Name: perfusion and inflation of the mouse lung for tumor histology
Uploaded: 2020-08-06T15:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 24 s
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A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo Centro Nacional de Promoção de Ciências Translacionais sob o prêmio número UL1TR003096 (MDE), National Heart, Lung, and Blood Institute Predoctoral Fellowship in Lung Diseases Training Program 5T32HL134640 (MLD).

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade do Alabama em Birmingham.
1. Protocolo experimental
<ol><li>Sacrifique o mouse usando um método IACUC aprovado. Aqui, usamos luxação cervical de um camundongo anestesiado com 5% de isoflurane. Use um mouse apropriado para o estudo; aqui, usamos um mouse FVB de 8 semanas de idade</li>
	<li>Utilizando uma tesoura cirúrgica, faça uma incisão horizontal de 3,5-5 mm no meio do abdômen inferior. Em seguida, insira uma tesoura cirúrgica no pequeno orifício criado a partir da incisão e corte verticalmente até a linha média central até um pouco abaixo do pescoço do mouse.</li>
	<li>Puxe a pele para trás com os dedos e inspecione os linfonodos axilares.</li>
	<li>Usando uma tesoura cirúrgica, faça uma incisão lateral de 3,5 mm para abrir a cavidade abdominal e, em seguida, corte na direção anterior até o fundo do tórax. Inspecione os órgãos na cavidade abdominal: fígado, baço, rins, etc.</li>
	<li>Com o plano da tesoura cirúrgica, ou usando fórceps, mova o fígado para expor o diafragma. Inspecione o diafragma para crescimento do tumor ou metástases. Em seguida, corte suavemente o diafragma no lado direito do operador, permitindo que ele se expanda. Corte suavemente o diafragma da direita para a esquerda para expor a cavidade torácica e os pulmões. Tenha cuidado para não cortar os pulmões.</li>
	<li>Corte através do extremo lateral da caixa torácica esquerda (à direita do operador) para inspecionar o lobo esquerdo dos pulmões.</li>
	<li>Mova suavemente os lóbulos direito do pulmão para fora do caminho e corte o extremo lateral da caixa torácica direita e remova a caixa torácica. NOTA: A remoção da caixa torácica é opcional, embora a remoção permita uma visão mais clara da inflação pulmonar posterior.<ol>
<li>Se for necessário tecido pulmonar fresco ou congelado, use fórceps hemostat para fixar os brônquios do lobo esquerdo e ressecular o pulmão esquerdo usando uma tesoura cirúrgica antes da perfusão.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Usando os fórceps para levantar o tecido que cobre a traqueia, corte qualquer excesso de tecido. Em seguida, corte suavemente o tecido fino que reveste a traqueia para expor as vias aéreas.</li>
	<li>Corte a artéria renal com uma tesoura cirúrgica.</li>
	<li>Para permear os pulmões, use uma seringa de 3 mL com uma agulha de 22 G para injetar 1x PBS com heparina de 10 U/mL no ventrículo direito do coração. Perfundir lentamente os pulmões a aproximadamente 300 μL/s com PBS/heparina. Os pulmões ficam brancos. 2,5 mL de PBS são geralmente usados nesta etapa.</li>
	<li>Para a inflação pulmonar, use uma seringa de 3 mL com uma agulha de 22 G, desta vez mantida paralela à traqueia. Insira a agulha na traqueia e injete 10% de formalina com taxa de fluxo não superior a ~200 μL/s até que os pulmões tenham inflado completamente. Uma vez que os pulmões são inflados, formalina vai recuar para fora da traqueia. Segure a agulha no lugar por mais alguns segundos e depois retire-se.<ol>
<li>(Opcional) Antes de retirar a agulha e a inflação pulmonar, use linha de sutura para amarrar a traqueia. Para isso, use 4 polegadas de rosca de sutura segurando o ponto da rosca com um pequeno par de fórceps. Coloque a rosca no lado dorsal da traqueia e puxe para fazer um loop em torno da agulha. Em seguida, faça um nó de mão em torno da agulha. Puxe o nó apertado, retire a agulha da traqueia, feche o nó.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Use fórceps para levantar o coração, inserir tesouras cirúrgicas diretamente atrás dos pulmões e cortar tecido conjuntivo enquanto o lifting do coração para ressecção dos pulmões.</li>
	<li>Corte o coração para removê-lo dos pulmões.</li>
	<li>Coloque os pulmões com um rotulado com o ID do mouse ou estude o ID. Coloque o em formalina 10% tamponada e fixe por 24-48 h. Os pulmões podem ser deixados em fixação por mais de um ano, se desejar.</li>
