Name: perfusion and inflation of the mouse lung for tumor histology
Uploaded: 2020-08-06T15:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 24 s
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이 간행물에 보고된 연구는 수여번호 UL1TR003096 (MDE), 국립 심장, 폐 및 혈액 연구소 전 박사 과정 5T32HL134640 (MLD)에 따라 번역 과학 을 발전시키기위한 국립 센터에 의해 지원되었다.

여기에 설명 된 모든 방법은 버밍엄에서 알라바마 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.
1. 실험 프로토콜
<ol><li>승인된 IACUC 방법을 사용하여 마우스를 희생합니다. 여기서는 5%의 이소플루란으로 마취된 마우스의 자궁경부 탈구를 사용했습니다. 연구에 적합한 마우스를 사용; 여기에서 는 8주 된 FVB 마우스를 사용합니다.</li>
	<li>수술 가위를 사용하여 하복부 중간에 3.5-5mm 수평 절개를 합니다. 다음으로, 절개로 만든 작은 구멍에 수술 가위를 삽입하고 마우스의 목 바로 아래 중앙 중간선을 수직으로 잘라.</li>
	<li>손가락으로 피부를 다시 당기고 축산 림프절을 검사합니다.</li>
	<li>외과 가위를 사용하여 3.5mm 측면 절개를 하여 복강을 열고 흉부 바닥까지 전방 방향으로 자른다. 간, 비장, 신장 등 복강기관의 장기검사를 한다.</li>
	<li>수술 가위의 평평한 또는 집게를 사용하여 간을 움직여 다이어프램을 노출시합니다. 종양 성장 또는 전이에 대한 다이어프램을 검사합니다. 그런 다음 작업자의 오른쪽에 있는 다이어프램을 부드럽게 잘라서 확장합니다. 흉부 구멍과 폐를 노출시키기 위해 횡격막을 오른쪽에서 왼쪽으로 부드럽게 자릅니다. 폐를 자르지 않도록 주의하십시오.</li>
	<li>왼쪽 늑골 케이지(작업자의 오른쪽)의 측면 극단을 잘라 폐의 왼쪽 엽을 검사합니다.</li>
	<li>폐의 오른쪽 엽을 부드럽게 움직이며 오른쪽 갈비뼈 케이지의 측면 극단을 잘라 내고 흉곽을 제거합니다. 참고: 제거는 나중에 폐 인플레이션을 명확하게 볼 수 있지만, 흉곽의 제거는 선택 사항입니다.<ol>
<li>신선하거나 냉동된 폐 조직이 필요한 경우, 후면 집게를 사용하여 왼쪽 엽의 기관지를 고정하고 관류 전에 외과 가위를 사용하여 왼쪽 폐를 절제하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>집게를 사용하여 기관진을 덮는 조직을 들어 올리고 과도한 조직을 잘라냅니다. 그런 다음 기관지 안감의 얇은 조직을 부드럽게 잘라 기도를 노출시합니다.</li>
	<li>외과 가위로 신장 동맥을 잘라냅니다.</li>
	<li>폐를 견딜 수 있도록 22G 바늘이 달린 3mL 주사기를 사용하여 심장의 오른쪽 심실로 10 개의 U /mL 헤파린이있는 1 x PBS를 주입하십시오. PBS/헤파린으로 약 300 μL/s의 폐를 천천히 침투합니다. 폐는 자주 하얗게 변합니다. PBS의 2.5 mL은 일반적으로이 단계에서 사용된다.</li>
	<li>폐 인플레이션의 경우, 22 G 바늘로 3mL 주사기를 사용하시며, 이번에는 기관지와 평행하게 유지됩니다. 바늘을 기관체에 삽입하고 폐가 완전히 팽창 할 때까지 - 200 μL / s보다 큰 흐름의 속도로 10 %의 포르말린을 주입하십시오. 폐가 팽창되면 포르말린이 기관에서 흘러 나올 것입니다. 바늘을 몇 초 더 제자리에 고정한 다음 철회하십시오.<ol>
<li>(선택 사항) 바늘과 폐 인플레이션을 철회하기 전에 봉합사실을 사용하여 기관지를 묶습니다. 이를 위해 작은 한 쌍의 집게로 스레드의 점을 잡고 있는 4인치 의 봉합사 스레드를 사용합니다. 기관지의 등쪽 에 실을 놓고 당겨 바늘 주위에 루프를 만듭니다. 다음으로 바늘 주위에 오버핸드 매듭을 만듭니다. 매듭을 단단히 당기고, 기관지에서 바늘을 제거하고, 매듭을 닫습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>집게를 사용하여 심장을 들어 올리고, 폐 바로 뒤에 수술 가위를 삽입하고, 폐를 절제하기 위해 심장을 들어 올리는 동안 결합 조직을 잘라냅니다.</li>
	<li>폐에서 제거하는 심장을 잘라.</li>
	<li>폐에 마우스 ID 또는 연구 ID로 표시된 카세트를 배치합니다. 카세트를 10% 버퍼링된 포르말린에 놓고 24-48h를 수정합니다. 폐는 원하는 경우 1 년 이상 고정에 남아있을 수 있습니다.</li>
	<li>폐를 함유한 카세트를 70%에탄올로 옮기고 히스토로지 처리를 진행한다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hsia, C. C., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R., Structure, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+official+research+policy+statement+of+the+American+Thoracic+Society/European+Respiratory+Society:+standards+for+quantitative+assessment+of+lung+structure.">An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: standards for quantitative assessment of lung structure.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 394-418 (2010).</li><li>Vasilescu, D. M., Knudsen, L., Ochs, M., Weibel, E. R., Hoffman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+murine+lung+preparation+for+detailed+structural+evaluation+via+micro-computed+tomography.">Optimized murine lung preparation for detailed structural evaluation via micro-computed tomography.</a> Journal of Applied Physiology. 112 (1), 159-166 (2012).</li><li>Blumler, P., Acosta, R. H., Thomas-Semm, A., Reuss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+fixation+for+the+preservation+of+air+spaces.">Lung fixation for the preservation of air spaces.</a> Experimental Lung Research. 30 (1), 73-82 (2004).</li><li>Oldmixon, E. H., Suzuki, S., Butler, J. P., Hoppin, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion+dehydration+fixes+elastin+and+preserves+lung+air-space+dimensions.">Perfusion dehydration fixes elastin and preserves lung air-space dimensions.</a> Journal of Applied Physiology. 58 (1), 105-113 (1985).</li><li>Braber, S., Verheijden, K. A., Henricks, P. A., Kraneveld, A. D., Folkerts, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+fixation+methods+on+lung+morphology+in+a+murine+model+of+emphysema.">A comparison of fixation methods on lung morphology in a murine model of emphysema.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 299 (6), 843-851 (2010).</li><li>Renne, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendation+of+optimal+method+for+formalin+fixation+of+rodent+lungs+in+routine+toxicology+studies.">Recommendation of optimal method for formalin fixation of rodent lungs in routine toxicology studies.</a> Toxicologic Pathology. 29 (5), 587-589 (2001).</li><li>Limjunyawong, N., Mock, J., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instillation+and+Fixation+Methods+Useful+in+Mouse+Lung+Cancer+Research.">Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research.</a> Journal of Visualized Experiments. (102), e52964 (2015).</li><li>Lum, H., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+10%+formalin+fixation+on+fixed+lung+volume+and+lung+tissue+shrinkage.+A+comparison+of+eleven+laboratory+species.">Effects of 10% formalin fixation on fixed lung volume and lung tissue shrinkage. A comparison of eleven laboratory species.</a> American Review of Respiratory Disease. 132 (5), 1078-1083 (1985).</li><li>Edmonds, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-31+initiates+lung+tumorigenesis+and+promotes+mutant+KRAS-driven+lung+cancer.">MicroRNA-31 initiates lung tumorigenesis and promotes mutant KRAS-driven lung cancer.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (1), 349-364 (2016).</li><li>Zhao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wogonin+suppresses+melanoma+cell+B16-F10+invasion+and+migration+by+inhibiting+Ras-medicated+pathways.">Wogonin suppresses melanoma cell B16-F10 invasion and migration by inhibiting Ras-medicated pathways.</a> PLoS One. 9 (9), 106458 (2014).</li></ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

