Yüksek Tuzlu Diyet Koşulları Altında Tuza Duyarlı Sıçanlarda Bağırsak Mikrobiyal Hücre Dışı Veziküllerinin Ayrılması ve Diferansiyel Karakterizasyonu

Protokol, yoğunluk gradyan santrifüjlemesi kullanılarak HSD ile beslenen tuza duyarlı sıçanlardan bağırsak mikrobiyal EV'lerinin izolasyonunu açıklar. EV'ler, boyut, morfoloji, bileşim ve mikrobiyota kökenini analiz etmek için nanopartikül izleme, TEM, LPS/BCA testleri ve 16S rRNA dizilimi ile karakterize edildi.

Yüksek tuz alımı, hipertansiyon için önemli bir risk faktörüdür ve altta yatan mekanizması, bağırsak mikrobiyotası tarafından salgılanan hücre dışı veziküller (EV'ler) ile yakından bağlantılı olabilir. Bağırsak mikrobiyotası tarafından üretilen bu EV'ler, yüksek tuzlu bir diyetin (HSD) neden olduğu hipertansiyonun gelişiminde çok önemli bir rol oynayabilecek çeşitli biyoaktif bileşenler taşır. Bu mekanizmayı araştırmak için, EV'leri HSD ile beslenen tuza duyarlı sıçanların bağırsak mikrobiyotasından izole etmek için yoğunluk gradyan santrifüjlemesine dayalı verimli bir ekstraksiyon yöntemi geliştirdik. Partikül boyutu analizi, transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ve lipopolisakkarit (LPS) tespiti sayesinde, bağırsak mikrobiyotası EV'lerinin gradyan dağılımını belirledik ve hassas ekstraksiyon elde ettik. Ayrıca, normal ve HSD grupları arasındaki EV'lerin kökeni ve bileşimsel farklılıklarını analiz etmek için 16S rRNA gen dizilimi kullanıldı ve yüksek tuz alımının bağırsak mikrobiyotası EV'lerinin genetik özellikleri üzerindeki etkisini ortaya koydu. Bu çalışma, tuza bağlı hipertansiyonun altında yatan bağırsak mikrobiyota mekanizmaları hakkında değerli araçlar ve bilimsel bilgiler sağlamakta ve ilgili hastalıkların önlenmesi ve tedavisi için yeni bakış açıları sunmaktadır.

Bağırsak mikrobiyotası mikroflorası veya bağırsak mikroekolojisi olarak da bilinen bağırsak mikrobiyotası, biyolojik gastrointestinal sistemde bulunan on binlerce mikroorganizmadan oluşan bir komplekstir ve insan sağlığının korunmasında çok önemli bir rol oynar¹. Son yıllarda, daha fazla araştırmayla, bağırsak mikrobiyotasının hücre dışı veziküller (EV'ler) üretebildiği ^{bulunmuştur2}. EV'ler, hücrede proteinler, nükleik asitler ve lipitler gibi çeşitli molekülleri taşıyan hücreler tarafından salınan küçük veziküllerdir ^3,4. Diğer mikroplarla⁵, bağırsak epitel hücreleri ve hatta uzak doku ve organlarla⁶ etkileşime girebilirler, böylece insan vücudunun sağlığını^{etkileyebilirler 7,8}. Bu bağırsak mikrobiyotası tarafından üretilen EV'ler ile diyet⁹ arasında sıkı bir bağlantı vardır.

Bağırsak mikrobiyotası tarafından üretilen EV'ler, yüksek tuzlu bir diyetin (HSD) vücut sağlığını etkilediği önemli ajanlar olabilir. HSD sadece bağırsak mikrobiyotasının¹⁰ dengesini doğrudan bozmakla kalmaz, aynı zamanda yararlı bakterilerin (Lactobacillus gibi) sayısında önemli bir azalmaya yol açar11, aynı zamanda zararlı bakterilerin (Bacteroides vb.) çoğalmasını da teşvik eder¹². Bu dengesizlik bağırsak bariyeri fonksiyonunu azaltır ve bağırsak iltihabı riskini artırır. Ek olarak, bir HSD ayrıca bağırsak mikrobiyotasının metabolik aktivitelerini¹³ değiştirerek bağırsaktaki asit-baz dengesini ve besin emilimini daha da etkiler, örneğin çoklu fizyolojik işlevlere sahip kısa zincirli yağ asitlerinin^14,15 üretimini azaltmak gibi.