	<li>Transfira o contendo os pulmões para 70% de etanol e prossiga para o processamento para histologia.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hsia, C. C., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R., Structure, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+official+research+policy+statement+of+the+American+Thoracic+Society/European+Respiratory+Society:+standards+for+quantitative+assessment+of+lung+structure.">An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: standards for quantitative assessment of lung structure.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 394-418 (2010).</li><li>Vasilescu, D. M., Knudsen, L., Ochs, M., Weibel, E. R., Hoffman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+murine+lung+preparation+for+detailed+structural+evaluation+via+micro-computed+tomography.">Optimized murine lung preparation for detailed structural evaluation via micro-computed tomography.</a> Journal of Applied Physiology. 112 (1), 159-166 (2012).</li><li>Blumler, P., Acosta, R. H., Thomas-Semm, A., Reuss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+fixation+for+the+preservation+of+air+spaces.">Lung fixation for the preservation of air spaces.</a> Experimental Lung Research. 30 (1), 73-82 (2004).</li><li>Oldmixon, E. H., Suzuki, S., Butler, J. P., Hoppin, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion+dehydration+fixes+elastin+and+preserves+lung+air-space+dimensions.">Perfusion dehydration fixes elastin and preserves lung air-space dimensions.</a> Journal of Applied Physiology. 58 (1), 105-113 (1985).</li><li>Braber, S., Verheijden, K. A., Henricks, P. A., Kraneveld, A. D., Folkerts, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+fixation+methods+on+lung+morphology+in+a+murine+model+of+emphysema.">A comparison of fixation methods on lung morphology in a murine model of emphysema.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 299 (6), 843-851 (2010).</li><li>Renne, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendation+of+optimal+method+for+formalin+fixation+of+rodent+lungs+in+routine+toxicology+studies.">Recommendation of optimal method for formalin fixation of rodent lungs in routine toxicology studies.</a> Toxicologic Pathology. 29 (5), 587-589 (2001).</li><li>Limjunyawong, N., Mock, J., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instillation+and+Fixation+Methods+Useful+in+Mouse+Lung+Cancer+Research.">Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research.</a> Journal of Visualized Experiments. (102), e52964 (2015).</li><li>Lum, H., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+10%+formalin+fixation+on+fixed+lung+volume+and+lung+tissue+shrinkage.+A+comparison+of+eleven+laboratory+species.">Effects of 10% formalin fixation on fixed lung volume and lung tissue shrinkage. A comparison of eleven laboratory species.</a> American Review of Respiratory Disease. 132 (5), 1078-1083 (1985).</li><li>Edmonds, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-31+initiates+lung+tumorigenesis+and+promotes+mutant+KRAS-driven+lung+cancer.">MicroRNA-31 initiates lung tumorigenesis and promotes mutant KRAS-driven lung cancer.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (1), 349-364 (2016).</li><li>Zhao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wogonin+suppresses+melanoma+cell+B16-F10+invasion+and+migration+by+inhibiting+Ras-medicated+pathways.">Wogonin suppresses melanoma cell B16-F10 invasion and migration by inhibiting Ras-medicated pathways.</a> PLoS One. 9 (9), 106458 (2014).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O procedimento descrito acima para a perfusão, inflação e fixação de pulmões de camundongos é ideal para uma preparação rápida e eficiente dos pulmões do camundongo para histologia de tumores pulmonares e análise patologia. O procedimento não requer nenhum equipamento especial e pode ser realizado em menos de 6 minutos por mouse. O procedimento não requer um volume fixo para inflação nem pressão constante do fluido. Como este procedimento não é padronizado, não é recomendado para aqueles que desejam realizar análises esterológicas ou morfométricas do pulmão. Os procedimentos em que essa padronização é necessária foram melhor descritos1,7.
Os passos mais críticos deste protocolo são a perfusão e a inflação. É importante perfumar o ventrículo direito do coração, enquanto que se a perfusão for feita através do ventrículo esquerdo, os pulmões não perfumam. É fácil dizer se a perfusão é feita corretamente, pois os pulmões ficarão brancos. A instilação da fixação através da traqueia permite a inflação dos pulmões, o que permite uma análise histológica mais fácil a jusante da arquitetura pulmonar. É importante parar a administração de fixação assim que os pulmões se expandirem totalmente, pois a super inflação pode causar quebra da parede alveolar e o aparecimento de enfisema. Uma vez que os pulmões são inflados, alguma formalina vai recuar para fora da traqueia. Isso é normal e não afeta a análise histológica a jusante; no entanto, se esta é uma preocupação a traqueia pode ser amarrada antes de extirer os pulmões.
Enquanto este protocolo usa formalina 10% tamponada para corrigir os pulmões, que é o fixador mais comumente recomendado5,6, há relatos de artefatos introduzidos por este fixador, ou seja, encolhimento do tecido pulmonar1,8. Se isso for uma preocupação, siga as diretrizes da Sociedade Torácica Americana e da Sociedade Respiratória Europeia para a avaliação da estrutura pulmonar1. Outro potencial fixador não comumente recomendado, mas que pode ser útil é a solução de Bouin, que pode fornecer melhor contraste para a avaliação dos nódulos da superfície pulmonar9,10. Em resumo, o protocolo aqui descrito fornece um método robusto e simples para a fixação de pulmões de camundongos para histologia tumoral.