마우스 폐의 관류, 인플레이션 및 고정을 위해 위에서 설명한 절차는 폐 종양 조직학 및 병리학 분석을 위한 마우스 폐의 빠르고 효율적인 준비에 이상적입니다. 절차는 특별한 장비를 필요로하지 않으며 마우스 당 6 분 이내에 수행 할 수 있습니다. 이 절차는 인플레이션또는 일정한 유체 압력에 대한 고정 된 볼륨을 필요로하지 않습니다. 이 절차는 표준화되지 않기 때문에 폐의 입체적 또는 형태학적 분석을 수행하고자하는 사람들에게는 권장되지 않습니다. 이러한 표준화가 필요한 절차는1,7을더 잘 설명했습니다.
이 프로토콜의 가장 중요한 단계는 관류와 인플레이션입니다. 좌심실을 통해 관류가 이루어지는 반면, 심장의 오른쪽 심실을 통해 퍼퓨즈하는 것이 중요합니다. 폐가 하얗게 변하기 때문에 관류가 올바르게 수행되었는지 쉽게 알 수 있습니다. 기관진을 통한 고정화를 주입하면 폐 구조의 강하 조직 학적 분석이 용이하도록 폐의 인플레이션이 허용됩니다. 과잉 인플레이션이 폐포 벽 파손및 폐기종의 출현을 일으킬 수 있기 때문에 폐가 완전히 확장되는 즉시 고정 투여를 중단하는 것이 중요합니다. 폐가 팽창되면 일부 포르말린은 기관에서 역류합니다. 이것은 정상이며 다운스트림 조직학 분석에 영향을 미치지 않습니다. 그러나, 이것이 우려되는 경우에 기관체는 폐를 절제하기 전에 묶일 수 있습니다.
이 프로토콜은 10% 완충 된 포르말린을 사용하여 폐를 고치기 위해 가장 일반적으로 권장되는 고정5,6,폐 조직의 고정, 즉 수축에 의해 도입 된 유물의 보고가 있습니다1,8. 이것이 우려되는 경우에, 폐 구조물의 평가를 위한 미국 흉부 학회 및 유럽 호흡기 학회의 지침에 따라1. 다른 잠재적 인 고정은 일반적으로 권장하지 않지만 유용 할 수 있습니다 그 유용 할 수 있습니다 부인의 용액, 이는 폐 표면 결절9의평가를위한 더 나은 대조를 제공 할 수 있습니다9,10. 요약하자면, 본명 설명된 프로토콜은 종양 조직학을 위한 마우스 폐의 고정을 위한 견고하고 간단한 방법을 제공한다.

