このプロトコルは、ハイスループットCRISPR遺伝子編集ワークフローを使用して、組織化およびクラスター化されたユニットのマイクロRNA遺伝子を分子的に解剖します。そして、これらのノンコーディングRNAネットワークが癌の進行経路をどのように調整するかを決定すること。このCRISPR遺伝子編集手順により、研究者は、時間のかかるDNAベクターサブクローニングを回避しながら、独自のマイクロRNAクラスター欠失の組み合わせを持つ細胞株のパネル全体を迅速に生成できます。
この方法は、マイクロRNAを治療および診断ツールとして臨床に翻訳する前に、クラスター化されたマイクロRNAがどのように協調して腫瘍の成長、攻撃性、および薬剤耐性を調節するかをより明確に理解します。手順を実演するのは、私の研究室の研究助手であるグレース・イーです。まず、DNA配列アノテーションソフトウェアプログラムを使用して、少なくとも1キロバイトの周囲のゲノム領域における目的のマイクロRNAクラスター領域の完全なゲノム配列を含むDNAファイルを作成します。
次に、標的マイクロRNA遺伝子座ごとに4つの固有のCRISPR RNAを設計します。マイクロRNAヘアピンクラスターの5つのプライムの相補的なDNA配列を標的とする2つの設計されたCRISPR RNAと、マイクロRNAヘアピンクラスターの3つのプライムの相補的なDNA配列を標的とする2つの設計されたCRISPR RNAです。作成したDNAファイルで特徴編集ツールを使用して、合成する設計した各CRISPR RNAのDNAターゲット配列をマークします。
CRISPR細胞株をジェノタイピングするための標的マイクロRNAクラスター領域に隣接するPCRプライマーを設計および合成しました。新たに生成されたレンチ誘導性Cas9細胞株に対してドキシサイクリン濃度曲線を実行し、Cas9タンパク質誘導の最適条件を決定します。プレートは、各6ウェルプレートの1ウェルあたり10個の第4細胞を5回、摂氏37度、5%二酸化炭素で、好ましい培地中で24時間増殖させる。
0 5100、150、250〜500ナノグラム/ミリリットルの範囲の最終dox濃度曲線を有する好ましい培地でdoxを希釈する。座っている各6ウェルプレートのウェルに1から6までのラベルを付けます。培地を取り出し、適切なdox濃度と交換します。
プレートを1〜4時間、24時間、48時間、72時間のドックス誘導と120時間のドックス離脱後まで成長させます。各時点でプレートのウェルを収穫します。細胞ペレットとリパバッファーを処理して、ライセートを単離します。
40マイクログラムのタンパク質を用いてウェスタンブロット解析を行い、Cas9タンパク質誘導を測定し、最適なCas9濃度を決定します。紙の上に、マイクロRNAクラスター全体、さまざまなクラスター化されたマイクロRNA遺伝子の組み合わせ、および個々のマイクロRNAクラスターメンバーを標的とする24ウェルプレートの各ウェルにトランスセクトされる5つのプライムおよび3つのプライムCRISPR RNAペアの組み合わせをマッピングします。24穴プレートの1ウェルあたり10〜4細胞を5回で9細胞株をキャストしたレンティ誘導性プレートを、最適化されたdox濃度を含む好ましい培地でプレートする。
細胞を摂氏37度、5%二酸化炭素で24〜48時間増殖させて、Cas9タンパク質発現を誘導します。レンチ誘導性Cas9細胞に、調製した5つのプライムガイドRNAと3つのプライムガイドRNAをトランスフェクトします。標的マイクロRNA遺伝子座ごとに4本の1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブにラベルを付けます。
各チューブで、トレーサーRNAと固有のCRISPR RNAのモル比を1対1で混合して、2つのマイクロモルガイドRNA複合体を形成します。2.5マイクロリットルのトレーサーRNA、1.25マイクロリットルの5つのプライムポジショニングCRISPR RNA、1.25マイクロリットルの3つのプライムポジショニングCRISPR RNA、および5マイクロリットルの10ミリモルトリスHCL pH 7.5バッファーを1.5ミリリットルの遠沈管に加えます。マイクロ遠心分離機で 16, 000 倍の G で 30 秒間混合します。
室温で5分間インキュベートします。40マイクロリットルの還元血清培地で各チューブに10マイクロリットルのガイドRNA複合体反応させた。上下にピペッティングして穏やかに混ぜます。
清潔な1.5ミリリットルの遠沈管で、2マイクロリットルのトランスフェクション試薬と48マイクロリットルの還元血清培地を上下にピペッティングして穏やかに混合します。室温で5分間インキュベートします。50マイクロリットルのガイドRNAミックスを含む各チューブに、50マイクロリットルの希釈トランスフェクション試薬を加えます。