Uma variedade de modelos de camundongos de oncogênese pulmonar e metástase de câncer para o pulmão existem que vão desde GEMMs complexos até modelos induzidos por cancerígenos até modelos sinéticos e xenoenxertos, onde as células cancerígenas são injetadas via intracardiac, intrathoracic, a veia da cauda ou outros métodos para estabelecer tumores dentro do pulmão. Todos esses modelos compartilham a necessidade comum de avaliação histológica da histologia pulmonar e da patologia. Assim, é necessário ter um método robusto, porém rápido, para realizar necropsias de camundongos enquanto perfumia os pulmões para remover o excesso de sangue, e inflar e fixar os pulmões para visualizar claramente a arquitetura pulmonar. A velocidade é um componente crítico deste procedimento, pois pode ser necessário coletar os pulmões de dezenas de ratos em um único ponto de tempo. Este procedimento pode ser realizado em menos de 6 minutos por mouse.
Embora este procedimento seja mais do que suficiente para avaliar a histologia tumoral, não é recomendado para aqueles que desejam realizar medições estereométricas ou morfômicas dos pulmões. Tais medidas exigem que a inflação pulmonar seja padronizada, assim como o cálculo da área de superfície absoluta do pulmão, volume absoluto e tamanho alveolar e número1. Este método também não é ideal para algumas abordagens de imagem. Por exemplo, a imagem dos pulmões via μCT para análise morfométrica ex vivo requer que os pulmões permaneçam preenchidos com ar2. Quando a preservação dos espaços e dimensões do ar são a principal preocupação, recomenda-se fixar os pulmões por técnicas de desidratação por perfusão3,4. Uma das maiores preocupações desse modelo é o potencial de ruptura das paredes alveolares, diminuindo seu uso em estudos de enfisema; no entanto, o procedimento recomendado para fixação de pulmões para o estudo do enfisema ainda é bastante semelhante, pois recomenda-se fixar os pulmões por instilação intratraqueal de 10% de formalina (semelhante ao protocolo descrito aqui) sob pressão constante do fluido ou por fixação in situ5.
A vantagem do procedimento descrito aqui é que ele não requer pressão constante do fluido, em vez de inflar os pulmões até que eles tenham se expandido totalmente, diminuindo assim o tempo necessário para o procedimento. O procedimento aqui descrito se assemelha muito aos métodos recomendados por um armamento da Sociedade de Patologia Toxicológica, onde um subcomitê foi formado para recomendar os melhores métodos de fixação pulmonar para estudos toxicológicos. A maioria dos cientistas deste subcomitê recomendou a fixação dos pulmões por instilação intratraqueal com uma seringa, embora houvesse recomendações variadas sobre o tempo que o pulmão foi deixado na fixação6. Assim, enquanto existe uma variedade de métodos de inflação e fixação pulmonar, o método descrito aqui é proposto para ser o método ideal para inflar rapidamente e fixar os pulmões para avaliação histológica do tumor a jusante.