Bu değişiklikler sadece bağırsak sağlığını etkilemekle kalmaz, aynı zamanda EV'lerin üretimini ve salınımını dolaylı olarak düzenleyebilir ve EV'nin bileşimini ve işlevini değiştirebilir. Yüksek tuzlu ortam, EV'lerin salınması ve taşınması dahil olmak üzere bağırsak hücrelerinin normal fizyolojik fonksiyonlarını etkileyebilir ve böylece EV'lerin hücreler arası bilgi iletimi ve bağışıklık düzenlemesindeki rolünü bozabilir. Aynı zamanda, bağırsak iltihabı, özel işlevlere sahip çeşitli EV'leri^{teşvik edebilir 16} ve bağırsak-organ ekseni ve diğer yollarla tüm vücuda yayılabilir^17,18, bu da hipertansiyonun ortaya çıkması ve gelişimi ile yakından ilişkilidir^19,20, kardiyovasküler²¹ ve serebrovasküler hastalıklar^22,23, obezite^24,25, diyabet²⁶ ve diğer kronik hastalıklar.

Bu nedenle, bu çalışmanın genel amacı, HSD ile beslenen tuza duyarlı sıçanların bağırsak mikrobiyotasından EV'leri çıkarmak için verimli ve güvenilir bir yöntem geliştirmek ve bunların fiziksel özelliklerini, bileşimlerini ve işlevlerini sistematik olarak incelemekti. Yüksek tuzlu bir diyetten sonra kan basıncındaki önemli artışın özellikleri nedeniyle, tuza duyarlı sıçanlar seçildi ve etkili bir ekstraksiyon yöntemi oluşturularak HSD'nin bağırsak mikrobiyotası EV üzerindeki etkisi ortaya çıkarıldı. Yöntem, yoğunluk gradyanlı santrifüjlemeye dayanıyordu ve parçacık boyutu tespiti, LPS/BCA ölçümü, transmisyon elektron mikroskobu ve proteomik analiz gibi çeşitli dinamik tanımlama tekniklerini birleştirdi. Protokol, HSD'nin bağırsak mikrobiyotası EV üzerindeki etkilerini ve kardiyovasküler hastalıklardaki mekanizmalarını ortaya koymayı amaçlamaktadır. Yüksek verimliliği, tekrarlanabilirliği ve geniş uygulanabilirliği ile bu yaklaşım, tuz kaynaklı hipertansiyonda bağırsak mikrobiyotası EV'lerinin mekanizmasını keşfetmek için önemli bir araç sağlamakla kalmaz, aynı zamanda EV'lere dayalı hastalık müdahale stratejileri geliştirmek için teorik temeli de oluşturur. Bu çalışma sayesinde, hipertansiyon gibi kardiyovasküler hastalıkların önlenmesi ve tedavisi için yeni yollar açmayı umuyoruz^27,28.

Bu hayvan deney çalışması, ilgili etik yönergelere ve uluslararası standartlara uygundur. Hayvanları içeren çalışmalar, Chengdu Çin Tıbbı Üniversitesi Laboratuvar Hayvanları Refahı ve Etik Kurulu (kurum: Chengdu Çin Tıbbı Üniversitesi; protokol numarası: 2018-21) tarafından onaylanmıştır.

