Name: perfusion and inflation of the mouse lung for tumor histology
Uploaded: 2020-08-06T15:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Perfusion and Inflation of the Mouse Lung for Tumor Histology at JoVE.com

Bu yayında bildirilen araştırmalar, Ul1TR003096 (MDE), Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü Akciğer Hastalıkları Eğitim Programı 5T32HL134640 (MLD) ödül numarası altında Ulusal Çeviri Bilimleri İlerleyen Merkez tarafından desteklenmiştir.

Burada açıklanan tüm yöntemler Birmingham'daki Alabama Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
1. Deneysel protokol
<ol><li>Onaylı bir IACUC yöntemi kullanarak fareyi feda edin. Burada% 5 izofluran ile uyuşturulan bir farenin servikal çıkığı kullandık. Çalışma için uygun bir fare kullanın; Burada, 8 haftalık bir FVB fare kullanıyoruz</li>
	<li>Cerrahi makas kullanarak, alt karın ortasında 3,5-5 mm yatay bir kesi yapın. Daha sonra, kesiden oluşturulan küçük deliğe cerrahi makas yerleştirin ve orta orta çizgiyi farenin boynunun hemen altına dikey olarak kesin.</li>
	<li>Cildi parmaklarla geri çekin ve aksiller lenf düğümlerini inceleyin.</li>
	<li>Cerrahi makas kullanarak, karın boşluğunu açmak için 3,5 mm yanal kesi yapın ve ardından ön yönde toraksın dibine kadar kesin. Karın boşluğundaki organları inceleyin: karaciğer, dalak, böbrekler vb.</li>
	<li>Cerrahi makasın düzlüğünde veya tokmak kullanarak, diyaframı açığa çıkarmak için karaciğeri hareket ettirin. Diyaframı tümör büyümesi veya metastazları için inceleyin. Ardından, operatörün sağ tarafındaki diyaframı hafifçe kırparak genişlemesini sağlar. Torasik boşluğu ve akciğerleri açığa çıkarmak için diyaframı sağdan sola doğru yavaşça kesin. Akciğerleri kesmemeye dikkat edin.</li>
	<li>Akciğerlerin sol lobunun incelenmesi için sol göğüs kafesinin lateral aşırı (operatörün sağında) kesilmiştir.</li>
	<li>Akciğerin sağ loblarını yavaşça hareket ettirin ve sağ göğüs kafesinin yanal aşırısını kesin ve göğüs kafesini çıkarın. NOT: Göğüs kafesinin çıkarılması isteğe bağlıdır, ancak çıkarılması daha sonraki akciğer enflasyonunun daha net görülmesini sağlar.<ol>
<li>Taze veya donmuş akciğer dokusu gerekiyorsa, sol lobun bronşlarını sıkıştırmak için hemostat tokadı kullanın ve perfüzyondan önce cerrahi makas kullanarak sol akciğeri resect.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nefes nefesini kaplayan dokuyu kaldırmak için tokmakları kullanmak, fazla dokuları kesmek. Daha sonra solunum yolunu açığa çıkarmak için nefes borusuna astarlı ince dokuyu hafifçe kesin.</li>
	<li>Böbrek atardamarını cerrahi makasla kesin.</li>
	<li>Akciğerleri boğmak için, kalbin sağ ventrikülüne 10 U/mL heparin ile 1x PBS enjekte etmek için 22 G iğneli 3 mL şırınga kullanın. PBS/heparin ile akciğerleri yaklaşık 300 μL/s'de yavaşça perfuse edin. Akciğerler sık sık beyaza döner. Bu adımda genellikle 2,5 mL PBS kullanılır.</li>
	<li>Akciğer şişirme için, bu kez nefes borusuna paralel tutulan 22 G iğneli 3 mL şırınga kullanın. İğneyi nefes borusuna yerleştirin ve akciğerler tamamen şişirilene kadar ~200 μL/sn'den büyük olmayan akış hızıyla% 10 formalin enjekte edin. Akciğerler şişirildikten sonra formalin nefes borusundan geri akacak. İğneyi birkaç saniye daha yerinde tutun ve geri çekin.<ol>
<li>(İsteğe bağlı) İğne ve akciğer şişirme geri çekilmeden önce, nefes borusu bağlamak için dikiş ipliği kullanın. Bunu başarmak için, ipliğin noktasını küçük bir çift asa ile tutan 4 inç dikiş ipliği kullanın. İpliği nefes borusunun dorsal tarafına yerleştirin ve iğnenin etrafında bir halka yapmak için çekin. Sonra iğnenin etrafında bir el düğümü yapın. Düğümü sıkıca çekin, iğneyi nefes borusundan çıkarın, düğümü kapatın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kalbi kaldırmak için tokmak kullanın, doğrudan akciğerlerin arkasına cerrahi makas yerleştirin ve kalbi akciğerleri resect etmek için kaldırırken bağ dokusunu kesin.</li>
	<li>Kalbi kesip akciğerlerden alın.</li>
	<li>Akciğerlere fare kimliği veya çalışma kimliği ile etiketlenmiş bir kaset yerleştirin. Akciğerler istenirse bir yıldan fazla bir süre sabitlenebilir.</li>
	<li>Akciğerleri içeren kaseti% 70 etanol'e aktarın ve histoloji için işlemeye devam edin.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hsia, C. C., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R., Structure, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+official+research+policy+statement+of+the+American+Thoracic+Society/European+Respiratory+Society:+standards+for+quantitative+assessment+of+lung+structure.">An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: standards for quantitative assessment of lung structure.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 394-418 (2010).</li><li>Vasilescu, D. M., Knudsen, L., Ochs, M., Weibel, E. R., Hoffman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+murine+lung+preparation+for+detailed+structural+evaluation+via+micro-computed+tomography.">Optimized murine lung preparation for detailed structural evaluation via micro-computed tomography.