<table><tbody><tr><td>10% buffered formalin</td><td>Fisher</td><td>23-245685</td><td></td></tr><tr><td>22 G Needle</td><td>BD</td><td>305155</td><td></td></tr><tr><td>3 mL syringe</td><td>BD</td><td>309656</td><td></td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td>Decon</td><td>2405</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-8595</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Fisher</td><td>H19</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>Surgical scissors</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-8428</td><td></td></tr></tbody></table>

perfusion and inflation of the mouse lung for tumor histology

A capacidade de avaliar a histologia pulmonar é fundamental para os campos da pesquisa sobre câncer de pulmão e metástase do câncer. É igualmente importante realizar necropsias de forma rápida e eficiente a partir de estudos sem sacrificar a qualidade dos tecidos adquiridos. O objetivo deste protocolo é apresentar um método para perfusear rapidamente, inflar e fixar pulmões de camundongos para análise histológica a jusante. Este método não padroniza a inflação pulmonar; assim, não requer procedimentos ou equipamentos especiais e, em vez disso, simplesmente instila fixação diretamente através da traqueia após a perfusão através do coração. Isso permite uma estimativa suficiente do tamanho do tumor, histologia e pontuação. Isso também permite a coleta de tecido congelado antes da fixação do tecido pulmonar. Este método é limitado na forma de não permitir quantificação morfométrica posterior do pulmão; no entanto, é mais do que suficiente para a análise de tumores pulmonares de modelos de camundongos geneticamente modificados (GEMMs), modelos singênicos, bem como estudos de tumor xenoenxerto e metástase.

O protocolo acima permite a perfusão rápida, inflação e fixação de pulmões de camundongos. Os números abaixo representam a importância de cada etapa. A Figura 1 retrata os pulmões manchados de H&E que foram perfundidos com PBS e pulmões nos quais o passo de perfusão foi ignorado ou os pulmões não conseguiram perfumar corretamente. Como mostrado, o excesso de sangue nos pulmões mal perfundidos cria histologia menos do que ideal e pode torná-lo desafiador observar totalmente a arquitetura pulmonar. A Figura 2 demonstra tanto a importância da inflação quanto os perigos da inflação excessiva. É mais difícil identificar áreas de hiperplasia em pulmões não inflados devido à compressão e proximidade dos alvéolos; no entanto, nos pulmões superinflados, muitas das paredes alveolares foram quebradas e isso pode ser confundido com enfisema se não cuidadoso. A Figura 3 retrata a histologia tumoral em pulmões que foram perfundidos e inflados usando a técnica aqui descrita.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60605/60605fig01.jpg"> Figura 1: Mancha de H&E representativa de pulmões perfumados e não perfundidos. (A) Pulmões perfundidos com PBS. (B) Pulmões não perfundidos. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/60605/60605fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60605/60605fig02.jpg"> Figura 2: Mancha de H&E representativa de pulmões inflados, não inflados e superinflados. (A) Os pulmões foram inflados e fixados com 10% de formalina até que os pulmões se expandiam totalmente. (B) Os pulmões não foram inflados através da traqueia e, em vez disso, diretamente colocados em 10% de formalina. (C) Os pulmões foram inflados e fixados com 10% de formalina, mas 10% de formalina foi continuamente empurrada para os pulmões após a expansão total resultando em superinflação. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/60605/60605fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60605/60605fig03.jpg"> Figura 3: Mancha de H&E representativa de pulmões de camundongos perfumados e inflados. (A) Os tumores pulmonares foram induzidos usando o uretano cancerígeno químico. (B) Metástases pulmonares espontâneas de uma linha celular xenógrafa humana <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/60605/60605fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Perfusion and Inflation of the Mouse Lung for Tumor Histology

O objetivo deste método é apresentar um método simples e eficiente para a perfusão, inflação e fixação de pulmões de camundongos para o exame da patologia do tumor pulmonar e avaliação de metástases no pulmão.