폐 종양 발생 및 암 전이의 다양한 마우스 모델은 복잡한 GEMM에서 발암 물질 유발 모델, 합성 및 xenograft 모델에 이르기까지 존재하며, 암세포는 심장 내, 내트라토라시, 꼬리 정맥 또는 폐 내종양을 확립하는 다른 방법을 통해 주입된다. 이 모든 모형은 폐 조직학 및 병리학의 조직학 평가를 위한 일반적인 필요를 공유합니다. 따라서, 폐를 흡수하면서 쥐의 부검을 수행하는 견고하면서도 신속한 방법이 필요하며, 폐를 팽창시키고 고정하여 폐 아키텍처를 명확하게 시각화할 필요가 있다. 속도는 단일 시점에서 수십 마리의 마우스로부터 폐를 수집해야 할 수도 있기 때문에 이 절차의 중요한 구성 요소입니다. 이 절차는 마우스 당 6 분 이내에 수행 할 수 있습니다.
이 절차는 종양 조직학을 평가하기에 충분하지만 폐의 입체학 또는 형태 측정을 수행하고자하는 사람들에게는 권장되지 않습니다. 이러한 측정은 폐의 절대 표면적, 절대 부피 및 폐포 크기 및 번호1의계산과 마찬가지로 폐 인플레이션을 표준화할 필요가 있다. 이 방법은 또한 몇몇 화상 진찰 접근에 대 한 최적이 아니다. 예를 들어, 전 생체 형태 분석을 위해 μCT를 통한 폐의 이미징은 폐가 공기2로채워져 있어야 합니다. 공기 공간과 치수의 보존이 주요 관심사인 경우, 관류 탈수 기술3,4에의해 폐를 고치는 것이 좋습니다. 이 모델의 가장 큰 관심사 중 하나는 폐포 벽의 파열에 대 한 잠재력, 폐기종의 연구에 그것의 사용을 감소; 그러나, 폐기종의 연구를 위한 폐의 고정을 위한 권장절차는 10% 포르말린(여기에 기술된 프로토콜과 유사)의 장내 주입에 의해 또는 정시 고정5에의해 폐를 고치는 것이 좋습니다.
여기서 설명된 절차의 장점은 일정한 유체 압력을 필요로 하지 않고, 완전히 팽창할 때까지 폐를 팽창시켜 시술에 필요한 시간을 감소시킨다는 것입니다. 여기서 설명된 절차는 독성학 연구를 위한 폐 고정의 가장 좋은 방법을 추천하기 위하여 소위원회가 형성된 독성병리학의 사회의 무기학에 의해 추천된 방법과 유사합니다. 이 소위원회 내의 과학자의 대다수는 폐가 고정6에남아 있던 시간에 변화한 권고가 있더라도, 주사기를 가진 장 내 주입에 의하여 폐를 고정하는 것을 추천했습니다. 따라서, 다양한 폐 인플레이션 및 고정 방법이 존재하지만, 본 원에 기재된 방법은 다운스트림 종양 조직학적 평가를 위해 폐를 신속하게 팽창시키고 고치는 최적의 방법이 될 것을 제안한다.