</a> Journal of Applied Physiology. 112 (1), 159-166 (2012).</li><li>Blumler, P., Acosta, R. H., Thomas-Semm, A., Reuss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+fixation+for+the+preservation+of+air+spaces.">Lung fixation for the preservation of air spaces.</a> Experimental Lung Research. 30 (1), 73-82 (2004).</li><li>Oldmixon, E. H., Suzuki, S., Butler, J. P., Hoppin, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion+dehydration+fixes+elastin+and+preserves+lung+air-space+dimensions.">Perfusion dehydration fixes elastin and preserves lung air-space dimensions.</a> Journal of Applied Physiology. 58 (1), 105-113 (1985).</li><li>Braber, S., Verheijden, K. A., Henricks, P. A., Kraneveld, A. D., Folkerts, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+fixation+methods+on+lung+morphology+in+a+murine+model+of+emphysema.">A comparison of fixation methods on lung morphology in a murine model of emphysema.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 299 (6), 843-851 (2010).</li><li>Renne, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendation+of+optimal+method+for+formalin+fixation+of+rodent+lungs+in+routine+toxicology+studies.">Recommendation of optimal method for formalin fixation of rodent lungs in routine toxicology studies.</a> Toxicologic Pathology. 29 (5), 587-589 (2001).</li><li>Limjunyawong, N., Mock, J., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instillation+and+Fixation+Methods+Useful+in+Mouse+Lung+Cancer+Research.">Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research.</a> Journal of Visualized Experiments. (102), e52964 (2015).</li><li>Lum, H., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+10%+formalin+fixation+on+fixed+lung+volume+and+lung+tissue+shrinkage.+A+comparison+of+eleven+laboratory+species.">Effects of 10% formalin fixation on fixed lung volume and lung tissue shrinkage. A comparison of eleven laboratory species.</a> American Review of Respiratory Disease. 132 (5), 1078-1083 (1985).</li><li>Edmonds, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-31+initiates+lung+tumorigenesis+and+promotes+mutant+KRAS-driven+lung+cancer.">MicroRNA-31 initiates lung tumorigenesis and promotes mutant KRAS-driven lung cancer.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (1), 349-364 (2016).</li><li>Zhao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wogonin+suppresses+melanoma+cell+B16-F10+invasion+and+migration+by+inhibiting+Ras-medicated+pathways.">Wogonin suppresses melanoma cell B16-F10 invasion and migration by inhibiting Ras-medicated pathways.</a> PLoS One. 9 (9), 106458 (2014).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Fare akciğerlerinin perfüzyonu, enflasyonu ve fiksasyonu için yukarıda açıklanan prosedür, akciğer tümörü histolojisi ve patoloji analizi için fare akciğerlerinin hızlı ve verimli bir şekilde hazırlanması için idealdir. Prosedür herhangi bir özel ekipman gerektirmez ve fare başına 6 dakikadan daha kısa bir sürede gerçekleştirilebilir. Prosedür, enflasyon veya sabit sıvı basıncı için sabit bir hacim gerektirmez. Bu işlem standart hale getirmediği için akciğerin stereolojik veya morfometrik analizlerini yapmak isteyenler için önerilmez. Bu tür standardizasyonun gerekli olduğu prosedürler daha iyi tanımlanmıştır1,7.
Bu protokolün en kritik adımları perfüzyon ve enflasyondur. Kalbin sağ ventrikülünden perfüzyon yapmak önemlidir, oysa perfüzyon sol ventrikülden yapılırsa akciğerler perfüzyon yapmaz. Akciğerler beyazlayacağı için perfüzyonun doğru yapılıp yapılmadığını söylemek kolaydır. Trakea yoluyla fiksatifin aşılanması, akciğer mimarisinin daha kolay aşağı akış histolojik analizini sağlayan akciğerlerin enflasyonuna izin verir. Aşırı enflasyon alveolar duvar kırılmasına ve amfizem görünümüne neden olabileceğinden, akciğerler tamamen genişler genişlemez fiksatifin yönetimini durdurmak önemlidir. Akciğerler şişirildikten sonra, bazı formalinler nefes borusundan geri akacak. Bu normaldir ve aşağı akış histolojik analizini etkilemez; ancak, bu bir endişe ise, nefes borusu akciğerleri çıkarmadan önce bağlanabilir.
Bu protokol akciğerleri düzeltmek için% 10 tamponlu formalin kullanırken, en sık önerilen fiksatif5,6, bu fiksatif, yani akciğer dokusunun büzülmesi tarafından tanıtılan eserler raporlarıvardır 1,8. Bu bir endişe ise, akciğer yapısının değerlendirilmesi için Amerikan Toraks Derneği ve Avrupa Solunum Derneği'nin yönergelerine uyun1. Yaygın olarak tavsiye edilmeyen ancak yararlı olabilecek bir başka potansiyel fiksatif bouin çözeltisi, akciğer yüzey nodüllerinin değerlendirilmesi için daha iyi kontrast sağlayabilir9,10. Özetle, burada açıklanan protokol, tümör histolojisi için fare akciğerlerinin sabitlenmesi için sağlam ve basit bir yöntem sunmaktadır.

