Dieses Protokoll verwendet einen Hochdurchsatz-CRISPR-Gen-Editing-Workflow, um Mikro-RNA-Gene molekular zu sezieren, organisierte und gruppierte Einheiten. Und um zu bestimmen, wie diese nicht-kodierenden RNA-Netzwerke Krebsprogressionswege koordinieren. Dieses CRISPR-Gen-Editing-Verfahren ermöglicht es dem Forscher, schnell ein ganzes Panel von Zelllinien zu generieren, die einzigartige Mikro-RNA-Cluster-Deletionskombinationen tragen, während zeitaufwändige DNA-Vektor-Sub-Klonierung vermieden wird.
Diese Methode wird ein klareres Verständnis dafür liefern, wie geclusterte Mikro-RNAs kooperativ funktionieren, um Tumorwachstum, Aggressivität und Arzneimittelresistenz zu regulieren, bevor Mikro-RNAs als therapeutische und diagnostische Werkzeuge in die Klinik übersetzt werden. Grace Yi, eine wissenschaftliche Mitarbeiterin in meinem Labor, demonstriert das Verfahren. Erstellen Sie zunächst eine DNA-Datei, die die vollständige genomische Sequenz der interessierenden Mikro-RNA-Clusterregion in mindestens einem Kilobyte umgebender genomischer Regionen enthält, indem Sie ein DNA-Sequenz-Annotations-Softwareprogramm verwenden.
Als nächstes entwerfen Sie vier einzigartige CRISPR-RNAs für jeden gezielten Mikro-RNA-Locus. Zwei entworfene CRISPR-RNAs, um komplementäre DNA-Sequenzen unmittelbar fünf Prime des Mikro-RNA-Haarnadelclusters und zwei entworfene CRISPR-RNAs zu adressieren, um komplementäre DNA-Sequenzen unmittelbar drei Prime des Mikro-RNA-Haarnadelclusters anzugreifen. Verwenden Sie ein Feature-Bearbeitungswerkzeug in der erstellten DNA-Datei, um die DNA-Zielsequenz für jede entworfene CRISPR-RNA zu markieren, die synthetisiert werden soll.
Entwickelte und synthetisierte PCR-Primer, die die anvisierten Mikro-RNA-Clusterregionen für die Genotypisierung von CRISPR-Zelllinien flankieren. Führen Sie eine Doxycyclin-Konzentrationskurve an neu erzeugten Lenti-induzierbaren Cas9-Zelllinien durch, um die optimalen Bedingungen für die Cas9-Proteininduktion zu bestimmen. Fünfmal 10 der vierten Zellen pro Vertiefung jeder sechs Vertiefungsplatte und wachsen bei 37 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid, im bevorzugten Medium für 24 Stunden.
Dox wird im bevorzugten Medium mit einer endgültigen Dox-Konzentrationskurve im Bereich von 0 5100, 150, 250 bis 500 Nanogramm pro Milliliter verdünnt. Beschriften Sie die Vertiefungen jeder sitzenden Sechs-Well-Platte von eins bis sechs. Entfernen Sie das Medium und ersetzen Sie es durch die entsprechenden Dox-Konzentrationen.
Wachsen Sie Platten ein bis vier bis 24 Stunden, 48 Stunden und 72 Stunden Dox-Induktion und 120 Stunden nach dem Dox-Entzug. Ernten Sie die Vertiefungen der Platte zu jedem Zeitpunkt. Verarbeiten Sie die Zellpellets und den Ripa-Puffer für die Lysatisolierung.
Führen Sie eine Western-Blot-Analyse mit 40 Mikrogramm Protein durch, um die Cas9-Proteininduktion zu messen und die optimale Cas9-Konzentration zu bestimmen. Kartieren Sie auf Papier die fünf primären und drei primären CRISPR-RNA-Paarkombinationen, die in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte transekt werden, die auf den gesamten Mikro-RNA-Cluster, verschiedene Cluster-Mikro-RNA-Genkombinationen sowie einzelne Mikro-RNA-Clustermitglieder abzielt. Die Lenti-induzierbare gegossene Neunzelllinie wird fünfmal 10 bis zur vierten Zelle pro Vertiefung einer 24-Well-Platte in das bevorzugte Medium gelegt, das die optimierte Dox-Konzentration enthält.