<table><tbody><tr><td>10% buffered formalin</td><td>Fisher</td><td>23-245685</td><td></td></tr><tr><td>22 G Needle</td><td>BD</td><td>305155</td><td></td></tr><tr><td>3 mL syringe</td><td>BD</td><td>309656</td><td></td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td>Decon</td><td>2405</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-8595</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Fisher</td><td>H19</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>Surgical scissors</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-8428</td><td></td></tr></tbody></table>

perfusion and inflation of the mouse lung for tumor histology

폐 장학적 연구를 평가하는 능력은 폐암 연구 및 암 전이 분야에 매우 중요합니다. 조달된 조직의 품질을 희생하지 않고 연구에서 신속하고 효율적으로 부검을 수행하는 것이 똑같이 중요합니다. 이 프로토콜의 목표는 다운스트림 조직 분석을 위해 마우스 폐를 신속하게 퍼퓨즈, 팽창 및 수정하는 방법을 제시하는 것입니다. 이 방법은 폐 인플레이션을 표준화하지 않습니다; 따라서 특별한 절차 나 장비가 필요하지 않으며 대신 단순히 심장을 통해 관류 다음 기관을 통해 직접 고정을 주입합니다. 이것은 종양 크기, 작사학 및 점수의 충분한 추정을 허용합니다. 이것은 또한 폐 조직 고정의 앞에 동결된 조직의 집합을 허용합니다. 이 방법은 폐의 나중에 형태화 를 허용하지 않는다는 점에서 제한됩니다. 그러나, 유전자 조작된 마우스 모델(GEMM), 신제모델, 이종이이식 종양 및 전이 연구에서 폐종양 분석을 하기에 충분하다.

위의 프로토콜은 마우스 폐의 빠른 관류, 인플레이션 및 고정을 허용합니다. 아래 그림은 각 단계의 중요성을 나타냅니다. 그림 1은 관류 단계가 건너뛰거나 폐가 올바르게 침투하지 못한 PBS 및 폐와 함께 퍼진 H&E 염색 폐를 묘사합니다. 표시된 바와 같이, 제대로 퍼진 폐에 있는 과잉 혈액은 이상적인 히스토로지 보다는 적게 생성하고 완전히 폐 건축을 관찰하는 것을 어렵게 만들 수 있습니다. 그림 2는 인플레이션의 중요성과 과다 인플레이션의 위험성을 모두 보여줍니다. 폐포의 압축 및 근접성으로 인해 팽창되지 않은 폐에서 증식 부위를 식별하는 것이 더 어렵습니다. 그러나, 과팽창 폐에서, 폐포 벽의 많은 깨진 되었습니다 그리고 이 조심 하지 않을 경우 폐기종에 대 한 오해 될 수 있습니다. 도 3은 본원에 기재된 기술을 사용하여 침투및 팽창된 폐의 종양 장학적학을 묘사한다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60605/60605fig01.jpg"> 그림 1: Perfused 및 불응성 폐의 대표적인 H&E 염색. (A)PBS가 침투한 폐. (B)폐가 침투하지 않습니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/60605/60605fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60605/60605fig02.jpg"> 그림 2: 팽창, 팽창 해제 및 과팽창폐의 대표적인 H&E 염색. (A)폐는 폐가 완전히 팽창할 때까지 10%의 포르말린으로 팽창및 고정되었다. (B)폐는 기관을 통해 팽창되지 않고 대신 10% 포르말린에 직접 배치하였다. (C)폐는 10%의 포르말린으로 팽창및 고정되었지만, 10%의 포르말린은 과도하게 팽창하는 결과로 전체 팽창을 지나 폐로 지속적으로 밀려났다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/60605/60605fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60605/60605fig03.jpg"> 그림 3: 마우스 폐가 침투되고 팽창된 사람의 대표적인 H&E 염색. (A)폐종양은 화학발암물질 우레탄을 사용하여 유도하였다. (B)인간 이종이접힌 세포주로부터의 자발적인 폐 전이는 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/60605/60605fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Perfusion and Inflation of the Mouse Lung for Tumor Histology

이 방법의 목적은 폐 종양 병리학의 검사 및 폐에 전이의 평가를 위한 마우스 폐의 관류, 인플레이션 및 고정을 위한 간단하고 효율적인 방법을 제시하는 것입니다.