Akciğer onkogenezi ve akciğere kanser metastazının çeşitli fare modelleri, karmaşık GEMM'lerden kanserojen kaynaklı modellere, kanser hücrelerinin intrakardiyak, intratorasik, kuyruk damarı veya akciğer içinde tümör oluşturmak için diğer yöntemlerle enjekte edildiği singeneik ve ksinograft modellerine kadar çeşitli vardır. Tüm bu modeller akciğer histolojisi ve patolojisinin histolojik değerlendirmesi için ortak ihtiyacı paylaşsa. Bu nedenle, fazla kanı çıkarmak için akciğerlere perfüzyon yaparken farelerin nekropsilerini yapmak ve akciğer mimarisini net bir şekilde görselleştirmek için akciğerleri şişirmek ve sabitlemek için sağlam ama hızlı bir yönteme sahip olmak gerekir. Hız, akciğerleri tek bir zaman noktasında düzinelerce fareden toplamak gerekebileceğinden, bu prosedürün kritik bir bileşenidir. Bu yordam fare başına 6 dakikadan daha kısa bir sürede gerçekleştirilebilir.
Bu işlem tümör histolojisini değerlendirmek için fazlasıyla yeterli olmakla birlikte, akciğerlerin stereoloji veya morfometrik ölçümlerini yapmak isteyenler için önerilmez. Bu tür ölçümler, akciğerin mutlak yüzey alanının, mutlak hacminin ve alveolar boyutunun ve1sayısının hesaplanmasında olduğu gibi akciğer enflasyonunun standartlaştırılmasını gerektirir. Bu yöntem bazı görüntüleme yaklaşımları için de en uygun değildir. Örneğin, ex vivo morfometrik analiz için akciğerlerin μCT ile görüntülenmesi, akciğerlerin hava2ile dolu kalmasını gerektirir. Hava alanlarının ve boyutlarının korunması birincil endişe kaynağı olduğunda, akciğerlerin perfüzyon dehidrasyon teknikleri ile düzeltilmesi önerilir3,4. Bu modelin en büyük endişelerinden biri, amfizem çalışmalarında kullanımını azaltarak alveolar duvarların yırtılma potansiyelidir; bununla birlikte, amfizem çalışması için akciğerlerin sabitlenmesi için önerilen prosedür hala oldukça benzerdir, çünkü akciğerlerin sürekli sıvı basıncı altında % 10 formalin intratraseral aşılama (burada açıklanan protokole benzer) veya yerinde fiksasyon5ile sabitlenmesi önerilir.
Burada açıklanan prosedürün avantajı, sürekli sıvı basıncı gerektirmemesi, bunun yerine akciğerleri tamamen genişleyene kadar şişirmesi ve böylece işlem için gereken süreyi azaltmasıdır. Burada açıklanan prosedür, toksikoloji çalışmaları için en iyi akciğer fiksasyon yöntemlerini önermek için bir alt komitenin oluşturulduğu Toksikoloji Patoloji Derneği'nin bir silahlanma armamentariumunun önerdiği yöntemlere yakından benzemektedir. Bu alt komitedeki bilim adamlarının çoğunluğu, akciğerin fiksatif6'dabırakıldığı zaman farklı öneriler olmasına rağmen, akciğerlerin bir şırınna ile intratrakial aşılama ile sabitlenmesini önerdi. Bu nedenle, akciğer şişirme ve fiksasyon çeşitli yöntemler mevcut iken, burada açıklanan yöntem hızlı bir şekilde şişirmek ve downstream tümör histolojik değerlendirme için akciğerleri düzeltmek için en uygun yöntem olarak önerilmiştir.