Züchten Sie die Zellen für 24 bis 48 Stunden bei 37 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid, um Cas9-Proteinexpression zu induzieren. Transfizieren Sie die Lenti-induzierbaren Cas9-Zellen mit einer vorbereiteten fünf Prime- und drei Prime-Guide-RNAs. Markieren Sie vier 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen pro Ziel-Mikro-RNA-Locus.
Mischen Sie in jedem Röhrchen ein zu eins molares Verhältnis von Tracer-RNA und einzigartigen CRISPR-RNAs zusammen, um die beiden mikromolaren Guide-RNA-Komplexe zu bilden. Fügen Sie 2,5 Mikroliter Tracer-RNA, 1,25 Mikroliter der fünf primär positionierten CRISPR-RNA, 1,25 Mikroliter der drei primär positionierten CRISPR-RNA und fünf Mikroliter 10 Millimolar Tris hcl pH 7,5-Puffer zu einem 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen hinzu. Mikrozentrifuge für 30 Sekunden bei 16.000 mal G mischen.
Bei Raumtemperatur fünf Minuten inkubieren. Zu jedem Röhrchen werden 40 Mikroliter Serummedium auf die 10 Mikroliter Guide-RNA-Komplexreaktion reduziert. Mischen Sie vorsichtig, indem Sie auf und ab pipettieren.
In einem sauberen 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen zwei Mikroliter des Transfektionsreagenz und 48 Mikroliter reduziertes Serummedium vorsichtig durch Auf- und Abpipettieren gemischt. Bei Raumtemperatur fünf Minuten inkubieren. Zu jedem Röhrchen, das die 50 Mikroliter Guide-RNA-Mischung enthält, werden die 50 Mikroliter des verdünnten Transfektionsreagenzes hinzugefügt.
Pipetten Sie die Mischung langsam einmal auf und ab, um sie zu mischen. Bei Raumtemperatur 20 Minuten inkubieren. Fügen Sie 400 Mikroliter antibiotikafreies Medium, ergänzt mit Doxycyclin, zu jedem Röhrchen hinzu, das die 100 Mikroliter der Guide-RNA-Transfektionsmischung enthält.
Zum Mischen vorsichtig pipetten. Entfernen Sie das Medium aus den Doxycyclin-induzierten Lenti-induzierbaren Cas9-Zellen. Fügen Sie 500 Mikroliter Medien-Doxycyclin-Guide-RNA-Transformationsmischung basierend auf der experimentellen Karte mit 24 Bohrlochplatten hinzu.
Inkubieren Sie die transfizierten Zellen für 48 Stunden bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid. Ersetzen Sie das Medium durch das frisch zubereitete Medium ohne Doxycyclin. Lassen Sie die Zellen weitere 24 bis 48 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid erholen.
Ernten Sie die transfizierten Zellen und bereiten Sie sich auf Genotypisierung und einzellige Wahnvorstellungen vor. Trennen Sie die 150 Mikroliter resuspendierter Zellen in drei Teile. Frieren Sie ein Drittel der transfizierten Zellen in Medium plus 10% DMSO in Kryofläschchen für die Langzeitlagerung ein.
Ein Drittel der transfizierten Zellen wird zur Genotypisierung in ein sauberes 0,2-Milliliter-PCRÖHRCHEN überführt. Bereiten Sie das letzte Drittel der transfizierten Zellen zum Zählen und Verdünnen in einem 96-Well-Plattenformat vor, um Einzelzellkolonien zu erzeugen. Unter Verwendung eines 12-Kanal-Multipipetters und eines sterilen Reagenzienreservoirs werden für jede Verdünnung 100 Mikroliter verdünnte Zellen pro Vertiefung in zwei Reihen der Platte gegeben.