Perfusão e Inflação do Pulmão do Rato para Histologia tumoral

The ability to evaluate lung histology is critical for the fields of lung cancer research and cancer metastasis. It is equally important to perform ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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Long-term High-Resolution Intravital Microscopy in the Lung with a Vacuum Stabilized Imaging Window

Metastasis to secondary sites such as the lung, liver and bone is a traumatic event with a mortality rate of approximately 90% 1. Of these sites, the lung is the most difficult to assess using intravital optical imaging due to its enclosed position within the body, delicate nature and vital role in sustaining proper physiology. While clinical modalities (positron emission tomography (PET), magnetic resonance imaging (MRI) and computed tomography (CT)) are capable of providing noninvasive images of this tissue, they lack the resolution necessary to visualize the earliest seeding events, with a single pixel consisting of nearly a thousand cells. Current models of metastatic lung seeding postulate that events just after a tumor cell&#39;s arrival are deterministic for survival and subsequent growth. This means that real-time intravital imaging tools with single cell resolution 2 are required in order to define the phenotypes of the seeding cells and test these models. While high resolution optical imaging of the lung has been performed using various ex vivo preparations, these experiments are typically single time-point assays and are susceptible to artifacts and possible erroneous conclusions due to the dramatically altered environment (temperature, profusion, cytokines, etc.) resulting from removal from the chest cavity and circulatory system 3. Recent work has shown that time-lapse intravital optical imaging of the intact lung is possible using a vacuum stabilized imaging window 2,4,5 however, typical imaging times have been limited to approximately 6 hr. Here we describe a protocol for performing long-term intravital time-lapse imaging of the lung utilizing such a window over a period of 12 hr. The time-lapse image sequences obtained using this method enable visualization and quantitation of cell-cell interactions, membrane dynamics and vascular perfusion in the lung. We further describe an image processing technique that gives an unprecedentedly clear view of the lung microvasculature.

This protocol describes the use of multiphoton microscopy to perform long-term high-resolution, single cell imaging of the intact lung in real time using a vacuum stabilized imaging window.

De longo prazo de alta resolução Intravital Microscopia no pulmão com um vácuo estabilizado Janela de imagem

Metastasis to secondary sites such as the lung, liver and bone is a traumatic event with a mortality rate of approximately 90% 1. Of these sites, the lung ...

Pesquisa do câncer

Utilizing 18F-FDG PET/CT Imaging and Quantitative Histology to Measure Dynamic Changes in the Glucose Metabolism in Mouse Models of Lung Cancer

A hallmark of advanced tumors is a switch to aerobic glycolysis that is readily measured by [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose positron emission tomography (18F-FDG PET) imaging. Co-mutations in the KRAS proto-oncogene and the LKB1 tumor suppressor gene are frequent events in lung cancer that drive hypermetabolic, glycolytic tumor growth. A critical pathway regulating the growth and metabolism of these tumors is the mechanistic target of the rapamycin (mTOR) pathway, which can be effectively targeted using selective catalytic mTOR kinase inhibitors. The mTOR inhibitor MLN0128 suppresses glycolysis in mice bearing tumors with Kras and Lkb1 co-mutations, referred to as KL mice. The therapy response in KL mice is first measured by 18F-FDG PET and computed tomography (CT) imaging before and after the delivery of MLN0128. By utilizing 18F-FDG PET/CT, researchers are able to measure dynamic changes in the glucose metabolism in genetically engineered mouse models (GEMMs) of lung cancer following a therapeutic intervention with targeted therapies. This is followed by ex vivo autoradiography and a quantitative immunohistochemical (qIHC) analysis using morphometric software. The use of qIHC enables the detection and quantification of distinct changes in the biomarker profiles following treatment as well as the characterization of distinct tumor pathologies. The coupling of PET imaging to quantitative histology is an effective strategy to identify metabolic and therapeutic responses in vivo in mouse models of disease.

Utilizing 18F-FDG PET/CT Imaging and Quantitative Histology to Measure Dynamic Changes in the Glucose Metabolism in Mouse Models of Lung Cancer

In this protocol, we describe how to utilize [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose positron emission tomography and computed tomography (18F-FDG PET/CT) imaging to measure the tumor metabolic response to the targeted therapy MLN0128 in a Kras/Lkb1 mutant mouse model of lung cancer and coupled imaging with high resolution ex vivo autoradiography and quantitative histology.

