Name: perfusion and inflation of the mouse lung for tumor histology
Uploaded: 2020-08-06T15:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 24 s
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La investigación reportada en esta publicación fue apoyada por el Centro Nacional para el Avance de las Ciencias Traslacionales bajo el número de premio UL1TR003096 (MDE), National Heart, Lung, and Blood Institute Predoctoral Fellowship in Lung Diseases Training Program 5T32HL134640 (MLD).

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Alabama en Birmingham.
1. Protocolo experimental
<ol><li>Sacrifique el ratón utilizando un método IACUC aprobado. Aquí, usamos la dislocación cervical de un ratón anestesiado con un 5% de isoflurano. Utilice un ratón adecuado para el estudio; aquí, usamos un ratón FVB de 8 semanas de edad</li>
	<li>Con tijeras quirúrgicas, realice una incisión horizontal de 3,5-5 mm en el centro del abdomen inferior. A continuación, inserte tijeras quirúrgicas en el pequeño agujero creado a partir de la incisión y corte verticalmente por la línea media central hasta justo debajo del cuello del ratón.</li>
	<li>Tire de la piel hacia atrás con los dedos e inspeccione los ganglios linfáticos axilares.</li>
	<li>Con tijeras quirúrgicas, realice una incisión lateral de 3,5 mm para abrir la cavidad abdominal y, a continuación, corte en la dirección anterior hasta la parte inferior del tórax. Inspeccione los órganos de la cavidad abdominal: hígado, bazo, riñones, etc.</li>
	<li>Con el plano de las tijeras quirúrgicas, o usando fórceps, mueva el hígado para exponer el diafragma. Inspeccione el diafragma en busca de crecimiento tumoral o metástasis. A continuación, recorte suavemente el diafragma en el lado derecho del operador, lo que le permite expandirse. Corte suavemente el diafragma de derecha a izquierda para exponer la cavidad torácica y los pulmones. Tenga cuidado de no cortar los pulmones.</li>
	<li>Corte a través del extremo lateral de la caja torácica izquierda (a la derecha del operador) para inspeccionar el lóbulo izquierdo de los pulmones.</li>
	<li>Mueva suavemente los lóbulos derecho del pulmón fuera del camino y corte el extremo lateral de la caja torácica derecha y retire la caja torácica. NOTA: La extracción de la caja torácica es opcional, aunque la eliminación permite una visión más clara de la inflación pulmonar posterior.<ol>
<li>Si se requiere tejido pulmonar fresco o congelado, utilice fórceps hemostat para sujetar el bronco del lóbulo izquierdo y resecar el pulmón izquierdo con tijeras quirúrgicas antes de la perfusión.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Usando los fórceps para levantar el tejido que cubre la tráquea, cortar cualquier exceso de tejido. A continuación, corte suavemente el tejido delgado que recubre la tráquea para exponer las vías respiratorias.</li>
	<li>Corte la arteria renal con tijeras quirúrgicas.</li>
	<li>Para perfundir los pulmones, utilice una jeringa de 3 ml con una aguja de 22 G para inyectar 1 pbs con 10 U/ml de heparina en el ventrículo derecho del corazón. Perfundir lentamente los pulmones a aproximadamente 300 μL/s con PBS/heparina. Los pulmones con frecuencia se vuelven blancos. 2.5 mL de PBS se utilizan generalmente en este paso.</li>
	<li>Para la inflación pulmonar, utilice una jeringa de 3 ml con una aguja de 22 G, esta vez mantenida paralela a la tráquea. Inserte la aguja en la tráquea e inyecte un 10% de formalina con una velocidad de flujo no superior a ~200 μL/s hasta que los pulmones se hayan inflado por completo. Una vez inflados los pulmones, la formalina se reflujo fuera de la tráquea. Sujete la aguja en su lugar durante unos segundos más y luego retíriga.<ol>
<li>(Opcional) Antes de retirar la inflación de agujas y pulmones, utilice hilo de sutura para atar la tráquea. Para lograr esto, utilice 4 pulgadas de hilo de sutura que sostenga el punto de la rosca con un pequeño par de fórceps. Coloque el hilo en el lado dorsal de la tráquea y tire a través para hacer un bucle alrededor de la aguja. A continuación, haga un nudo de mano alrededor de la aguja. Tire del nudo apretado, retire la aguja de la tráquea, cierre el nudo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilice fórceps para levantar el corazón, inserte tijeras quirúrgicas directamente detrás de los pulmones y corte el tejido conectivo mientras levanta el corazón para resecar los pulmones.</li>
	<li>Corta el corazón para extraerlo de los pulmones.</li>
	<li>Coloque los pulmones un casete etiquetado con el ID del ratón o la identificación del estudio. Coloque el cassette en formalina tamponada al 10% y fije para 24-48 h. Los pulmones se pueden dejar en fijación durante más de un año si se desea.</li>