Lassen Sie vier bis sechs Wochen, bis die Zellen zu Kofluenz für die Expansion einzelner Zellkolonien wachsen. Sammeln Sie etwa 10 bis 15 einzellige Kolonien für die Genotypisierung. Identifizieren Sie mindestens drei unabhängige Knockout-Einzelzellkolonielinien für jeden Ziel-Mikro-RNA-Locus.
Behalten Sie einzelne Wildtyp-Linien als Steuerelemente bei. Resuspendiert wurde das Zellpellet in vier Mikrolitern fünf X-DNA-Polymerase-Puffer, einem Mikroliter Proteinase K, einem Mikroliter RNase A und nukleasefreiem Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 20 Mikrolitern. Läuse die Zellen im Thermocycler bei 56 Grad Celsius für 30 Minuten und 96 Grad Celsius für fünf Minuten.
Lagern Sie die Zelllysate bei minus 20 Grad Celsius, bis sie für die PCR-Genotypisierung bereit sind. Führen Sie eine PCR-Genotypisierungsreaktion mit den entworfenen PCR-Primern durch, die die Guide-RNA an fünf primären und drei primären Guide-RNA-Zielstellen flankieren. Führen Sie die PCR-Reaktion in einem Thermocycler mit dem im Textmanuskript genannten Programm durch.
Laden Sie die PCR-Produkte auf ein 1%Agarose-Gel für die Elektrophorese-Analyse. Extrahieren Sie DNA aus den isolierten PCR-Fragmenten der vorhergesagten Molekülgröße für die Knockout-Genotypen. Bereiten Sie die Proben für die DNA-Sequenzierung vor.
Überprüfen Sie, ob die CRISPR-Reaktion erfolgreich war, und führen Sie eine DNA-Sequenzierung der isolierten PCR-Fragmente durch, um die Cas9-Spaltstelle zu identifizieren und die Deletion des Mikro-RNA-Locus zu bestätigen. Es wurden einzigartige CRISPR-RNAs entwickelt, die auf die gesamte 35-Kilo-Basen-miR-888-Clusterregion abzielen. Kleinere Clusterkombinationen innerhalb der miR-743-Familie oder der miR-891-Familie sowie micro-RNA-Deletionen.
Die Gelelektrophorese-Analyse der PCR-Reaktionen zeigte, dass die vorhergesagte DNA-Fragmentgröße, die den Knockout-Genotyp repräsentiert, für jede CRISPR-Transfektion amplifiziert wurde. Einzelzellkolonien wurden sequenziell mittels PCR genotypisiert. Die DNA-Sequenzierung dieser isolierten Knockout-PCR-Fragmente bestätigte, dass die transfizierten fünf Prime- und drei Prime-Guide-RNAs die Cas9-Spaltligatur etwa drei Nukleotide stromaufwärts der PAM-Stellen steuerten und den genomischen Verlust des Ziel-Mikro-RNA-Locus validierten.
WST-1-Proliferationstests, die miR-891a-Knockout- und Wildtyp-Zellen vergleichen, bestätigen, dass die Überexpression von Mikro-RNA-mimic lentiviralen Vektoren das Wachstum von Prostatazellen induziert, und daher wurde vorhergesagt, dass miR-891 a Verlust Wechselwirkungen zeigen würde. Neben einem sorgfältigen Führungs-RNA-Design ist es wichtig, schnell einzelne Zellkolonien durch jede Mikro-RNA-Knockout-Linie zu erzeugen. Es ist besonders relevant, wenn die Mikro-RNA-Knockout-Zellen das Wachstum der Lebensfähigkeit reduziert haben und in gemischten Populationen mit Wildtyp-Zellen leicht überholt werden würden.
Zusätzliche Methoden wie quantitative realtime PCR, Northern Blot und RNA-Sequenzierung sollten durchgeführt werden, um zu bestätigen, dass die CRISPR-Knockout-Zelllinien keine reife Mikro-RNA für den gelöschten Locus exprimieren.