<table><tbody><tr><td>10% buffered formalin</td><td>Fisher</td><td>23-245685</td><td></td></tr><tr><td>22 G Needle</td><td>BD</td><td>305155</td><td></td></tr><tr><td>3 mL syringe</td><td>BD</td><td>309656</td><td></td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td>Decon</td><td>2405</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-8595</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Fisher</td><td>H19</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>Surgical scissors</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-8428</td><td></td></tr></tbody></table>

perfusion and inflation of the mouse lung for tumor histology

Akciğer histolojisini değerlendirme yeteneği akciğer kanseri araştırmaları ve kanser metastazı alanları için kritik öneme sahiptir. Temin edilen dokuların kalitesinden ödün vermeden çalışmalardan hızlı ve verimli bir şekilde nekropsi yapılması da aynı derecede önemlidir. Bu protokolün amacı, aşağı akış histolojik analizi için fare akciğerlerini hızla boğmak, şişirmek ve düzeltmek için bir yöntem sunmaktır. Bu yöntem akciğer enflasyonuna standardize etmez; bu nedenle, herhangi bir özel prosedür veya ekipman gerektirmez ve bunun yerine kalpten perfüzyonu takiben doğrudan trakea yoluyla fiksatif aşılar. Bu, tümör büyüklüğü, histolojisi ve puanlamasının yeterli tahminini sağlar. Bu aynı zamanda akciğer dokusu fiksasyonundan önce donmuş dokunun toplanmasına izin verir. Bu yöntem, akciğerin daha sonra morfometrik niceliğine izin vermediği için sınırlıdır; ancak genetik olarak tasarlanmış fare modelleri (GEMM'ler), singeneik modellerin yanı sıra ksinograft tümör ve metastaz çalışmalarından akciğer tümörü analizi için fazlasıyla yeterlidir.

Yukarıdaki protokol, fare akciğerlerinin hızlı perfüzyonunu, enflasyonuna ve sabitlenmesine izin verir. Aşağıda gösterilen rakamlar her adımın önemini temsil eder. Şekil 1' de PBS ile perfüzyona uğramış H&E lekeli akciğerler ve perfüzyon adımının atladığı veya akciğerlerin doğru şekilde perfüzyona maruz kalmadığı akciğerler tasvir edilmiştir. Gösterildiği gibi, zayıf perfüzyonlu akciğerlerdeki fazla kan ideal histolojiden daha az oluşturur ve akciğer mimarisini tam olarak gözlemlemeyi zorlaştırır. Şekil 2 hem enflasyonun önemini hem de aşırı enflasyonun tehlikelerini göstermektedir. Alveollerin sıkışması ve yakınlığı nedeniyle şişirilmemiş akciğerlerde hiperplazi alanlarını tanımlamak daha zordur; bununla birlikte, aşırı şişirilmiş akciğerlerde, alveolar duvarların çoğu kırılmıştır ve dikkatli değilse bu amfizem ile karıştırılabilir. Şekil 3'te burada açıklanan teknik kullanılarak perfüzyona maruz kalan ve şişirilen akciğerlerdeki tümör histolojisi tasvir edilmiştir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60605/60605fig01.jpg"> Şekil 1: Perfüzyonlu ve perfüzyonsuz akciğerlerin temsili H&E lekesi. (A) PBS ile perfüzyona maruz akciğerler. (B) Akciğerler perfüzyona maruz değildir. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/60605/60605fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60605/60605fig02.jpg"> Şekil 2: Şişirilmiş, şişirilmemiş ve aşırı şişirilmiş akciğerlerin temsili H&E lekesi. (A) Akciğerler tamamen genişleyene kadar %10 formalin ile şişirildi ve sabitlendi. (B) Akciğerler trakeadan şişirilmedi ve bunun yerine doğrudan% 10 formalin içine yerleştirildi. (C) Akciğerler % 10 formalin ile şişirildi ve sabitlendi, ancak% 10 formalin sürekli olarak tam genişlemeden geçerek akciğerlere itildi ve bu da aşırı enflasyonla sonuçlandı. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/60605/60605fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60605/60605fig03.jpg"> Şekil 3: Perfüzyonlu ve şişirilmiş fare akciğerlerinin temsili H&E lekesi. (A) Akciğer tümörleri kimyasal kanserojen üretan kullanılarak indüklendi. (B) İnsan ksinografted hücre hattından spontan akciğer metastazları <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/60605/60605fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Perfusion and Inflation of the Mouse Lung for Tumor Histology at JoVE.com

Perfusion and Inflation of the Mouse Lung for Tumor Histology

Bu yöntemin amacı, akciğer tümörü patolojisinin incelenmesi ve akciğere metastazların değerlendirilmesi için fare akciğerlerinin perfüzyonu, enflasyonu ve fiksasyonu için basit ve verimli bir yöntem sunmaktır.