	<li>Transfiera el casete que contiene los pulmones al 70% de etanol y proceda al procesamiento para la histología.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hsia, C. C., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R., Structure, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+official+research+policy+statement+of+the+American+Thoracic+Society/European+Respiratory+Society:+standards+for+quantitative+assessment+of+lung+structure.">An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: standards for quantitative assessment of lung structure.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 394-418 (2010).</li><li>Vasilescu, D. M., Knudsen, L., Ochs, M., Weibel, E. R., Hoffman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+murine+lung+preparation+for+detailed+structural+evaluation+via+micro-computed+tomography.">Optimized murine lung preparation for detailed structural evaluation via micro-computed tomography.</a> Journal of Applied Physiology. 112 (1), 159-166 (2012).</li><li>Blumler, P., Acosta, R. H., Thomas-Semm, A., Reuss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+fixation+for+the+preservation+of+air+spaces.">Lung fixation for the preservation of air spaces.</a> Experimental Lung Research. 30 (1), 73-82 (2004).</li><li>Oldmixon, E. H., Suzuki, S., Butler, J. P., Hoppin, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion+dehydration+fixes+elastin+and+preserves+lung+air-space+dimensions.">Perfusion dehydration fixes elastin and preserves lung air-space dimensions.</a> Journal of Applied Physiology. 58 (1), 105-113 (1985).</li><li>Braber, S., Verheijden, K. A., Henricks, P. A., Kraneveld, A. D., Folkerts, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+fixation+methods+on+lung+morphology+in+a+murine+model+of+emphysema.">A comparison of fixation methods on lung morphology in a murine model of emphysema.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 299 (6), 843-851 (2010).</li><li>Renne, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendation+of+optimal+method+for+formalin+fixation+of+rodent+lungs+in+routine+toxicology+studies.">Recommendation of optimal method for formalin fixation of rodent lungs in routine toxicology studies.</a> Toxicologic Pathology. 29 (5), 587-589 (2001).</li><li>Limjunyawong, N., Mock, J., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instillation+and+Fixation+Methods+Useful+in+Mouse+Lung+Cancer+Research.">Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research.</a> Journal of Visualized Experiments. (102), e52964 (2015).</li><li>Lum, H., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+10%+formalin+fixation+on+fixed+lung+volume+and+lung+tissue+shrinkage.+A+comparison+of+eleven+laboratory+species.">Effects of 10% formalin fixation on fixed lung volume and lung tissue shrinkage. A comparison of eleven laboratory species.</a> American Review of Respiratory Disease. 132 (5), 1078-1083 (1985).</li><li>Edmonds, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-31+initiates+lung+tumorigenesis+and+promotes+mutant+KRAS-driven+lung+cancer.">MicroRNA-31 initiates lung tumorigenesis and promotes mutant KRAS-driven lung cancer.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (1), 349-364 (2016).</li><li>Zhao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wogonin+suppresses+melanoma+cell+B16-F10+invasion+and+migration+by+inhibiting+Ras-medicated+pathways.">Wogonin suppresses melanoma cell B16-F10 invasion and migration by inhibiting Ras-medicated pathways.</a> PLoS One. 9 (9), 106458 (2014).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El procedimiento descrito anteriormente para la perfusión, inflación y fijación de los pulmones de ratón es ideal para una preparación rápida y eficiente de los pulmones de ratón para la histología y el análisis patológico de tumores pulmonares. El procedimiento no requiere ningún equipo especial y se puede realizar en menos de 6 minutos por ratón. El procedimiento no requiere un volumen fijo para la inflación ni una presión fluida constante. Debido a que este procedimiento no está estandarizado, no se recomienda para aquellos que deseen realizar análisis estereológicos o morfométricos del pulmón. Los procedimientos en los que se requiere dicha normalización se han descrito mejor1,7.
Los pasos más críticos de este protocolo son la perfusión y la inflación. Es importante perfundir a través del ventrículo derecho del corazón, mientras que si la perfusión se realiza a través del ventrículo izquierdo, los pulmones no se perfunden. Es fácil saber si la perfusión se realiza correctamente, ya que los pulmones se volverán blancos. La instilación de fijación a través de la tráquea permite la inflación de los pulmones, lo que permite un análisis histológico más fácil de la arquitectura pulmonar. Es importante detener la administración de fijación tan pronto como los pulmones se hayan expandido por completo, ya que la sobreinflación puede causar rotura de la pared alveolar y la aparición de enfisema. Una vez inflados los pulmones, alguna formalina se reflujo de la tráquea. Esto es normal y no afecta el análisis histológico posterior; sin embargo, si esto es una preocupación, la tráquea puede ser atada antes de exculpar los pulmones.
Mientras que este protocolo utiliza formalina tamponada al 10% para fijar los pulmones, que es el fijador más comúnmente recomendado5,6, hay informes de artefactos introducidos por este fijador, a saber, contracción del tejido pulmonar1,8. Si esto es una preocupación, siga las directrices de la Sociedad Torácica Americana y la Sociedad Respiratoria Europea para la evaluación de la estructura pulmonar1. Otro fijador potencial no comúnmente recomendado, pero que puede resultar útil es la solución de Bouin, que puede proporcionar un mejor contraste para la evaluación de nódulos de superficie pulmonar9,10. En resumen, el protocolo descrito aquí proporciona un método robusto y simple para la fijación de pulmones de ratón para histología tumoral.