Utilizando 18F-FDG PET-CT Imaging e histologia quantitativa para medir mudanças dinâmicas no metabolismo glicose em modelos de Mouse de câncer de pulmão

A hallmark of advanced tumors is a switch to aerobic glycolysis that is readily measured by [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose positron emission tomography ...

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of micrometastases by radiologic imaging and the success in their therapeutic eradication remain limited.
While animal models have proven to be invaluable tools for cancer research1, the monitoring/visualization of micrometastases remains a challenge and inaccurate evaluation of metastatic spread in preclinical studies potentially leads to disappointing results in clinical trials2. Consequently, there is great interest in refining the methods to finally allow reproducible and reliable detection of metastases down to the single cell level in normal tissue. The main focus therefore is on techniques, which allow the detection of tumor cells in vivo, like micro-computer tomography (micro-CT), positron emission tomography (PET), bioluminescence or fluorescence imaging3,4. We are currently optimizing these techniques for in vivo monitoring of primary tumor growth and metastasis in different osteosarcoma models. Some of these techniques can also be used for ex vivo analysis of metastasis beside classical methods like qPCR5, FACS6 or different types of histological staining. As a benchmark, we have established in the present study the stable transfection or transduction of tumor cells with the lacZ gene encoding the bacterial enzyme &beta;-galactosidase that metabolizes the chromogenic substrate 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside (X-Gal) to an insoluble indigo blue dye7 and allows highly sensitive and selective histochemical blue staining of tumor cells in mouse tissue ex vivo down to the single cell level as shown here. This is a low-cost and not equipment-intensive tool, which allows precise validation of metastasis8 in studies assessing new anticancer therapies9-11. A limiting factor of X-gal staining is the low contrast to e.g. blood-related red staining of well vascularized tissues. In lung tissue this problem can be solved by in-situ lung perfusion, a technique that was recently established by Borsig et al.12 who perfused the lungs of mice under anesthesia to clear them from blood and to fix and embed them in-situ under inflation through the trachea. This method prevents also the collapse of the lung and thereby maintains the morphology of functional lung alveoli, which improves the quality of the tissue for histological analysis. In the present study, we describe a new protocol, which takes advantage of a combination of X-gal staining of lacZ-expressing tumor cells and in-situ perfusion and fixation of lung tissue. This refined protocol allows high-sensitivity detection of single metastatic cells in the lung and enabled us in a recent study to detect "dormant" lung micrometastases in a mouse model13, which was originally described to be non-metastatic14.

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

The novel protocol reported in the present study allows selective detection of lung metastases at single cell resolution in mice by combined in-situ lung perfusion and fixation and X-Gal staining of lacZ-tagged tumor cells.

Visualização melhorada de metástases pulmonares em Resolução única célula em Ratos por Combinado<em&gt; In-situ</em&gt; Perfusão do tecido pulmonar e X-Gal coloração de<em&gt; LacZ</em&gt;-Tagged Células Tumorais

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of ...

Medicina

A Standardized Method for Measuring Internal Lung Surface Area via Mouse Pneumonectomy and Prosthesis Implantation

Pulmonary morphology, physiology, and respiratory functions change in both physiological and pathological conditions. Internal lung surface area (ISA), representing the gas-exchange capacity of the lung, is a critical criterion to assess respiratory function. However, observer bias can significantly influence measured values for lung morphological parameters. The protocol that we describe here minimizes variations during measurements of two morphological parameters used for ISA calculation: internal lung volume (ILV) and mean linear intercept (MLI). Using ISA as a morphometric and functional parameter to determine the outcome of alveolar regeneration in both pneumonectomy (PNX) and prosthesis implantation mouse models, we found that the increased ISA following PNX treatment was significantly blocked by implantation of a prosthesis into the thoracic cavity1. The ability to accurately quantify ISA is not only expected to improve the reliability and reproducibility of lung function studies in injured-induced alveolar regeneration models, but also to promote mechanistic discoveries of multiple pulmonary diseases.

Internal lung surface area (ISA) is a critical criterion for assessing lung morphology and physiology in lung diseases and injury-induced alveolar regeneration. We describe here a standardized method that can minimize the measurement bias for ISA in both lung pneumonectomy and prosthesis implantation mouse models.