1. Hayvan hazırlama ve diyet rejimi

1. Vücut ağırlığı 180-200 g olan 6 haftalık erkek Dahl tuza duyarlı sıçanları% 50 ±% 10 nemde yetiştirerek iklimlendirin; 12 saat / 12 saat ışık döngüsü; Belirli patojen içermeyen koşullar altında 1 hafta boyunca 20.0 ± 2.0 °C.
2. Daha sonra, sıçanları eşit olarak iki gruba bölün (n = 6). Her gruba 6 hafta süren farklı bir diyet sağlayın:% 0.5 sodyum klorür içeren normal bir tuz diyeti (NSD) ve% 8 sodyum klorür içeren bir HSD, yayınlanmış çalışmalarda yaygın olarak kullanılır ^29,30,31. Fareler, çalışma boyunca yiyecek ve suya sınırsız erişime sahipti.

2. Kan basıncının izlenmesi

NOT: Kan basıncı ölçümü için non-invaziv bir yöntem olarak kuyruk manşet pletismografisi kullanıldı ve kan basıncı kuyruk kan hacminden ölçüldüğünde hacimsel basınç kaydı (VPR) kullanıldı.

1. Fareleri talaşlı küçük kafeslere ayrı ayrı yerleştirin, yaklaşık 37 ° C'de 10 dakika ısıtın ve hayvan girişi için ayarlanabilir bir burun ve kapıya sahip özel bir kemirgen kısıtlamasına yerleştirin. Vücut sıcaklıklarını 37 °C'de tutmak için fareleri yüzüstü pozisyonda bir ısıtma yastığına yerleştirin.
2. VPR sensörünü kuyruğun altına bağlayın ve BP^28'i stabilize etmek için en az 10 adaptasyon döngüsü ayarlayın.
   1. Şişirilebilir manşeti kuyruk köküne doldurun ve pletizografik sensörü (veya fotoelektrik sensörü) aşağıya yerleştirin. Yavaşça sistolik basıncın üzerine (genellikle 200 mmHg) şişirin ve ardından yavaşça bırakın. Cihaz, nabız dalgasının kaybolması (sistolik kan basıncı) ve iyileşmenin (diyastolik kan basıncı) basınç değerini otomatik olarak algılar. Arka arkaya 3-5 kez ölçün ve ortalama değeri alın.
3. Tüm fareleri kısıtlama prosedürüne uyacak şekilde eğitin ve sirkadiyen varyasyonun etkilerini en aza indirmek için bu çalışmayı sabah 9 civarında sessiz bir laboratuvarda gerçekleştirin.
4. Kurban öncesi sistolik kan basıncını (SBP) ve diyastolik kan basıncını (DBP) iki günde bir ölçün. SBP ve DBP'den ortalama arteriyel basıncı (MAP) tahmin edin
   HARITA = (SBP + 2 DBP)/3