Existen una variedad de modelos de ratón de oncogenesis pulmonar y metástasis del cáncer hasta el pulmón que van desde GEMMs complejos hasta modelos inducidos por carcinógenos hasta modelos singénicos y xenógrafos, donde las células cancerosas se inyectan a través de intracardiaco, intratorácico, la vena de la cola u otros métodos para establecer tumores dentro del pulmón. Todos estos modelos comparten la necesidad común de evaluación histológica de histología pulmonar y patología. Por lo tanto, es necesario tener un método robusto pero rápido para realizar necropsias de ratones mientras se perfunden los pulmones para eliminar el exceso de sangre, e inflar y fijar los pulmones para visualizar claramente la arquitectura pulmonar. La velocidad es un componente crítico de este procedimiento, ya que puede ser necesario recoger los pulmones de docenas de ratones en un solo punto de tiempo. Este procedimiento se puede realizar en menos de 6 minutos por ratón.
Si bien este procedimiento es más que suficiente para evaluar la histología tumoral, no se recomienda para aquellos que deseen realizar estereología o mediciones morfométricas de los pulmones. Estas mediciones requieren que la inflación pulmonar se normalice, al igual que el cálculo de la superficie absoluta del pulmón, el volumen absoluto y el tamaño y el número1del alveolar. Este método tampoco es óptimo para algunos enfoques de imágenes. Por ejemplo, la toma de imágenes de los pulmones a través de μCT para el análisis morfométrico ex vivo requiere que los pulmones permanezcan llenos de aire2. Cuando la preservación de los espacios y dimensiones del aire son la principal preocupación, se recomienda fijar los pulmones mediante técnicas de deshidratación por perfusión3,4. Una de las mayores preocupaciones de este modelo es el potencial de rupturing de las paredes alveolares, disminuyendo su uso en estudios de enfisema; sin embargo, el procedimiento recomendado para la fijación de pulmones para el estudio del enfisema sigue siendo bastante similar, ya que se recomienda fijar los pulmones ya sea por instilación intratraqueal de 10% de formalina (similar al protocolo descrito aquí) bajo presión constante del líquido o por fijación in situ5.
La ventaja del procedimiento descrito aquí es que no requiere presión constante del líquido, sino que infla los pulmones hasta que se han expandido por completo, disminuyendo así el tiempo necesario para el procedimiento. El procedimiento aquí descrito se asemeja mucho a los métodos recomendados por un armamentoarium de la Sociedad de Patología Toxicológica, donde se formó un subcomité para recomendar los mejores métodos de fijación pulmonar para estudios toxicológicos. La mayoría de los científicos de este subcomité recomendaron arreglar los pulmones mediante instilación intratraqueal con una jeringa, aunque había diferentes recomendaciones sobre el momento en que el pulmón quedó en el fijador6. Por lo tanto, mientras que existe una variedad de métodos de inflación pulmonar y fijación, el método descrito aquí se propone para ser el método óptimo para inflar rápidamente y fijar los pulmones para la evaluación histológica tumoral aguas abajo.

