Ce protocole utilise un flux de travail d’édition de gènes CRISPR à haut débit pour disséquer moléculairement des gènes de micro-ARN organisés et groupés unités. Et de déterminer comment ces réseaux d’ARN non codants coordonnent les voies de progression du cancer. Cette procédure d’édition de gènes CRISPR permet à l’investigateur de générer rapidement un panel complet de lignées cellulaires portant des combinaisons uniques de délétion de groupes de micro-ARN tout en évitant le sous-clonage de vecteurs d’ADN fastidieux.
Cette méthode permettra de mieux comprendre comment les micro-ARN groupés fonctionnent en coopération pour réguler la croissance tumorale, l’agressivité et la résistance aux médicaments avant de traduire les micro-ARN en clinique en tant qu’outils thérapeutiques et diagnostiques. La démonstration de la procédure sera assurée par Grace Yi, assistante de recherche dans mon laboratoire. Pour commencer, créez un fichier ADN contenant la séquence génomique complète de la région d’annotation de micro-ARN d’intérêt dans au moins un kilo-octet de régions génomiques environnantes à l’aide d’un logiciel d’annotation de séquence d’ADN.
Ensuite, concevez quatre ARN CRISPR uniques pour chaque locus de micro-ARN ciblé. Deux ont conçu des ARN CRISPR pour cibler immédiatement les séquences d’ADN complémentaires cinq premiers du groupe d’épingles à cheveux micro-ARN et deux ont conçu des ARN CRISPR pour cibler immédiatement les séquences d’ADN complémentaires trois premiers du groupe d’épingles à cheveux micro-ARN. Utilisez un outil d’édition de caractéristiques dans le fichier ADN créé pour marquer la séquence cible d’ADN pour chaque ARN CRISPR conçu à synthétiser.
Conception et synthèse d’amorces de PCR flanquant les régions cibles des amas de micro-ARN pour le génotypage des lignées cellulaires CRISPR. Effectuer une courbe de concentration de doxycycline sur des lignées cellulaires Cas9 inductibles par lenti nouvellement générées afin de déterminer les conditions optimales pour l’induction de la protéine Cas9. Plaquer cinq fois 10 des cellules de la quatrième par puits de chaque plaque de six puits et croître à 37 degrés Celsius, 5% de dioxyde de carbone, dans le milieu préféré pendant 24 heures.
Diluer le dox dans le milieu préféré avec une courbe finale de concentration en dox allant de 0 5100, 150, 250 à 500 nanogrammes par millilitre. Étiquetez les puits de chaque plaque assise de six puits de un à six. Retirer le milieu et le remplacer par les concentrations dox appropriées.
Cultivez les plaques une à quatre jusqu’à 24 heures, 48 heures et 72 heures d’induction dox et 120 heures après le retrait dox . Récoltez les puits de l’assiette à chaque point temporel. Traiter les pastilles cellulaires et le tampon ripa pour l’isolation du lysat.
Effectuer une analyse par transfert Western avec 40 microgrammes de protéines pour mesurer l’induction de la protéine Cas9 et déterminer la concentration optimale de Cas9. Sur le papier, cartographiez les cinq combinaisons de paires d’ARN CRISPR premiers et les trois premiers qui seront transectées dans chaque puits d’une plaque de 24 puits ciblant l’ensemble du groupe de micro-ARN, diverses combinaisons de gènes de micro-ARN groupées, ainsi que des membres individuels du groupe de micro-ARN. Plaquer la lignée cellulaire de neuf cellules inductibles par lenti inductible à cinq fois 10 à la quatrième cellule par puits d’une plaque de 24 puits dans le milieu préféré contenant la concentration optimisée en dox.
Cultiver les cellules pendant 24 à 48 heures à 37 degrés Celsius, 5% de dioxyde de carbone pour induire l’expression de la protéine Cas9. Transfecter les cellules Cas9 lenti inductibles avec un préparé cinq ARN premiers et trois ARN guides premiers. Étiquetez quatre microtubes à centrifuger de 1,5 millilitre par locus de micro-ARN ciblé.
Dans chaque tube, mélanger un rapport molaire d’ARN traceur et d’ARN CRISPR uniques ensemble pour former le complexe d’ARN guide micromolaire. Ajouter 2,5 microlitres d’ARN traceur, 1,25 microlitre de l’ARN CRISPR positionné à cinq premiers, 1,25 microlitre de l’ARN CRISPR positionné à trois premiers et cinq microlitres de tampon tris hcl pH 7,5 millimolaires à un tube centrifuge de 1,5 millilitre. Microcentrifugeuse pendant 30 secondes à 16 000 fois G à mélanger.
Incuber à température ambiante pendant cinq minutes. A chaque tube à 40 microlitres de milieu sérique réduit à 10 microlitres de réaction complexe ARN guide. Mélanger doucement en pipetant de haut en bas.
Dans un tube centrifuge propre de 1,5 millilitre, mélanger doucement deux microlitres de réactif de transfection et 48 microlitres de milieu sérique réduit en pipetant de haut en bas. Incuber à température ambiante pendant cinq minutes. A chaque tube contenant les 50 microlitres de mélange d’ARN guide, ajouter les 50 microlitres du réactif de transfection dilué.