Um Método Padronizado para Medição da Superfície de Pulmão Interna via Neumonectomia de Mouse e Implante de Prótese

Pulmonary morphology, physiology, and respiratory functions change in both physiological and pathological conditions. Internal lung surface area (ISA), ...

Biologia do Desenvolvimento

Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research

The ability to instill live agents, cells, or chemicals directly into the lung without injuring or killing the mice is an important tool in lung cancer research. Although there are a number of methods that have been published showing how to intubate mice for pulmonary function measurements, none are without potential problems for rapid tracheal instillation in large cohorts of mice. In the present paper, a simple and quick method is described that enables an investigator to carry out such instillations in an efficient manner. The method does not require any special tools or lighting and can be learned with very little practice. It involves anesthetizing a mouse, making a small incision in the neck to visualize the trachea, and then inserting an intravenous catheter directly. The small incision is quickly closed with tissue adhesive, and the mice are allowed to recover. A skilled student or technician can do instillations at an average rate of 2 min/mouse. Once the cancer is established, there is frequently a need for quantitative histologic analysis of the lungs. Traditionally pathologists usually do not bother to standardize lung inflation during fixation, and analyses are often based on a scoring system that can be quite subjective. While this may sometime be sufficiently adequate for gross estimates of the size of a lung tumor, any proper stereological quantification of lung structure or cells requires a reproducible fixation procedure and subsequent lung volume measurement. Here we describe simple reliable procedures for both fixing the lungs under pressure and then accurately measuring the fixed lung volume. The only requirement is a laboratory balance that is accurate over a range of 1 mg&#8211;300 g. The procedures presented here thus could greatly improve the ability to create, treat, and analyze lung cancers in mice.

The goal of this paper is to describe simple methods that will greatly aid in the setup and analysis of mouse lungs with lung cancer or other pathologies. We present 3 protocols to simply and reliably carry out lung instillations, fixation, and lung volume measurements.

Instilação e fixação métodos úteis no mouse Lung Cancer Research

The ability to instill live agents, cells, or chemicals directly into the lung without injuring or killing the mice is an important tool in lung cancer ...

Pre-Conditioning the Airways of Mice with Bleomycin Increases the Efficiency of Orthotopic Lung Cancer Cell Engraftment

Lung cancer is a deadly treatment refractory disease that is biologically heterogeneous. To understand and effectively treat the full clinical spectrum of thoracic malignancies, additional animal models that can recapitulate diverse human lung cancer subtypes and stages are needed. Allograft or xenograft models are versatile and enable the quantification of tumorigenic capacity in vivo, using malignant cells of either murine or human origin. However, previously described methods of lung cancer cell engraftment have been performed in non-physiological sites, such as the flank of mice, due to the inefficiency of orthotopic transplantation of cells into the lungs. In this study, we describe a method to enhance orthotopic lung cancer cell engraftment by pre-conditioning the airways of mice with the fibrosis inducing agent bleomycin. As a proof-of-concept experiment, we applied this approach to engraft tumor cells of the lung adenocarcinoma subtype, obtained from either mouse or human sources, into various strains of mice. We demonstrate that injuring the airways with bleomycin prior to tumor cell injection increases the engraftment of tumor cells from 0-17% to 71-100%. Significantly, this method enhanced lung tumor incidence and subsequent outgrowth using different models and mouse strains. In addition, engrafted lung cancer cells disseminate from the lungs into relevant distant organs. Thus, we provide a protocol that can be used to establish and maintain new orthotopic models of lung cancer with limiting amounts of cells or biospecimen and to quantitatively assess the tumorigenic capacity of lung cancer cells in physiologically relevant settings.

We describe a method to significantly enhance orthotopic engraftment of lung cancer cells into the murine lungs by pre-conditioning the airways with injury. This approach may also be applied to study stromal interactions within the lung microenvironment, metastatic dissemination, lung cancer co-morbidities, and to more efficiently generate patient derived xenografts.

Pré-condicionamento das vias aéreas de ratos com bleomicina aumenta a eficiência da enxertia de célula de câncer pulmão ortotópico

Lung cancer is a deadly treatment refractory disease that is biologically heterogeneous. To understand and effectively treat the full clinical spectrum of ...