Tümör Histolojisi için Fare Akciğerinin Perfüzyonu ve Enflasyonu

The ability to evaluate lung histology is critical for the fields of lung cancer research and cancer metastasis. It is equally important to perform ...

perfusion-and-inflation-of-the-mouse-lung-for-tumor-histology

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Cancer Research

18.2K Görüntüleme.  University of Alabama at Birmingham. Bu yöntemin amacı, akciğer tümörü patolojisinin incelenmesi ve akciğere metastazların değerlendirilmesi için fare akciğerlerinin perfüzyonu, enflasyonu ve fiksasyonu için basit ve verimli bir yöntem sunmaktır.

Video: Perfusion and Inflation of the Mouse Lung for Tumor Histology

Long-term High-Resolution Intravital Microscopy in the Lung with a Vacuum Stabilized Imaging Window

Metastasis to secondary sites such as the lung, liver and bone is a traumatic event with a mortality rate of approximately 90% 1. Of these sites, the lung is the most difficult to assess using intravital optical imaging due to its enclosed position within the body, delicate nature and vital role in sustaining proper physiology. While clinical modalities (positron emission tomography (PET), magnetic resonance imaging (MRI) and computed tomography (CT)) are capable of providing noninvasive images of this tissue, they lack the resolution necessary to visualize the earliest seeding events, with a single pixel consisting of nearly a thousand cells. Current models of metastatic lung seeding postulate that events just after a tumor cell&#39;s arrival are deterministic for survival and subsequent growth. This means that real-time intravital imaging tools with single cell resolution 2 are required in order to define the phenotypes of the seeding cells and test these models. While high resolution optical imaging of the lung has been performed using various ex vivo preparations, these experiments are typically single time-point assays and are susceptible to artifacts and possible erroneous conclusions due to the dramatically altered environment (temperature, profusion, cytokines, etc.) resulting from removal from the chest cavity and circulatory system 3. Recent work has shown that time-lapse intravital optical imaging of the intact lung is possible using a vacuum stabilized imaging window 2,4,5 however, typical imaging times have been limited to approximately 6 hr. Here we describe a protocol for performing long-term intravital time-lapse imaging of the lung utilizing such a window over a period of 12 hr. The time-lapse image sequences obtained using this method enable visualization and quantitation of cell-cell interactions, membrane dynamics and vascular perfusion in the lung. We further describe an image processing technique that gives an unprecedentedly clear view of the lung microvasculature.

This protocol describes the use of multiphoton microscopy to perform long-term high-resolution, single cell imaging of the intact lung in real time using a vacuum stabilized imaging window.

Bir Vakum Stabilize Görüntüleme Penceresi ile Akciğer uzun vadeli Yüksek Çözünürlüklü Intravital Mikroskopi

Metastasis to secondary sites such as the lung, liver and bone is a traumatic event with a mortality rate of approximately 90% 1. Of these sites, the lung ...

Kanser Araştırmaları

Utilizing 18F-FDG PET/CT Imaging and Quantitative Histology to Measure Dynamic Changes in the Glucose Metabolism in Mouse Models of Lung Cancer

A hallmark of advanced tumors is a switch to aerobic glycolysis that is readily measured by [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose positron emission tomography (18F-FDG PET) imaging. Co-mutations in the KRAS proto-oncogene and the LKB1 tumor suppressor gene are frequent events in lung cancer that drive hypermetabolic, glycolytic tumor growth. A critical pathway regulating the growth and metabolism of these tumors is the mechanistic target of the rapamycin (mTOR) pathway, which can be effectively targeted using selective catalytic mTOR kinase inhibitors. The mTOR inhibitor MLN0128 suppresses glycolysis in mice bearing tumors with Kras and Lkb1 co-mutations, referred to as KL mice. The therapy response in KL mice is first measured by 18F-FDG PET and computed tomography (CT) imaging before and after the delivery of MLN0128. By utilizing 18F-FDG PET/CT, researchers are able to measure dynamic changes in the glucose metabolism in genetically engineered mouse models (GEMMs) of lung cancer following a therapeutic intervention with targeted therapies. This is followed by ex vivo autoradiography and a quantitative immunohistochemical (qIHC) analysis using morphometric software. The use of qIHC enables the detection and quantification of distinct changes in the biomarker profiles following treatment as well as the characterization of distinct tumor pathologies. The coupling of PET imaging to quantitative histology is an effective strategy to identify metabolic and therapeutic responses in vivo in mouse models of disease.