<table><tbody><tr><td>10% buffered formalin</td><td>Fisher</td><td>23-245685</td><td></td></tr><tr><td>22 G Needle</td><td>BD</td><td>305155</td><td></td></tr><tr><td>3 mL syringe</td><td>BD</td><td>309656</td><td></td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td>Decon</td><td>2405</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-8595</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Fisher</td><td>H19</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>Surgical scissors</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-8428</td><td></td></tr></tbody></table>

perfusion and inflation of the mouse lung for tumor histology

La capacidad de evaluar la histología pulmonar es fundamental para los campos de la investigación del cáncer de pulmón y la metástasis del cáncer. Es igualmente importante realizar necropsias rápida y eficientemente a partir de estudios sin sacrificar la calidad de los tejidos adquiridos. El objetivo de este protocolo es presentar un método para perfundir, inflar y fijar rápidamente los pulmones del ratón para el análisis histológico posterior. Este método no estandariza la inflación pulmonar; por lo tanto, no requiere ningún procedimiento o equipo especial y en su lugar simplemente inculca fijación directamente a través de la tráquea después de perfusión a través del corazón. Esto permite una estimación suficiente del tamaño del tumor, histología y puntuación. Esto también permite la recolección de tejido congelado antes de la fijación del tejido pulmonar. Este método es limitado en el sentido de que no permite la cuantificación morfométrica posterior del pulmón; sin embargo, es más que suficiente para el análisis de tumores pulmonares a partir de modelos de ratón genéticamente modificados (GEMMs), modelos singénicos, así como estudios de tumores y metástasis xenógrafos.

El protocolo anterior permite una perfusión rápida, inflación y fijación de los pulmones del ratón. Las cifras que se muestran a continuación representan la importancia de cada paso. La Figura 1 representa los pulmones manchados de H&E que han sido perfundidos con PBS y pulmones en los que se ha saltado el paso de perfusión o los pulmones no se perfundieron correctamente. Como se muestra, el exceso de sangre en los pulmones mal impregnados crea una histología menos que ideal y puede dificultar la observación completa de la arquitectura pulmonar. La Figura 2 demuestra tanto la importancia de la inflación como los peligros de la sobreinflación. Es más difícil identificar áreas de hiperplasia en pulmones no inflados debido a la compresión y proximidad de los alvéolos; sin embargo, en los pulmones sobreinflados, muchas de las paredes alveolares se han roto y esto podría confundirse con enfisema si no es cuidadoso. La Figura 3 representa la histología tumoral en los pulmones que han sido perfundidos e inflados utilizando la técnica descrita en este documento.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60605/60605fig01.jpg"> Figura 1: Tinción representativa de los pulmones perfundidos y no perfundidos. (A) Pulmones perfundidos con PBS. (B) Los pulmones no se perfunden. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/60605/60605fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60605/60605fig02.jpg"> Figura 2: Tinción H&E representativa de pulmones inflados, sin inflar y sobreinflados. (A) Los pulmones se inflaron y fijaron con un 10% de formalina hasta que los pulmones se expandieron por completo. (B) Los pulmones no se inflaron a través de la tráquea y en su lugar se colocaron directamente en un 10% de formalina. (C) Los pulmones se inflaron y fijaron con un 10% de formalina, pero el 10% de formalina se empujó continuamente a los pulmones más allá de la expansión completa, lo que resultó en una sobreinflación. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/60605/60605fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60605/60605fig03.jpg"> Figura 3: Tinción H&E representativa de pulmones de ratón perfundidos e inflados. (A) Los tumores pulmonares fueron inducidos utilizando el uretano carcinógeno químico. B) Metástasis pulmonares espontáneas de una línea celular xenógrada humana <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/60605/60605fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Perfusion and Inflation of the Mouse Lung for Tumor Histology

El propósito de este método es presentar un método simple y eficiente para la perfusión, inflación y fijación de los pulmones del ratón para el examen de la patología pulmonar y la evaluación de metástasis en el pulmón.