3. EV'lerin çıkarılması

1. Numune toplama
   1. Steril bir pamuklu çubuğu% 75 alkole batırın ve farenin anüsünü uyarmak için kullanın. Stimülasyonun bağırsak peristaltizmini teşvik etmesi ve anal sfinkteri gevşetmesi, böylece dışkılamayı teşvik etmesi amaçlandı. Dışkı dışarı atıldıktan sonra, steril forseps kullanarak uygun büyüklükte steril kaplara toplayın ve hemen -80 °C'de saklayın.
2. Numune hazırlama
   1. Bir kaşık kullanarak, 5 g dışkıyı önceden tartılmış 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. Tüpe 50 mL önceden ısıtılmış 37 °C endotoksin içermeyen PBS (maksimum numune konsantrasyonu %10) ekleyin ve 30 dakika döndürün. Yüksek hızlı santrifüjü 4 °C'ye soğutun.
   2. Santrifüjün dengelenmesini sağlamak için numuneleri simetrik olarak yerleştirdikten sonra 15 dakika boyunca 8.000 x g'da santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı aspire edin ve yeni bir steril santrifüj tüpüne aktarın.
   3. 15 dakika boyunca 8.000 x g'da tekrar santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve daha fazla analiz için kullanın.
3. Ham ekstrakt hazırlama
   1. Steril bir 0,22 μm filtre ünitesi kullanın. Filtre ünitesini buzun üzerine yerleştirin ve vakum pompasını sıkıca tutun. Elde edilen süpernatanı filtrenin üst kısmına aktarın. Filtrelenmiş numuneleri toplamak için vakum pompasını açın.
   2. Süzüntüyü bir santrifüj filtreye (10 kDa, 15 mL) aktarın, 4 °C'de, 3.000 x g'de 30 dakika santrifüjleyin ve numuneyi en az 1400 μL'ye konsantre edin.
   3. Konsantre numuneyi toplayın ve gerekirse önceden soğutulmuş endotoksin içermeyen PBS kullanarak 1400 μL'ye seyreltin. Seyreltmeden hemen sonra numuneyi buz üzerinde tutun.
      NOT: Ham ekstrakt hemen kullanılabilir veya -80 °C'de birkaç ay saklanabilir.
4. EV'lerin ayrılması
   1. Degrade arabelleği A'yı ve degrade arabelleği B'yi aşağıda açıklandığı gibi hazırlayın. Bileşiğin tamamen çözünmesi birkaç saat sürdüğü için tamponu bir gün önceden hazırlayın. Hazırlanan tampon 4 °C'de 6 ay saklanabilir.
      1. Gradyan tamponu A'nın hazırlanması: 0.25 M sükroz, 6 mM EDTA ve 60 mM Tris'i 800 mL endotoksin içermeyen suda manyetik karıştırıcı karıştırma ile çözün, pH hidroklorik asit kullanılarak 7.4'e ayarlandı. Endotoksin içermeyen su ile 1 L'ye kadar seyreltin. Tamponu filtrelemek için 0,22 μm şişe üstü filtre kullanın.
      2. Gradyan tamponu B'nin hazırlanması: 0.25 M sükroz, 1 mM EDTA ve 10 mM Tris'i 800 mL endotoksin içermeyen su içinde manyetik karıştırıcı karıştırarak çözün, pH hidroklorik asit ile 7.4'e ayarlayın. Endotoksin içermeyen su ile 1 L'ye seyreltilir. Tamponu filtrelemek için 0,22 μm'lik bir şişe üstü filtre kullanın.
   2. Çalışma çözeltisini hazırlamak için 1 hacim gradyan tamponu A ve 5 hacim yoğunluk gradyan ortamını (ortam% 60 iyodiksanol çözeltisidir) karıştırın.
   3. İodiksanol çözeltisinin hazırlanması (% 10,% 20,% 40): % 10'luk bir iyodiksanol çözeltisi hazırlamak için 1 birim çalışma çözeltisi ve 4 birim tampon B'yi karıştırın; % 20 iyodiksanol çözeltisi için, 2 birim çalışma çözeltisi ve 3 birim tampon B'yi karıştırın; % 40 iyodiksanol çözeltisi için 4 birim çalışma çözeltisi ve 1 birim tampon B'yi karıştırın. Her çözeltiyi taze hazırlayın ve buz üzerinde saklayın.
      NOT: Her deney için yeni çalışma çözeltileri hazırlanmalıdır ve deney hatasını hesaba katmak için ek %10'luk bir çözelti hacmi hazırlanabilir.
   4. % 50'lik bir iyodiksanol çözeltisi elde etmek için adım 3.3.3'te hazırlanan çözeltiyi 7 mL yoğunluk gradyan ortamı ile karıştırın.
   5. Bir yoğunluk gradyanı hazırlamak için, farklı katmanlar arasında net bir taslak sağlamak için% 40 çözeltiye% ve% 10 (ağırlıkça / hacim) iyodiksanol çözeltisine tripan mavisi çözeltisi ekleyin.
   6. 8 mL% 50 iyodiksanol çözeltisini ince duvarlı polipropilen santrifüj tüpünün dibine aktarın. Tüpü 70 ° C'ye eğin ve 8 mL% 40 iyodiksanol çözeltisini sıvı yüzeyine aktarın. 8 mL %20 iyodiksanol solüsyonu, ardından 7 mL %10 iyodiksanol solüsyonu ve son olarak 2 mL endotoksin içermeyen PBS ekleyin.
      NOT: Yoğunluk gradyanı hazırlamak pratik gerektirir. Yoğunluk gradyanının kalitesi, deney sonuçları üzerinde büyük bir etkiye sahiptir. Tüpü, ekleme işlemindeki farklı adımlar arasında dik olarak yerleştirmeyin, çünkü bu, yoğunluk gradyanının kalitesini olumsuz etkiler.
   7. Santrifüjü önceden soğutun ve hazırlanan yoğunluk gradyanını ultrasantrifüje yerleştirin. Başlamak için parametreler girilecek, parametre değerleri: 100.000 x g, 20 h, 10 °C.
   8. Manuel gradyan yoğunluk ayrımı için, toplam 34 mL sıvı içeren sistem yüzeyinin merkezinden 2 mL çözeltiyi yavaşça çekin. Her 2 mL bir gradyandır, böylece yoğunluk gradyan çözeltisini 17 gradyana böler.
   9. Yoğunluk fraksiyonlarını bir pipet kullanarak steril bir numune tüpüne aktarın ve hemen buzun üzerine yerleştirin. Dik durduğundan emin olmak için santrifüj tüpünü başparmak ve işaret parmağı arasına sıkıştırın.
5. EV'lerin kurtarılması
   1. Ultrafiltrasyon çipi üzerinde çift kaplinli ultrasonik salınım sistemi aracılığıyla negatif basınç salınımı uygulayan tam otomatik bir EV ekstraksiyon sistemi kullanarak, numunedeki nükleik asit ve protein safsızlıklarını nanogözenek yoluyla giderin ve EV'leri durdurun, bu da EV'lerin zenginleşmesine ve saflaştırılmasına yol açar.
      1. Adım 3.4.7'deki filtratı çıkarın ve ultrafiltrasyon çipine ekleyin.
      2. Cihazı cihaz talimatlarına göre çalıştırın ve filtrelenmiş filtratı, yani eksozomla zenginleştirilmiş çözeltiyi toplayın. Ana işlem Şekil 1'de gösterilmiştir.