종양 연고학을 위한 마우스 폐의 관류 및 인플레이션

The ability to evaluate lung histology is critical for the fields of lung cancer research and cancer metastasis. It is equally important to perform ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Cancer Research

18.2K 조회수.  University of Alabama at Birmingham. 이 방법의 목적은 폐 종양 병리학의 검사 및 폐에 전이의 평가를 위한 마우스 폐의 관류, 인플레이션 및 고정을 위한 간단하고 효율적인 방법을 제시하는 것입니다.

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Long-term High-Resolution Intravital Microscopy in the Lung with a Vacuum Stabilized Imaging Window

Metastasis to secondary sites such as the lung, liver and bone is a traumatic event with a mortality rate of approximately 90% 1. Of these sites, the lung is the most difficult to assess using intravital optical imaging due to its enclosed position within the body, delicate nature and vital role in sustaining proper physiology. While clinical modalities (positron emission tomography (PET), magnetic resonance imaging (MRI) and computed tomography (CT)) are capable of providing noninvasive images of this tissue, they lack the resolution necessary to visualize the earliest seeding events, with a single pixel consisting of nearly a thousand cells. Current models of metastatic lung seeding postulate that events just after a tumor cell&#39;s arrival are deterministic for survival and subsequent growth. This means that real-time intravital imaging tools with single cell resolution 2 are required in order to define the phenotypes of the seeding cells and test these models. While high resolution optical imaging of the lung has been performed using various ex vivo preparations, these experiments are typically single time-point assays and are susceptible to artifacts and possible erroneous conclusions due to the dramatically altered environment (temperature, profusion, cytokines, etc.) resulting from removal from the chest cavity and circulatory system 3. Recent work has shown that time-lapse intravital optical imaging of the intact lung is possible using a vacuum stabilized imaging window 2,4,5 however, typical imaging times have been limited to approximately 6 hr. Here we describe a protocol for performing long-term intravital time-lapse imaging of the lung utilizing such a window over a period of 12 hr. The time-lapse image sequences obtained using this method enable visualization and quantitation of cell-cell interactions, membrane dynamics and vascular perfusion in the lung. We further describe an image processing technique that gives an unprecedentedly clear view of the lung microvasculature.

This protocol describes the use of multiphoton microscopy to perform long-term high-resolution, single cell imaging of the intact lung in real time using a vacuum stabilized imaging window.

진공 안정 이미징 창으로 폐의 장기 고해상도 생체 내에 현미경

Metastasis to secondary sites such as the lung, liver and bone is a traumatic event with a mortality rate of approximately 90% 1. Of these sites, the lung ...

연구

암 연구학

Utilizing 18F-FDG PET/CT Imaging and Quantitative Histology to Measure Dynamic Changes in the Glucose Metabolism in Mouse Models of Lung Cancer

A hallmark of advanced tumors is a switch to aerobic glycolysis that is readily measured by [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose positron emission tomography (18F-FDG PET) imaging. Co-mutations in the KRAS proto-oncogene and the LKB1 tumor suppressor gene are frequent events in lung cancer that drive hypermetabolic, glycolytic tumor growth. A critical pathway regulating the growth and metabolism of these tumors is the mechanistic target of the rapamycin (mTOR) pathway, which can be effectively targeted using selective catalytic mTOR kinase inhibitors. The mTOR inhibitor MLN0128 suppresses glycolysis in mice bearing tumors with Kras and Lkb1 co-mutations, referred to as KL mice. The therapy response in KL mice is first measured by 18F-FDG PET and computed tomography (CT) imaging before and after the delivery of MLN0128. By utilizing 18F-FDG PET/CT, researchers are able to measure dynamic changes in the glucose metabolism in genetically engineered mouse models (GEMMs) of lung cancer following a therapeutic intervention with targeted therapies. This is followed by ex vivo autoradiography and a quantitative immunohistochemical (qIHC) analysis using morphometric software. The use of qIHC enables the detection and quantification of distinct changes in the biomarker profiles following treatment as well as the characterization of distinct tumor pathologies. The coupling of PET imaging to quantitative histology is an effective strategy to identify metabolic and therapeutic responses in vivo in mouse models of disease.

