmanlarından DNA çıkarın. DNA dizilimi için örnekleri hazırlayın.
CRISPR reaksiyonunun başarılı olduğunu doğrulayın ve Cas9 bölünme bölgesini tanımlamak ve mikro RNA lokus delesyonunu doğrulamak için izole PCR fragmanlarının DNA dizilimini gerçekleştirin. 35 kiloluk bazlar miR-888 küme bölgesinin tamamını hedef alan benzersiz CRISPR RNA'ları tasarlandı. MiR-743 ailesi veya miR-891 ailesi içindeki daha küçük küme kombinasyonları ve mikro RNA delesyonları.
PCR reaksiyonlarının jel elektroforez analizi, nakavt genotipini temsil eden öngörülen DNA fragman boyutunun her CRISPR transfeksiyonu için güçlendirildiğini göstermiştir. Tek hücreli koloniler PCR tarafından sırayla genotiplendirildi. Bu izole nakavt PCR fragmanlarının DNA dizilimi, transfekte edilmiş beş asal ve üç asal kılavuz RNA'nın, Cas9 bölünme ligasyonunu PAM bölgelerinin yukarı yönünde yaklaşık üç nükleotid yönettiğini ve hedeflenen mikro RNA lokusunun genomik kaybını doğruladığını doğruladı.
MiR-891a nakavt ve vahşi tip hücreleri karşılaştıran WST-1 proliferasyon testleri, mikro RNA taklit lentiviral vektörün aşırı ekspresyonunun prostat hücresi büyümesini indüklediğini doğrulamaktadır ve bu nedenle miR-891 kaybının karşılıklı etkiler göstereceği tahmin edilmektedir. Dikkatli kılavuz RNA tasarımının yanı sıra, her bir mikro RNA nakavt hattından hızlı bir şekilde tek hücre kolonileri oluşturmak önemlidir. Mikro RNA nakavt hücrelerinin canlılık büyümesini azaltması ve vahşi tip hücrelere sahip karışık popülasyonlarda kolayca rekabet edebilmesi özellikle önemlidir.
Kantitatif gerçek zamanlı PCR, kuzey lekesi ve RNA dizilimi gibi ek yöntemler, CRISPR nakavt hücre hatlarının silinen lokus için olgun mikro RNA'yı ifade etmediğini doğrulamak için yapılmalıdır.