4. EV'lerin tanımlanması

1. Partikül boyutu ve konsantrasyonu tespiti
   1. Dirençli darbe algılama (RPS) tabanlı bir nanokulometre sayacı kullanarak boyut dağılımını ve zeta potansiyelini değerlendirin. Bu deney için 60-200 nm ölçüm aralığına sahip nanopor çipleri seçin. Ayrıca, bir nano kütüphane sayacı kullanarak EV'lerin parçacık boyutu dağılımını ve zeta potansiyelini değerlendirin.
      1. Uygun miktarda EV çözeltisi alın ve (1/10, 1/100, 1/1000, 1/10000) seyreltin.
      2. Test için cihaza EV çözeltilerinin farklı seyreltmeleri yerleştirildi.
      3. Daha iyi stabiliteye sahip seyreltme çarpanı seçildi ve daha doğru veriler elde etmek için tekrar test edildi.
2. LPS ve BCA testi
   1. BCA testi: RIPA tamponu kullanarak EV'leri parçalayın ve ardından proteinleri ayırın. BCA protein konsantrasyonu belirleme kitini kullanarak EV'lerin protein içeriğini belirleyin.
   2. LPS testi: Endotoksin tespit kitini kullanarak, kit adımlarına göre numuneler, bir endotoksin dedektörü ve kromojenik ekleyin. 545 nm'de absorbansı ölçün ve standart eğriye göre dış veziküllerin LPS ifadesini hesaplayın.
3. TEM değerlendirmesi: Negatif boyama ve TEM analizi için, numuneleri sürekli karbon film ile kaplanmış ışıldayan bir bakır ızgaraya uygulayın ve %0,75 uranil format ile boyayın. Cryo-EM için, EV'leri hidrofilik bir yüzeye sahip 300 gözenekli bir EM karbon ızgarasına emdirin ve sıvı nitrojen içinde dondurun. Cryo-TEM kullanarak ızgaraları gözlemleyin ve analiz edin ve görüntüleri 22.000 büyütmede kaydedin³².
4. Proteinlerin karakterizasyonu: EV'leri RIPA tamponu kullanarak parçalayın ve ardından proteinleri ayırın. BCA protein test kitini kullanarak protein konsantrasyonunu belirleyin, SDS-PAGE ile her numuneden eşit miktarda proteini ayırın ve protein profillerini^33,34 görselleştirmek için elektroforezden sonra Coomassie mavi boya çözeltisi ile boyayın.
5. S dizilimi ve analizi: Bir dışkı DNA ekstraksiyon kiti kullanarak dışkı örneklerinden genomik DNA'yı çıkarın. Agaroz jel elektroforezi ve bir spektrofotometre ile DNA'nın bütünlüğünü ve konsantrasyonunu değerlendirin. 16S rRNA geninin V3 - V4 bölgesini evrensel primerlerle amplifiye edin, PCR ürünlerini saflaştırın, niceliklerini belirleyin ve Illumina platformunda dizileyin. QIIME2 boru hattını³⁵ kullanarak veri analizi gerçekleştirin.
   1. DADA2 kullanarak amplikon dizi varyantlarını (ASV'ler) sınıflandırın ve VSEARCH algoritmasını kullanarak Silva veritabanıyla eşleştirin. Örnekler içindeki tür zenginliğini ve çeşitliliğini değerlendirmek için, esas olarak Shannon indeksi ve Chao1 indeksi gibi indeksleri kullanarak α-Çeşitlilik analizini kullanın. β-Çeşitlilik analizi, numuneler arasındaki mikrobiyal topluluk bileşimini karşılaştırır ve genellikle temel koordinat analizi (PCoA) ile görselleştirilir. Önemli ölçüde farklı koşullara sahip veya gruplar arasında mikrobiyal taksonları tanımlamak için doğrusal diskriminant analizi etki boyutu (LEfSe) ve volkan grafiği analizi gibi diferansiyel analiz yöntemlerini kullanın.