Utilizing 18F-FDG PET/CT Imaging and Quantitative Histology to Measure Dynamic Changes in the Glucose Metabolism in Mouse Models of Lung Cancer

In this protocol, we describe how to utilize [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose positron emission tomography and computed tomography (18F-FDG PET/CT) imaging to measure the tumor metabolic response to the targeted therapy MLN0128 in a Kras/Lkb1 mutant mouse model of lung cancer and coupled imaging with high resolution ex vivo autoradiography and quantitative histology.

18F-FDG PET/BT görüntüleme ve nicel Histoloji glikoz metabolizması akciğer kanserinin fare modellerinde dinamik değişiklikleri ölçmek için kullanmak

A hallmark of advanced tumors is a switch to aerobic glycolysis that is readily measured by [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose positron emission tomography ...

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of micrometastases by radiologic imaging and the success in their therapeutic eradication remain limited.
While animal models have proven to be invaluable tools for cancer research1, the monitoring/visualization of micrometastases remains a challenge and inaccurate evaluation of metastatic spread in preclinical studies potentially leads to disappointing results in clinical trials2. Consequently, there is great interest in refining the methods to finally allow reproducible and reliable detection of metastases down to the single cell level in normal tissue. The main focus therefore is on techniques, which allow the detection of tumor cells in vivo, like micro-computer tomography (micro-CT), positron emission tomography (PET), bioluminescence or fluorescence imaging3,4. We are currently optimizing these techniques for in vivo monitoring of primary tumor growth and metastasis in different osteosarcoma models. Some of these techniques can also be used for ex vivo analysis of metastasis beside classical methods like qPCR5, FACS6 or different types of histological staining. As a benchmark, we have established in the present study the stable transfection or transduction of tumor cells with the lacZ gene encoding the bacterial enzyme &beta;-galactosidase that metabolizes the chromogenic substrate 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside (X-Gal) to an insoluble indigo blue dye7 and allows highly sensitive and selective histochemical blue staining of tumor cells in mouse tissue ex vivo down to the single cell level as shown here. This is a low-cost and not equipment-intensive tool, which allows precise validation of metastasis8 in studies assessing new anticancer therapies9-11. A limiting factor of X-gal staining is the low contrast to e.g. blood-related red staining of well vascularized tissues. In lung tissue this problem can be solved by in-situ lung perfusion, a technique that was recently established by Borsig et al.12 who perfused the lungs of mice under anesthesia to clear them from blood and to fix and embed them in-situ under inflation through the trachea. This method prevents also the collapse of the lung and thereby maintains the morphology of functional lung alveoli, which improves the quality of the tissue for histological analysis. In the present study, we describe a new protocol, which takes advantage of a combination of X-gal staining of lacZ-expressing tumor cells and in-situ perfusion and fixation of lung tissue. This refined protocol allows high-sensitivity detection of single metastatic cells in the lung and enabled us in a recent study to detect "dormant" lung micrometastases in a mouse model13, which was originally described to be non-metastatic14.

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

The novel protocol reported in the present study allows selective detection of lung metastases at single cell resolution in mice by combined in-situ lung perfusion and fixation and X-Gal staining of lacZ-tagged tumor cells.

Kombine tarafından Farelerde Tek Hücre çözünürlükte Akciğer Metastaz Geliştirilmiş Görselleştirme<em&gt; In-situ</emAkciğer Doku ve X-Gal Boyanma&gt; Perfüzyon<em&gt; LacZ</em&gt;-Tagged Tümör Hücreleri

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of ...

Tıp

A Standardized Method for Measuring Internal Lung Surface Area via Mouse Pneumonectomy and Prosthesis Implantation

Pulmonary morphology, physiology, and respiratory functions change in both physiological and pathological conditions. Internal lung surface area (ISA), representing the gas-exchange capacity of the lung, is a critical criterion to assess respiratory function. However, observer bias can significantly influence measured values for lung morphological parameters. The protocol that we describe here minimizes variations during measurements of two morphological parameters used for ISA calculation: internal lung volume (ILV) and mean linear intercept (MLI). Using ISA as a morphometric and functional parameter to determine the outcome of alveolar regeneration in both pneumonectomy (PNX) and prosthesis implantation mouse models, we found that the increased ISA following PNX treatment was significantly blocked by implantation of a prosthesis into the thoracic cavity1. The ability to accurately quantify ISA is not only expected to improve the reliability and reproducibility of lung function studies in injured-induced alveolar regeneration models, but also to promote mechanistic discoveries of multiple pulmonary diseases.