Utilizing 18F-FDG PET/CT Imaging and Quantitative Histology to Measure Dynamic Changes in the Glucose Metabolism in Mouse Models of Lung Cancer

In this protocol, we describe how to utilize [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose positron emission tomography and computed tomography (18F-FDG PET/CT) imaging to measure the tumor metabolic response to the targeted therapy MLN0128 in a Kras/Lkb1 mutant mouse model of lung cancer and coupled imaging with high resolution ex vivo autoradiography and quantitative histology.

18F FDG PET/CT 영상 및 정량 조직학 폐암의 마우스 모델에서 포도 당 물질 대사에 있는 동적인 변화를 측정 하

A hallmark of advanced tumors is a switch to aerobic glycolysis that is readily measured by [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose positron emission tomography ...

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of micrometastases by radiologic imaging and the success in their therapeutic eradication remain limited.
While animal models have proven to be invaluable tools for cancer research1, the monitoring/visualization of micrometastases remains a challenge and inaccurate evaluation of metastatic spread in preclinical studies potentially leads to disappointing results in clinical trials2. Consequently, there is great interest in refining the methods to finally allow reproducible and reliable detection of metastases down to the single cell level in normal tissue. The main focus therefore is on techniques, which allow the detection of tumor cells in vivo, like micro-computer tomography (micro-CT), positron emission tomography (PET), bioluminescence or fluorescence imaging3,4. We are currently optimizing these techniques for in vivo monitoring of primary tumor growth and metastasis in different osteosarcoma models. Some of these techniques can also be used for ex vivo analysis of metastasis beside classical methods like qPCR5, FACS6 or different types of histological staining. As a benchmark, we have established in the present study the stable transfection or transduction of tumor cells with the lacZ gene encoding the bacterial enzyme &beta;-galactosidase that metabolizes the chromogenic substrate 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside (X-Gal) to an insoluble indigo blue dye7 and allows highly sensitive and selective histochemical blue staining of tumor cells in mouse tissue ex vivo down to the single cell level as shown here. This is a low-cost and not equipment-intensive tool, which allows precise validation of metastasis8 in studies assessing new anticancer therapies9-11. A limiting factor of X-gal staining is the low contrast to e.g. blood-related red staining of well vascularized tissues. In lung tissue this problem can be solved by in-situ lung perfusion, a technique that was recently established by Borsig et al.12 who perfused the lungs of mice under anesthesia to clear them from blood and to fix and embed them in-situ under inflation through the trachea. This method prevents also the collapse of the lung and thereby maintains the morphology of functional lung alveoli, which improves the quality of the tissue for histological analysis. In the present study, we describe a new protocol, which takes advantage of a combination of X-gal staining of lacZ-expressing tumor cells and in-situ perfusion and fixation of lung tissue. This refined protocol allows high-sensitivity detection of single metastatic cells in the lung and enabled us in a recent study to detect "dormant" lung micrometastases in a mouse model13, which was originally described to be non-metastatic14.

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

The novel protocol reported in the present study allows selective detection of lung metastases at single cell resolution in mice by combined in-situ lung perfusion and fixation and X-Gal staining of lacZ-tagged tumor cells.

복합에 의한 마우스의 싱글 셀 해상도에서 폐 Metastases의 향상된 시각화<em&gt;에서 시츄</em폐 조직 및 X-걸의 착색의&gt; 재관류<em&gt; lacZ</em&gt; 태그 종양 세포

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of ...

의학

A Standardized Method for Measuring Internal Lung Surface Area via Mouse Pneumonectomy and Prosthesis Implantation

Pulmonary morphology, physiology, and respiratory functions change in both physiological and pathological conditions. Internal lung surface area (ISA), representing the gas-exchange capacity of the lung, is a critical criterion to assess respiratory function. However, observer bias can significantly influence measured values for lung morphological parameters. The protocol that we describe here minimizes variations during measurements of two morphological parameters used for ISA calculation: internal lung volume (ILV) and mean linear intercept (MLI). Using ISA as a morphometric and functional parameter to determine the outcome of alveolar regeneration in both pneumonectomy (PNX) and prosthesis implantation mouse models, we found that the increased ISA following PNX treatment was significantly blocked by implantation of a prosthesis into the thoracic cavity1. The ability to accurately quantify ISA is not only expected to improve the reliability and reproducibility of lung function studies in injured-induced alveolar regeneration models, but also to promote mechanistic discoveries of multiple pulmonary diseases.