EV konsantrasyonları farklı fraksiyonlarda belirlendi (Şekil 2A). Deneysel sonuçlar, EV'lerin konsantrasyonunun bir dizi yoğunluk gradyan çözümünde tipik bir normal dağılım modeli sergilediğini gösterdi (Şekil 2B). Spesifik olarak, 9. fraksiyonda, EV'lerin konsantrasyonu en yüksek noktasına (3.85 x 10⁹) ulaştı, bu da EV'lerin ana dağılım fraksiyonunun 9³⁶ olabileceğini düşündürdü.

Protein içeriğinin belirlenmesi için, farklı fraksiyonlardaki protein içeriğini değerlendirmek için BCA kitleri kullanılmıştır (Şekil 2C). Bu yöntemde, fraksiyon 9'daki protein içeriği 0.417 μg/μL idi, bu da EV'lerin dağılımını daha da göstermektedir. LPS, Gram-negatif bakterilerin^37,38 benzersiz bir bileşeni olduğundan, EV'lerin farklı fraksiyonlardaki dağılımını değerlendirmek için LPS'nin ekspresyonunu belirlemek için endotoksin tespit kitleri de kullanılmıştır (Şekil 2D). Deneysel sonuçlar, 9. ve 10. fraksiyonlarda, LPS ekspresyonunun diğer fraksiyonlardan önemli ölçüde daha yüksek olduğunu gösterdi (fraksiyon 9 için absorbans = 0.8086, fraksiyon 10 için = 0.8515) ve dağılımı normal bir dağılım gösterdi, bu da EV'lerin esas olarak fraksiyon 9'da dağıldığını kanıtladı. Farklı fraksiyonlardan izole edilen EV'lerin SDS-PAGE jel elektroforezinde fraksiyon 9'da nispeten daha fazla miktarda protein de gözlenmiştir (Şekil 2E).

Bu çalışma, transmisyon elektron mikroskobu (TEM; Şekil 2F). TEM tarafından yapılan yüksek çözünürlüklü görüntüleme sayesinde, EV'lerin biyolojisini anlamak için çok önemli olan dairesel zar benzeri yapılara sahip EV'lerin morfolojik yapısını net bir şekilde görselleştirebildi.