Perfusión e inflación del pulmón del ratón para la histología tumoral

The ability to evaluate lung histology is critical for the fields of lung cancer research and cancer metastasis. It is equally important to perform ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Cancer Research

18.2K vistas.  University of Alabama at Birmingham. El propósito de este método es presentar un método simple y eficiente para la perfusión, inflación y fijación de los pulmones del ratón para el examen de la patología pulmonar y la evaluación de metástasis en el pulmón.

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Long-term High-Resolution Intravital Microscopy in the Lung with a Vacuum Stabilized Imaging Window

Metastasis to secondary sites such as the lung, liver and bone is a traumatic event with a mortality rate of approximately 90% 1. Of these sites, the lung is the most difficult to assess using intravital optical imaging due to its enclosed position within the body, delicate nature and vital role in sustaining proper physiology. While clinical modalities (positron emission tomography (PET), magnetic resonance imaging (MRI) and computed tomography (CT)) are capable of providing noninvasive images of this tissue, they lack the resolution necessary to visualize the earliest seeding events, with a single pixel consisting of nearly a thousand cells. Current models of metastatic lung seeding postulate that events just after a tumor cell&#39;s arrival are deterministic for survival and subsequent growth. This means that real-time intravital imaging tools with single cell resolution 2 are required in order to define the phenotypes of the seeding cells and test these models. While high resolution optical imaging of the lung has been performed using various ex vivo preparations, these experiments are typically single time-point assays and are susceptible to artifacts and possible erroneous conclusions due to the dramatically altered environment (temperature, profusion, cytokines, etc.) resulting from removal from the chest cavity and circulatory system 3. Recent work has shown that time-lapse intravital optical imaging of the intact lung is possible using a vacuum stabilized imaging window 2,4,5 however, typical imaging times have been limited to approximately 6 hr. Here we describe a protocol for performing long-term intravital time-lapse imaging of the lung utilizing such a window over a period of 12 hr. The time-lapse image sequences obtained using this method enable visualization and quantitation of cell-cell interactions, membrane dynamics and vascular perfusion in the lung. We further describe an image processing technique that gives an unprecedentedly clear view of the lung microvasculature.

This protocol describes the use of multiphoton microscopy to perform long-term high-resolution, single cell imaging of the intact lung in real time using a vacuum stabilized imaging window.

A largo plazo de alta resolución Microscopia intravital en el pulmón con una ventana de imagen vacío Estabilizado

Metastasis to secondary sites such as the lung, liver and bone is a traumatic event with a mortality rate of approximately 90% 1. Of these sites, the lung ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

Utilizing 18F-FDG PET/CT Imaging and Quantitative Histology to Measure Dynamic Changes in the Glucose Metabolism in Mouse Models of Lung Cancer

A hallmark of advanced tumors is a switch to aerobic glycolysis that is readily measured by [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose positron emission tomography (18F-FDG PET) imaging. Co-mutations in the KRAS proto-oncogene and the LKB1 tumor suppressor gene are frequent events in lung cancer that drive hypermetabolic, glycolytic tumor growth. A critical pathway regulating the growth and metabolism of these tumors is the mechanistic target of the rapamycin (mTOR) pathway, which can be effectively targeted using selective catalytic mTOR kinase inhibitors. The mTOR inhibitor MLN0128 suppresses glycolysis in mice bearing tumors with Kras and Lkb1 co-mutations, referred to as KL mice. The therapy response in KL mice is first measured by 18F-FDG PET and computed tomography (CT) imaging before and after the delivery of MLN0128. By utilizing 18F-FDG PET/CT, researchers are able to measure dynamic changes in the glucose metabolism in genetically engineered mouse models (GEMMs) of lung cancer following a therapeutic intervention with targeted therapies. This is followed by ex vivo autoradiography and a quantitative immunohistochemical (qIHC) analysis using morphometric software. The use of qIHC enables the detection and quantification of distinct changes in the biomarker profiles following treatment as well as the characterization of distinct tumor pathologies. The coupling of PET imaging to quantitative histology is an effective strategy to identify metabolic and therapeutic responses in vivo in mouse models of disease.

Utilizing 18F-FDG PET/CT Imaging and Quantitative Histology to Measure Dynamic Changes in the Glucose Metabolism in Mouse Models of Lung Cancer

In this protocol, we describe how to utilize [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose positron emission tomography and computed tomography (18F-FDG PET/CT) imaging to measure the tumor metabolic response to the targeted therapy MLN0128 in a Kras/Lkb1 mutant mouse model of lung cancer and coupled imaging with high resolution ex vivo autoradiography and quantitative histology.