Internal lung surface area (ISA) is a critical criterion for assessing lung morphology and physiology in lung diseases and injury-induced alveolar regeneration. We describe here a standardized method that can minimize the measurement bias for ISA in both lung pneumonectomy and prosthesis implantation mouse models.

마우스 폐 전 절제술 및 보철물 삽입을 통한 내시경 표면 측정을위한 표준화 된 방법

Pulmonary morphology, physiology, and respiratory functions change in both physiological and pathological conditions. Internal lung surface area (ISA), ...

발생학

Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research

The ability to instill live agents, cells, or chemicals directly into the lung without injuring or killing the mice is an important tool in lung cancer research. Although there are a number of methods that have been published showing how to intubate mice for pulmonary function measurements, none are without potential problems for rapid tracheal instillation in large cohorts of mice. In the present paper, a simple and quick method is described that enables an investigator to carry out such instillations in an efficient manner. The method does not require any special tools or lighting and can be learned with very little practice. It involves anesthetizing a mouse, making a small incision in the neck to visualize the trachea, and then inserting an intravenous catheter directly. The small incision is quickly closed with tissue adhesive, and the mice are allowed to recover. A skilled student or technician can do instillations at an average rate of 2 min/mouse. Once the cancer is established, there is frequently a need for quantitative histologic analysis of the lungs. Traditionally pathologists usually do not bother to standardize lung inflation during fixation, and analyses are often based on a scoring system that can be quite subjective. While this may sometime be sufficiently adequate for gross estimates of the size of a lung tumor, any proper stereological quantification of lung structure or cells requires a reproducible fixation procedure and subsequent lung volume measurement. Here we describe simple reliable procedures for both fixing the lungs under pressure and then accurately measuring the fixed lung volume. The only requirement is a laboratory balance that is accurate over a range of 1 mg&#8211;300 g. The procedures presented here thus could greatly improve the ability to create, treat, and analyze lung cancers in mice.

The goal of this paper is to describe simple methods that will greatly aid in the setup and analysis of mouse lungs with lung cancer or other pathologies. We present 3 protocols to simply and reliably carry out lung instillations, fixation, and lung volume measurements.

마우스 폐 암 연구에 유용한 점안 및 고정 방법

The ability to instill live agents, cells, or chemicals directly into the lung without injuring or killing the mice is an important tool in lung cancer ...

Pre-Conditioning the Airways of Mice with Bleomycin Increases the Efficiency of Orthotopic Lung Cancer Cell Engraftment

Lung cancer is a deadly treatment refractory disease that is biologically heterogeneous. To understand and effectively treat the full clinical spectrum of thoracic malignancies, additional animal models that can recapitulate diverse human lung cancer subtypes and stages are needed. Allograft or xenograft models are versatile and enable the quantification of tumorigenic capacity in vivo, using malignant cells of either murine or human origin. However, previously described methods of lung cancer cell engraftment have been performed in non-physiological sites, such as the flank of mice, due to the inefficiency of orthotopic transplantation of cells into the lungs. In this study, we describe a method to enhance orthotopic lung cancer cell engraftment by pre-conditioning the airways of mice with the fibrosis inducing agent bleomycin. As a proof-of-concept experiment, we applied this approach to engraft tumor cells of the lung adenocarcinoma subtype, obtained from either mouse or human sources, into various strains of mice. We demonstrate that injuring the airways with bleomycin prior to tumor cell injection increases the engraftment of tumor cells from 0-17% to 71-100%. Significantly, this method enhanced lung tumor incidence and subsequent outgrowth using different models and mouse strains. In addition, engrafted lung cancer cells disseminate from the lungs into relevant distant organs. Thus, we provide a protocol that can be used to establish and maintain new orthotopic models of lung cancer with limiting amounts of cells or biospecimen and to quantitatively assess the tumorigenic capacity of lung cancer cells in physiologically relevant settings.

We describe a method to significantly enhance orthotopic engraftment of lung cancer cells into the murine lungs by pre-conditioning the airways with injury. This approach may also be applied to study stromal interactions within the lung microenvironment, metastatic dissemination, lung cancer co-morbidities, and to more efficiently generate patient derived xenografts.