Internal lung surface area (ISA) is a critical criterion for assessing lung morphology and physiology in lung diseases and injury-induced alveolar regeneration. We describe here a standardized method that can minimize the measurement bias for ISA in both lung pneumonectomy and prosthesis implantation mouse models.

Fare Pnömonektomi ve Protez İmplantasyonu ile İç Akciğer Yüzey Alanının Ölçümü için Standart Bir Yöntem

Pulmonary morphology, physiology, and respiratory functions change in both physiological and pathological conditions. Internal lung surface area (ISA), ...

Gelişim Biyolojisi

Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research

The ability to instill live agents, cells, or chemicals directly into the lung without injuring or killing the mice is an important tool in lung cancer research. Although there are a number of methods that have been published showing how to intubate mice for pulmonary function measurements, none are without potential problems for rapid tracheal instillation in large cohorts of mice. In the present paper, a simple and quick method is described that enables an investigator to carry out such instillations in an efficient manner. The method does not require any special tools or lighting and can be learned with very little practice. It involves anesthetizing a mouse, making a small incision in the neck to visualize the trachea, and then inserting an intravenous catheter directly. The small incision is quickly closed with tissue adhesive, and the mice are allowed to recover. A skilled student or technician can do instillations at an average rate of 2 min/mouse. Once the cancer is established, there is frequently a need for quantitative histologic analysis of the lungs. Traditionally pathologists usually do not bother to standardize lung inflation during fixation, and analyses are often based on a scoring system that can be quite subjective. While this may sometime be sufficiently adequate for gross estimates of the size of a lung tumor, any proper stereological quantification of lung structure or cells requires a reproducible fixation procedure and subsequent lung volume measurement. Here we describe simple reliable procedures for both fixing the lungs under pressure and then accurately measuring the fixed lung volume. The only requirement is a laboratory balance that is accurate over a range of 1 mg&#8211;300 g. The procedures presented here thus could greatly improve the ability to create, treat, and analyze lung cancers in mice.

The goal of this paper is to describe simple methods that will greatly aid in the setup and analysis of mouse lungs with lung cancer or other pathologies. We present 3 protocols to simply and reliably carry out lung instillations, fixation, and lung volume measurements.

Fare Akciğer Kanseri Araştırma Faydalı instillation ve Fiksasyon Yöntemi

The ability to instill live agents, cells, or chemicals directly into the lung without injuring or killing the mice is an important tool in lung cancer ...

Pre-Conditioning the Airways of Mice with Bleomycin Increases the Efficiency of Orthotopic Lung Cancer Cell Engraftment

Lung cancer is a deadly treatment refractory disease that is biologically heterogeneous. To understand and effectively treat the full clinical spectrum of thoracic malignancies, additional animal models that can recapitulate diverse human lung cancer subtypes and stages are needed. Allograft or xenograft models are versatile and enable the quantification of tumorigenic capacity in vivo, using malignant cells of either murine or human origin. However, previously described methods of lung cancer cell engraftment have been performed in non-physiological sites, such as the flank of mice, due to the inefficiency of orthotopic transplantation of cells into the lungs. In this study, we describe a method to enhance orthotopic lung cancer cell engraftment by pre-conditioning the airways of mice with the fibrosis inducing agent bleomycin. As a proof-of-concept experiment, we applied this approach to engraft tumor cells of the lung adenocarcinoma subtype, obtained from either mouse or human sources, into various strains of mice. We demonstrate that injuring the airways with bleomycin prior to tumor cell injection increases the engraftment of tumor cells from 0-17% to 71-100%. Significantly, this method enhanced lung tumor incidence and subsequent outgrowth using different models and mouse strains. In addition, engrafted lung cancer cells disseminate from the lungs into relevant distant organs. Thus, we provide a protocol that can be used to establish and maintain new orthotopic models of lung cancer with limiting amounts of cells or biospecimen and to quantitatively assess the tumorigenic capacity of lung cancer cells in physiologically relevant settings.

We describe a method to significantly enhance orthotopic engraftment of lung cancer cells into the murine lungs by pre-conditioning the airways with injury. This approach may also be applied to study stromal interactions within the lung microenvironment, metastatic dissemination, lung cancer co-morbidities, and to more efficiently generate patient derived xenografts.

Bleomycin ile fareler Airways önceden Merkezi Klima Orthotopic akciğer kanseri hücre Engraftment verimliliğini artırır

Lung cancer is a deadly treatment refractory disease that is biologically heterogeneous. To understand and effectively treat the full clinical spectrum of ...