Utilizando 18F-FDG PET/CT la proyección de imagen e histología cuantitativa para medir cambios dinámicos en el metabolismo de la glucosa en modelos de ratón de cáncer de pulmón

A hallmark of advanced tumors is a switch to aerobic glycolysis that is readily measured by [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose positron emission tomography ...

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of micrometastases by radiologic imaging and the success in their therapeutic eradication remain limited.
While animal models have proven to be invaluable tools for cancer research1, the monitoring/visualization of micrometastases remains a challenge and inaccurate evaluation of metastatic spread in preclinical studies potentially leads to disappointing results in clinical trials2. Consequently, there is great interest in refining the methods to finally allow reproducible and reliable detection of metastases down to the single cell level in normal tissue. The main focus therefore is on techniques, which allow the detection of tumor cells in vivo, like micro-computer tomography (micro-CT), positron emission tomography (PET), bioluminescence or fluorescence imaging3,4. We are currently optimizing these techniques for in vivo monitoring of primary tumor growth and metastasis in different osteosarcoma models. Some of these techniques can also be used for ex vivo analysis of metastasis beside classical methods like qPCR5, FACS6 or different types of histological staining. As a benchmark, we have established in the present study the stable transfection or transduction of tumor cells with the lacZ gene encoding the bacterial enzyme &beta;-galactosidase that metabolizes the chromogenic substrate 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside (X-Gal) to an insoluble indigo blue dye7 and allows highly sensitive and selective histochemical blue staining of tumor cells in mouse tissue ex vivo down to the single cell level as shown here. This is a low-cost and not equipment-intensive tool, which allows precise validation of metastasis8 in studies assessing new anticancer therapies9-11. A limiting factor of X-gal staining is the low contrast to e.g. blood-related red staining of well vascularized tissues. In lung tissue this problem can be solved by in-situ lung perfusion, a technique that was recently established by Borsig et al.12 who perfused the lungs of mice under anesthesia to clear them from blood and to fix and embed them in-situ under inflation through the trachea. This method prevents also the collapse of the lung and thereby maintains the morphology of functional lung alveoli, which improves the quality of the tissue for histological analysis. In the present study, we describe a new protocol, which takes advantage of a combination of X-gal staining of lacZ-expressing tumor cells and in-situ perfusion and fixation of lung tissue. This refined protocol allows high-sensitivity detection of single metastatic cells in the lung and enabled us in a recent study to detect "dormant" lung micrometastases in a mouse model13, which was originally described to be non-metastatic14.

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

The novel protocol reported in the present study allows selective detection of lung metastases at single cell resolution in mice by combined in-situ lung perfusion and fixation and X-Gal staining of lacZ-tagged tumor cells.

Visualización mejorada de metástasis pulmonares en la Resolución sola célula en ratones por Combinada<em&gt; In-situ</em&gt; La perfusión del tejido pulmonar y X-Gal tinción de<em&gt; LacZ</em&gt;-Etiquetados células tumorales

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of ...

Medicina

A Standardized Method for Measuring Internal Lung Surface Area via Mouse Pneumonectomy and Prosthesis Implantation

Pulmonary morphology, physiology, and respiratory functions change in both physiological and pathological conditions. Internal lung surface area (ISA), representing the gas-exchange capacity of the lung, is a critical criterion to assess respiratory function. However, observer bias can significantly influence measured values for lung morphological parameters. The protocol that we describe here minimizes variations during measurements of two morphological parameters used for ISA calculation: internal lung volume (ILV) and mean linear intercept (MLI). Using ISA as a morphometric and functional parameter to determine the outcome of alveolar regeneration in both pneumonectomy (PNX) and prosthesis implantation mouse models, we found that the increased ISA following PNX treatment was significantly blocked by implantation of a prosthesis into the thoracic cavity1. The ability to accurately quantify ISA is not only expected to improve the reliability and reproducibility of lung function studies in injured-induced alveolar regeneration models, but also to promote mechanistic discoveries of multiple pulmonary diseases.

Internal lung surface area (ISA) is a critical criterion for assessing lung morphology and physiology in lung diseases and injury-induced alveolar regeneration. We describe here a standardized method that can minimize the measurement bias for ISA in both lung pneumonectomy and prosthesis implantation mouse models.