Pipeter le mélange lentement de haut en bas une fois pour mélanger. Incuber à température ambiante pendant 20 minutes. Ajouter 400 microlitres de milieu sans antibiotique supplémenté en doxycycline à chaque tube contenant les 100 microlitres du mélange de transfection d’ARN guide.
Pipeter doucement pour mélanger. Retirer le milieu des cellules Cas9 induites par la lenti induite par la doxycycline. Ajouter 500 microlitres de mélange de transformation d’ARN guide de doxycycline sur la base de la carte expérimentale de 24 puits.
Incuber les cellules transfectées pendant 48 heures à 37 degrés Celsius dans du dioxyde de carbone à 5%. Remplacer le milieu par le milieu fraîchement préparé sans doxycycline. Laissez les cellules récupérer pendant encore 24 à 48 heures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.
Récoltez les cellules transfectées et préparez-vous au génotypage et aux délires unicellulaires. Séparez les 150 microlitres de cellules remises en suspension en trois parties. Congeler un tiers des cellules transfectées dans un milieu plus 10% de DMSO dans des flacons cryogéniques pour un stockage à long terme.
Transférer un tiers des cellules transfectées dans un tube PCR propre de 0,2 millilitre pour le génotypage. Préparer le dernier tiers des cellules transfectées pour le comptage et la dilution dans un format de plaque de 96 puits afin de générer des colonies de cellules uniques. À l’aide d’une pipette multiple à 12 canaux et d’un réservoir de réactifs stériles, ajouter 100 microlitres de cellules diluées par puits à deux rangées de la plaque pour chaque dilution.
Attendez quatre à six semaines pour que les cellules se développent à la cofluence pour l’expansion de la colonie unicellulaire. Prélever environ 10 à 15 colonies de cellules uniques pour le génotypage. Identifier au moins trois lignées de colonies unicellulaires knockout indépendantes pour chaque locus de micro-ARN ciblé.
Conservez les lignées cellulaires uniques de type sauvage comme témoins. La pastille cellulaire a été remise en suspension dans quatre microlitres de cinq tampons d’ADN polymérase X, un microlitre de protéinase K, un microlitre de RNase A et de l’eau sans nucléase jusqu’à un volume total de 20 microlitres. Les poux des cellules du thermocycleur à 56 degrés Celsius pendant 30 minutes et à 96 degrés Celsius pendant cinq minutes.
Conservez les lysats cellulaires à moins 20 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient prêts pour le génotypage par PCR. Effectuer une réaction de génotypage PCR en utilisant les amorces PCR conçues qui flanquent les cinq sites cibles de l’ARN guide premier et les trois sites cibles de l’ARN guide premier. Exécutez la réaction PCR dans un thermocycleur en utilisant le programme mentionné dans le manuscrit du texte.
Chargez les produits PCR sur un gel d’agarose à 1% pour l’analyse par électrophorèse. Extraire l’ADN des fragments PCR isolés de la taille moléculaire prévue pour les génotypes knockout. Préparer les échantillons pour le séquençage de l’ADN.
Valider que la réaction CRISPR a réussi et effectuer le séquençage de l’ADN des fragments PCR isolés pour identifier le site de clivage Cas9 et confirmer la délétion du locus du micro-ARN. Des ARN CRISPR uniques ont été conçus pour cibler l’ensemble de la région de l’amas miR-888 de 35 kilos de bases. Des combinaisons de grappes plus petites au sein de la famille miR-743 ou de la famille miR-891 ainsi que des délétions de micro-ARN.
L’analyse par électrophorèse sur gel des réactions PCR a indiqué que la taille prédite du fragment d’ADN représentant le génotype knockout était amplifiée pour chaque transfection CRISPR. Les colonies de cellules uniques ont été génotypées par PCR dans une séquence vérifiée. Le séquençage de l’ADN de ces fragments isolés de PCR knockout a confirmé que les cinq ARN premiers transfectés et les trois ARN guides premiers dirigeaient la ligature de clivage Cas9 d’environ trois nucléotides en amont des sites PAM et validaient la perte génomique du locus de micro-ARN ciblé.
Les tests de prolifération WST-1 comparant miR-891a knockout et les cellules de type sauvage confirment que la surexpression du vecteur lentiviral mimétique micro-ARN induit la croissance des cellules de la prostate et il a donc été prédit que la perte de miR-891 présenterait des effets réciproques. Outre la conception minutieuse de l’ARN de guidage, il est important de générer rapidement des colonies de cellules uniques à travers chaque ligne knockout de micro-ARN. Il est particulièrement pertinent si les cellules knock-out du micro-ARN ont une croissance réduite de la viabilité et seraient facilement surpassées dans les populations mixtes avec des cellules de type sauvage.
Des méthodes supplémentaires telles que la PCR quantitative en temps réel, le transfert de Northern et le séquençage de l’ARN doivent être effectuées pour confirmer que les lignées cellulaires knock-out CRISPR n’expriment pas de micro-ARN mature pour le locus supprimé.