混合物をゆっくりと上下に一度ピペットで混ぜます。室温で20分間インキュベートします。100マイクロリットルのガイドRNAトランスフェクションミックスを含む各チューブに、ドキシサイクリンを添加した400マイクロリットルの抗生物質フリー培地を追加します。
ピペットでやさしく混ぜます。ドキシサイクリン誘導レンチ誘導性Cas9細胞から培地を除去します。24ウェルプレート実験マップに基づいて、500マイクロリットルの培地ドキシサイクリンガイドRNA変換ミックスを追加します。
トランスフェクトした細胞を摂氏37度の5%二酸化炭素中で48時間インキュベートします。培地をドキシサイクリンを含まない新しく調製した培地と交換する。細胞が摂氏24度と48%の二酸化炭素でさらに37〜5時間回復するのを待ちます。
トランスフェクトされた細胞を回収し、ジェノタイピングと単一細胞の妄想に備えます。150マイクロリットルの再懸濁セルを3つの部分に分けます。トランスフェクトした細胞の3分の1を培地と10%DMSOで凍結し、クライオバイアルに入れて長期保存します。
トランスフェクトした細胞の3分の1を、ジェノタイピングのためにきれいな0.2ミリリットルのPCRチューブに移します。トランスフェクトした細胞の最後の3分の1を計数および96ウェルプレートフォーマットで希釈して調製し、単一細胞コロニーを生成します。12チャンネルのマルチピペッターと滅菌試薬リザーバーを使用して、希釈ごとにウェルあたり100マイクロリットルの希釈細胞を2列のプレートに追加します。
細胞が単一細胞コロニーの増殖のために共流に成長するまで4〜6週間待ちます。ジェノタイピングのために約10〜15個の単一細胞コロニーを収集します。標的マイクロRNA遺伝子座ごとに少なくとも3つの独立したノックアウトシングルセルコロニー株を同定します。
野生型単一細胞株をコントロールとして保持します。細胞ペレットを4マイクロリットルの5つのX DNAポリメラーゼバッファー、1マイクロリットルのプロテイナーゼK、1マイクロリットルのRNase A、およびヌクレアーゼフリーウォーターに合計20マイクロリットルまで再懸濁します。サーモサイクラーの細胞を摂氏56度で30分間、摂氏96度で5分間シラミを刺します。
細胞ライセートは、PCRジェノタイピングの準備ができるまで摂氏マイナス20度で保存します。ガイドRNAの5つのプライムおよび3つのプライムガイドRNA標的部位に隣接するように設計されたPCRプライマーを使用して、PCRジェノタイピング反応を実行します。テキスト原稿に記載されているプログラムを使用して、サーモサイクラーでPCR反応を実行します。
PCR産物を電気泳動分析用の1%アガロースゲルにロードします。ノックアウト遺伝子型の予測分子サイズの単離されたPCRフラグメントからDNAを抽出します。DNAシーケンシング用のサンプルを準備します。
CRISPR反応が成功したことを検証し、単離されたPCR断片のDNAシーケンシングを実行して、Cas9切断部位を特定し、マイクロRNA遺伝子座の欠失を確認します。独自のCRISPR RNAは、miR-888クラスター領域の35キロ塩基全体を標的として設計されました。miR-743ファミリーまたはmiR-891ファミリー内のより小さなクラスターの組み合わせ、およびマイクロRNA欠失。
PCR反応のゲル電気泳動分析は、ノックアウト遺伝子型を表す予測DNA断片サイズが各CRISPRトランスフェクションで増幅されることを示しました。単一細胞コロニーは、配列検証中のPCRによって遺伝子型決定された。これらの単離されたノックアウトPCRフラグメントのDNAシーケンシングにより、トランスフェクトされた5つのプライムおよび3つのプライムガイドRNAが、PAMサイトの約3ヌクレオチド上流にCas9切断ライゲーションを指示し、標的マイクロRNA遺伝子座のゲノム喪失を検証したことを確認しました。
miR-891aノックアウト細胞と野生型細胞を比較するWST-1増殖アッセイは、マイクロRNA模倣レンチウイルスベクターの過剰発現が前立腺細胞増殖を誘導することを確認し、したがってmiR-891の損失が相互効果を示すと予測された。慎重なガイドRNA設計に加えて、各マイクロRNAノックアウトラインを介して単一細胞コロニーを迅速に生成することが重要です。マイクロRNAノックアウト細胞が生存率の増殖を低下させ、野生型細胞との混合集団で容易に競合する場合に特に重要です。
定量的リアルタイムPCR、ノーザンブロット、RNAシーケンシングなどの追加の方法を実行して、CRISPRノックアウト細胞株が欠失遺伝子座の成熟マイクロRNAを発現しないことを確認する必要があります。