Air-Inflation of Murine Lungs with Vascular Perfusion-Fixation

Lung histology is often used to investigate the contributions provided by airspace cells during lung homeostasis and disease pathogenesis. However, commonly used instillation-based fixation methods can displace airspace cells and mucus into terminal airways and can alter tissue morphology. In comparison, vascular perfusion-fixation techniques are superior at preserving the location and morphology of cells within airspaces and the mucosal lining. However, if positive airway pressure is not simultaneously applied, regions of the lungs may collapse and capillaries may bulge into the alveolar spaces, leading to distortion of the lung anatomy. Herein, we describe an inexpensive method for air-inflation during vascular perfusion-fixation to preserve the morphology and location of airway and alveolar cells and interstitium in murine lungs for downstream histologic studies. Constant air pressure is delivered to the lungs via the trachea from a sealed, air-filled chamber that maintains pressure via an adjustable liquid column while fixative is perfused through the right ventricle.

Presented is a method for air-inflation with vascular perfusion-fixation of the lungs that preserves the location of cells within airways, alveoli and interstitium for structure-function analyses. Constant airway pressure is maintained with an air-inflation chamber while fixative is perfused via the right ventricle. Lungs are processed for histologic studies.

Vasküler Perfüzyon-Fiksasyon ile Murine Akciğerlerinin Hava-Enflasyonu

Lung histology is often used to investigate the contributions provided by airspace cells during lung homeostasis and disease pathogenesis. However, ...

Nörobilim

<meta charset="utf8"></head><body>Fare akciğer naklinde hücresel dinamiklerin gerçek zamanlı izlenmesi

Intravital Two-Photon Microscopy of the Transplanted Mouse Lung

Complications after lung transplantation are largely related to the host immune system responding to the graft. Such immune responses are regulated by crosstalk between donor and recipient cells. A better understanding of these processes relies on the use of preclinical animal models and is aided by an ability to study intra-graft immune cell trafficking in real-time. Intravital two-photon microscopy can be used to image tissues and organs for depths up to several hundred microns with minimal photodamage, which affords a great advantage over single-photon confocal microscopy. Selective use of transgenic mice with promoter-specific fluorescent protein expression and/or adoptive transfer of fluorescent dye-labeled cells during intravital two-photon microscopy allows for the dynamic study of single cells within their physiologic environment. Our group has developed a technique to stabilize mouse lungs, which has enabled us to image cellular dynamics in na&#239;ve lungs and orthotopically transplanted pulmonary grafts. This technique allows for detailed assessment of cellular behavior within the vasculature and in the interstitium, as well as for examination of interactions between various cell populations. This procedure can be readily learned and adapted to study immune mechanisms that regulate inflammatory and tolerogenic responses after lung transplantation. It can also be expanded to the study of other pathogenic pulmonary conditions.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: İntravital Görüntüleme Yoluyla Akciğer Nakli İmmünolojisini İlerletmek

Here, we present a protocol to intravitally image the transplanted mouse left lung using two-photon microscopy. This represents a valuable tool for studying cellular dynamics and interactions in real-time following murine lung transplantation.

Nakledilen Fare Akciğerinin İntravital İki Foton Mikroskobu

Complications after lung transplantation are largely related to the host immune system responding to the graft. Such immune responses are regulated by ...

Tümör Histolojisi için Fare Akciğerinin Perfüzyonu ve Enflasyonu

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Bir Vakum Stabilize Görüntüleme Penceresi ile Akciğer uzun vadeli Yüksek Çözünürlüklü Intravital Mikroskopi

¹⁸F-FDG PET/BT görüntüleme ve nicel Histoloji glikoz metabolizması akciğer kanserinin fare modellerinde dinamik değişiklikleri ölçmek için kullanmak

Kombine tarafından Farelerde Tek Hücre çözünürlükte Akciğer Metastaz Geliştirilmiş Görselleştirme

Fare Pnömonektomi ve Protez İmplantasyonu ile İç Akciğer Yüzey Alanının Ölçümü için Standart Bir Yöntem

Fare Akciğer Kanseri Araştırma Faydalı instillation ve Fiksasyon Yöntemi

Bleomycin ile fareler Airways önceden Merkezi Klima Orthotopic akciğer kanseri hücre Engraftment verimliliğini artırır

Vasküler Perfüzyon-Fiksasyon ile Murine Akciğerlerinin Hava-Enflasyonu

Nakledilen Fare Akciğerinin İntravital İki Foton Mikroskobu

Nakledilen Fare Akciğerinin İntravital İki Foton Mikroskobu

Nakledilen Fare Akciğerinin İntravital İki Foton Mikroskobu