Air-Inflation of Murine Lungs with Vascular Perfusion-Fixation

Lung histology is often used to investigate the contributions provided by airspace cells during lung homeostasis and disease pathogenesis. However, commonly used instillation-based fixation methods can displace airspace cells and mucus into terminal airways and can alter tissue morphology. In comparison, vascular perfusion-fixation techniques are superior at preserving the location and morphology of cells within airspaces and the mucosal lining. However, if positive airway pressure is not simultaneously applied, regions of the lungs may collapse and capillaries may bulge into the alveolar spaces, leading to distortion of the lung anatomy. Herein, we describe an inexpensive method for air-inflation during vascular perfusion-fixation to preserve the morphology and location of airway and alveolar cells and interstitium in murine lungs for downstream histologic studies. Constant air pressure is delivered to the lungs via the trachea from a sealed, air-filled chamber that maintains pressure via an adjustable liquid column while fixative is perfused through the right ventricle.

Presented is a method for air-inflation with vascular perfusion-fixation of the lungs that preserves the location of cells within airways, alveoli and interstitium for structure-function analyses. Constant airway pressure is maintained with an air-inflation chamber while fixative is perfused via the right ventricle. Lungs are processed for histologic studies.

Inflação do ar dos pulmões murinos com fixação vascular de perfusão

Lung histology is often used to investigate the contributions provided by airspace cells during lung homeostasis and disease pathogenesis. However, ...

Neurociência

<meta charset="utf8"></head><body>Monitoramento em tempo real da dinâmica celular em transplante de pulmão de camundongo

Intravital Two-Photon Microscopy of the Transplanted Mouse Lung

Complications after lung transplantation are largely related to the host immune system responding to the graft. Such immune responses are regulated by crosstalk between donor and recipient cells. A better understanding of these processes relies on the use of preclinical animal models and is aided by an ability to study intra-graft immune cell trafficking in real-time. Intravital two-photon microscopy can be used to image tissues and organs for depths up to several hundred microns with minimal photodamage, which affords a great advantage over single-photon confocal microscopy. Selective use of transgenic mice with promoter-specific fluorescent protein expression and/or adoptive transfer of fluorescent dye-labeled cells during intravital two-photon microscopy allows for the dynamic study of single cells within their physiologic environment. Our group has developed a technique to stabilize mouse lungs, which has enabled us to image cellular dynamics in na&#239;ve lungs and orthotopically transplanted pulmonary grafts. This technique allows for detailed assessment of cellular behavior within the vasculature and in the interstitium, as well as for examination of interactions between various cell populations. This procedure can be readily learned and adapted to study immune mechanisms that regulate inflammatory and tolerogenic responses after lung transplantation. It can also be expanded to the study of other pathogenic pulmonary conditions.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: Avançando na imunologia do transplante de pulmão por meio de imagens intravitais

Here, we present a protocol to intravitally image the transplanted mouse left lung using two-photon microscopy. This represents a valuable tool for studying cellular dynamics and interactions in real-time following murine lung transplantation.

Microscopia intravital de dois fótons do pulmão de camundongo transplantado

Complications after lung transplantation are largely related to the host immune system responding to the graft. Such immune responses are regulated by ...

Perfusão e Inflação do Pulmão do Rato para Histologia tumoral

Resumo

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Capítulos neste vídeo

De longo prazo de alta resolução Intravital Microscopia no pulmão com um vácuo estabilizado Janela de imagem

Utilizando ¹⁸F-FDG PET-CT Imaging e histologia quantitativa para medir mudanças dinâmicas no metabolismo glicose em modelos de Mouse de câncer de pulmão

Visualização melhorada de metástases pulmonares em Resolução única célula em Ratos por Combinado

Um Método Padronizado para Medição da Superfície de Pulmão Interna via Neumonectomia de Mouse e Implante de Prótese

Instilação e fixação métodos úteis no mouse Lung Cancer Research

Pré-condicionamento das vias aéreas de ratos com bleomicina aumenta a eficiência da enxertia de célula de câncer pulmão ortotópico

Inflação do ar dos pulmões murinos com fixação vascular de perfusão

Microscopia intravital de dois fótons do pulmão de camundongo transplantado

Microscopia intravital de dois fótons do pulmão de camundongo transplantado

Microscopia intravital de dois fótons do pulmão de camundongo transplantado