Orthotopic 폐 암 세포 Engraftment의 효율성 증가 사전 조건 Bleomycin와 쥐의 기도

Lung cancer is a deadly treatment refractory disease that is biologically heterogeneous. To understand and effectively treat the full clinical spectrum of ...

Air-Inflation of Murine Lungs with Vascular Perfusion-Fixation

Lung histology is often used to investigate the contributions provided by airspace cells during lung homeostasis and disease pathogenesis. However, commonly used instillation-based fixation methods can displace airspace cells and mucus into terminal airways and can alter tissue morphology. In comparison, vascular perfusion-fixation techniques are superior at preserving the location and morphology of cells within airspaces and the mucosal lining. However, if positive airway pressure is not simultaneously applied, regions of the lungs may collapse and capillaries may bulge into the alveolar spaces, leading to distortion of the lung anatomy. Herein, we describe an inexpensive method for air-inflation during vascular perfusion-fixation to preserve the morphology and location of airway and alveolar cells and interstitium in murine lungs for downstream histologic studies. Constant air pressure is delivered to the lungs via the trachea from a sealed, air-filled chamber that maintains pressure via an adjustable liquid column while fixative is perfused through the right ventricle.

Presented is a method for air-inflation with vascular perfusion-fixation of the lungs that preserves the location of cells within airways, alveoli and interstitium for structure-function analyses. Constant airway pressure is maintained with an air-inflation chamber while fixative is perfused via the right ventricle. Lungs are processed for histologic studies.

혈관 관혈 -고정을 가진 뮤린 폐의 공기 인플레이션

Lung histology is often used to investigate the contributions provided by airspace cells during lung homeostasis and disease pathogenesis. However, ...

신경과학

<meta charset="utf8"></head><body>생쥐 폐 이식에서 세포 역학의 실시간 모니터링

Intravital Two-Photon Microscopy of the Transplanted Mouse Lung

Complications after lung transplantation are largely related to the host immune system responding to the graft. Such immune responses are regulated by crosstalk between donor and recipient cells. A better understanding of these processes relies on the use of preclinical animal models and is aided by an ability to study intra-graft immune cell trafficking in real-time. Intravital two-photon microscopy can be used to image tissues and organs for depths up to several hundred microns with minimal photodamage, which affords a great advantage over single-photon confocal microscopy. Selective use of transgenic mice with promoter-specific fluorescent protein expression and/or adoptive transfer of fluorescent dye-labeled cells during intravital two-photon microscopy allows for the dynamic study of single cells within their physiologic environment. Our group has developed a technique to stabilize mouse lungs, which has enabled us to image cellular dynamics in na&#239;ve lungs and orthotopically transplanted pulmonary grafts. This technique allows for detailed assessment of cellular behavior within the vasculature and in the interstitium, as well as for examination of interactions between various cell populations. This procedure can be readily learned and adapted to study immune mechanisms that regulate inflammatory and tolerogenic responses after lung transplantation. It can also be expanded to the study of other pathogenic pulmonary conditions.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: 생체 내 이미징을 통한 폐 이식 면역학의 발전

Here, we present a protocol to intravitally image the transplanted mouse left lung using two-photon microscopy. This represents a valuable tool for studying cellular dynamics and interactions in real-time following murine lung transplantation.

이식된 마우스 폐의 생체 내 2광자 현미경

Complications after lung transplantation are largely related to the host immune system responding to the graft. Such immune responses are regulated by ...

종양 연고학을 위한 마우스 폐의 관류 및 인플레이션

요약

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이 비디오의 챕터

진공 안정 이미징 창으로 폐의 장기 고해상도 생체 내에 현미경

¹⁸F FDG PET/CT 영상 및 정량 조직학 폐암의 마우스 모델에서 포도 당 물질 대사에 있는 동적인 변화를 측정 하

복합에 의한 마우스의 싱글 셀 해상도에서 폐 Metastases의 향상된 시각화

마우스 폐 전 절제술 및 보철물 삽입을 통한 내시경 표면 측정을위한 표준화 된 방법

마우스 폐 암 연구에 유용한 점안 및 고정 방법

Orthotopic 폐 암 세포 Engraftment의 효율성 증가 사전 조건 Bleomycin와 쥐의 기도

혈관 관혈 -고정을 가진 뮤린 폐의 공기 인플레이션

이식된 마우스 폐의 생체 내 2광자 현미경

이식된 마우스 폐의 생체 내 2광자 현미경

이식된 마우스 폐의 생체 내 2광자 현미경