Un método estandarizado para medir el área de la superficie pulmonar interna mediante neumonectomía y prótesis de ratón

Pulmonary morphology, physiology, and respiratory functions change in both physiological and pathological conditions. Internal lung surface area (ISA), ...

Biología del Desarrollo

Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research

The ability to instill live agents, cells, or chemicals directly into the lung without injuring or killing the mice is an important tool in lung cancer research. Although there are a number of methods that have been published showing how to intubate mice for pulmonary function measurements, none are without potential problems for rapid tracheal instillation in large cohorts of mice. In the present paper, a simple and quick method is described that enables an investigator to carry out such instillations in an efficient manner. The method does not require any special tools or lighting and can be learned with very little practice. It involves anesthetizing a mouse, making a small incision in the neck to visualize the trachea, and then inserting an intravenous catheter directly. The small incision is quickly closed with tissue adhesive, and the mice are allowed to recover. A skilled student or technician can do instillations at an average rate of 2 min/mouse. Once the cancer is established, there is frequently a need for quantitative histologic analysis of the lungs. Traditionally pathologists usually do not bother to standardize lung inflation during fixation, and analyses are often based on a scoring system that can be quite subjective. While this may sometime be sufficiently adequate for gross estimates of the size of a lung tumor, any proper stereological quantification of lung structure or cells requires a reproducible fixation procedure and subsequent lung volume measurement. Here we describe simple reliable procedures for both fixing the lungs under pressure and then accurately measuring the fixed lung volume. The only requirement is a laboratory balance that is accurate over a range of 1 mg&#8211;300 g. The procedures presented here thus could greatly improve the ability to create, treat, and analyze lung cancers in mice.

The goal of this paper is to describe simple methods that will greatly aid in the setup and analysis of mouse lungs with lung cancer or other pathologies. We present 3 protocols to simply and reliably carry out lung instillations, fixation, and lung volume measurements.

Instilación y Fijación Métodos Útiles en pulmón de ratón Cancer Research

The ability to instill live agents, cells, or chemicals directly into the lung without injuring or killing the mice is an important tool in lung cancer ...

Pre-Conditioning the Airways of Mice with Bleomycin Increases the Efficiency of Orthotopic Lung Cancer Cell Engraftment

Lung cancer is a deadly treatment refractory disease that is biologically heterogeneous. To understand and effectively treat the full clinical spectrum of thoracic malignancies, additional animal models that can recapitulate diverse human lung cancer subtypes and stages are needed. Allograft or xenograft models are versatile and enable the quantification of tumorigenic capacity in vivo, using malignant cells of either murine or human origin. However, previously described methods of lung cancer cell engraftment have been performed in non-physiological sites, such as the flank of mice, due to the inefficiency of orthotopic transplantation of cells into the lungs. In this study, we describe a method to enhance orthotopic lung cancer cell engraftment by pre-conditioning the airways of mice with the fibrosis inducing agent bleomycin. As a proof-of-concept experiment, we applied this approach to engraft tumor cells of the lung adenocarcinoma subtype, obtained from either mouse or human sources, into various strains of mice. We demonstrate that injuring the airways with bleomycin prior to tumor cell injection increases the engraftment of tumor cells from 0-17% to 71-100%. Significantly, this method enhanced lung tumor incidence and subsequent outgrowth using different models and mouse strains. In addition, engrafted lung cancer cells disseminate from the lungs into relevant distant organs. Thus, we provide a protocol that can be used to establish and maintain new orthotopic models of lung cancer with limiting amounts of cells or biospecimen and to quantitatively assess the tumorigenic capacity of lung cancer cells in physiologically relevant settings.

We describe a method to significantly enhance orthotopic engraftment of lung cancer cells into the murine lungs by pre-conditioning the airways with injury. This approach may also be applied to study stromal interactions within the lung microenvironment, metastatic dissemination, lung cancer co-morbidities, and to more efficiently generate patient derived xenografts.

Acondicionamiento previo de las vías respiratorias de los ratones con bleomicina aumenta la eficacia del pulmón Orthotopic Engraftment de la célula de cáncer

Lung cancer is a deadly treatment refractory disease that is biologically heterogeneous. To understand and effectively treat the full clinical spectrum of ...

Air-Inflation of Murine Lungs with Vascular Perfusion-Fixation

Lung histology is often used to investigate the contributions provided by airspace cells during lung homeostasis and disease pathogenesis. However, commonly used instillation-based fixation methods can displace airspace cells and mucus into terminal airways and can alter tissue morphology. In comparison, vascular perfusion-fixation techniques are superior at preserving the location and morphology of cells within airspaces and the mucosal lining. However, if positive airway pressure is not simultaneously applied, regions of the lungs may collapse and capillaries may bulge into the alveolar spaces, leading to distortion of the lung anatomy. Herein, we describe an inexpensive method for air-inflation during vascular perfusion-fixation to preserve the morphology and location of airway and alveolar cells and interstitium in murine lungs for downstream histologic studies. Constant air pressure is delivered to the lungs via the trachea from a sealed, air-filled chamber that maintains pressure via an adjustable liquid column while fixative is perfused through the right ventricle.

Presented is a method for air-inflation with vascular perfusion-fixation of the lungs that preserves the location of cells within airways, alveoli and interstitium for structure-function analyses. Constant airway pressure is maintained with an air-inflation chamber while fixative is perfused via the right ventricle. Lungs are processed for histologic studies.

Inflado al aire de los pulmones murinos con fijación de perfusión vascular

Lung histology is often used to investigate the contributions provided by airspace cells during lung homeostasis and disease pathogenesis. However, ...

Neurociencias

<meta charset="utf8"></head><body>Monitorización en tiempo real de la dinámica celular en el trasplante de pulmón de ratón

Intravital Two-Photon Microscopy of the Transplanted Mouse Lung

Complications after lung transplantation are largely related to the host immune system responding to the graft. Such immune responses are regulated by crosstalk between donor and recipient cells. A better understanding of these processes relies on the use of preclinical animal models and is aided by an ability to study intra-graft immune cell trafficking in real-time. Intravital two-photon microscopy can be used to image tissues and organs for depths up to several hundred microns with minimal photodamage, which affords a great advantage over single-photon confocal microscopy. Selective use of transgenic mice with promoter-specific fluorescent protein expression and/or adoptive transfer of fluorescent dye-labeled cells during intravital two-photon microscopy allows for the dynamic study of single cells within their physiologic environment. Our group has developed a technique to stabilize mouse lungs, which has enabled us to image cellular dynamics in na&#239;ve lungs and orthotopically transplanted pulmonary grafts. This technique allows for detailed assessment of cellular behavior within the vasculature and in the interstitium, as well as for examination of interactions between various cell populations. This procedure can be readily learned and adapted to study immune mechanisms that regulate inflammatory and tolerogenic responses after lung transplantation. It can also be expanded to the study of other pathogenic pulmonary conditions.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor destacado: Avance de la inmunología del trasplante de pulmón a través de imágenes intravitales

Here, we present a protocol to intravitally image the transplanted mouse left lung using two-photon microscopy. This represents a valuable tool for studying cellular dynamics and interactions in real-time following murine lung transplantation.

Microscopía intravital de dos fotones del pulmón de ratón trasplantado

Complications after lung transplantation are largely related to the host immune system responding to the graft. Such immune responses are regulated by ...

Perfusión e inflación del pulmón del ratón para la histología tumoral

Resumen

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A largo plazo de alta resolución Microscopia intravital en el pulmón con una ventana de imagen vacío Estabilizado

Utilizando ¹⁸F-FDG PET/CT la proyección de imagen e histología cuantitativa para medir cambios dinámicos en el metabolismo de la glucosa en modelos de ratón de cáncer de pulmón

Visualización mejorada de metástasis pulmonares en la Resolución sola célula en ratones por Combinada

Un método estandarizado para medir el área de la superficie pulmonar interna mediante neumonectomía y prótesis de ratón

Instilación y Fijación Métodos Útiles en pulmón de ratón Cancer Research

Acondicionamiento previo de las vías respiratorias de los ratones con bleomicina aumenta la eficacia del pulmón Orthotopic Engraftment de la célula de cáncer

Inflado al aire de los pulmones murinos con fijación de perfusión vascular

Microscopía intravital de dos fotones del pulmón de ratón trasplantado

Microscopía intravital de dos fotones del pulmón de ratón trasplantado

Microscopía intravital de dos fotones del pulmón de ratón trasplantado