Sıçanların NSD ve HSD'sinde 2 aylık yetiştirmeden sonra NSD ve HSD gruplarında kan basıncı değişiklikleri belirlendi. HSD grubunda SBP (Şekil 3A), DBP (Şekil 3B) ve MBP'nin (Şekil 3C) önemli ölçüde arttığını görebiliriz, bu da bu çalışmanın hipertansiyon modelinin başarılı bir şekilde oluşturulduğunu göstermektedir.

Bu çalışmada, EV'lerin konsantrasyonu farklı gruplarda tespit edildi (Şekil 3D) ve sonuçlar, HSD grubundaki EV'lerin konsantrasyonunun NSD grubundaki sıçanlarınkinden önemli ölçüde daha yüksek olduğunu gösterdi. Bu, HSD'nin, potansiyel olarak EV'lerin kaynaklandığı bağırsak mikrobiyotasının bileşimindeki değişiklikler nedeniyle EV'lerin seviyesini etkilediğini göstermektedir.

EV'lerin parçacık boyutu daha sonra bu çalışmada ölçüldü. Ölçüm sonuçları, EV'lerin partikül boyutunun ağırlıklı olarak 60 nm civarında olduğunu (Şekil 3E) ve HSD grubunun partikül boyutunun NSD grubununkinden biraz daha düşük olduğunu göstermektedir. Ölçülen veriler, EV'lerin boyut dağılımını ve homojenliğini değerlendirmek için önemli bilgiler sağlayarak sonraki deneysel tasarım ve uygulama geliştirmeyi kolaylaştırır.

Daha sonra bu çalışmada HSD grubu ve NSD grubundaki EV'lerin LPS ekspresyon miktarı incelenmiştir (Şekil 3F). Sonuçlar, HSD grubundaki EV'ler tarafından LPS ekspresyonunun da NSD grubundakinden önemli ölçüde daha yüksek olduğunu gösterdi. Bunun nedeni, ekzovezikül kaynaklı bağırsak mikrobiyotasındaki Gram negatif bakterilerdeki artışa veya HSD grubundaki EV'lerin NSD grubuna göre daha yüksek konsantrasyonuna bağlı olabilir.

HSD ve NSD gruplarındaki EV'ler arasındaki farkları daha fazla desteklemek için, bu çalışma türetilmiş bağırsak mikrobiyotasını araştırdı ve HSD'nin farelerde bağırsak mikrobiyotasındaki EV'ler üzerindeki etkisini daha da netleştirmek için NSD ve HSD gruplarından EV örneklerinin 16S rRNA dizilimini gerçekleştirdi.

α-Çeşitlilik analizi, bağırsak mikrobiyotasının çeşitliliğinin HSD grubunda önemli ölçüde azaldığını, hem Shannon hem de ACE indekslerinin azaldığını gösterdi (Şekil 4A). β-PCoA'ya (Şekil 4B) dayalı çeşitlilik analizi, ASV düzeyinde gruplar arasındaki mikrobiyal fenotipleri ayırt etti. Yüksek tuz müdahalesi, bağırsak mikroflorasındaki fenotipik değişiklikleri kısmen tersine çevirdi ve gruplar arasında dış vezikül türevi bağırsak mikrobiyotasının bileşiminde önemli farklılıklar buldu (p = 0.001).

Düşük bolluktaki bakterileri filtreledikten ve verileri standartlaştırdıktan sonra, taksonomik açıklama, örneklerdeki farklı mikrobiyal topluluk aralıklarını tanımladı. Ekzovezikül kaynaklı bağırsak mikrobiyotası esas olarak Proteobacteria (%93.19), Firmicutes (%4.57) ve Bacteroidota'dan (%1.19; Şekil 4C). HSD grubu, Firmicutes eksternal veziküllerinin bolluğunu önemli ölçüde arttırmıştır (Şekil 4D). Cins düzeyinde, sonuçlar Nevskia ve Acinetobacter gibi cinslerin NSD grubunda daha bol olduğunu, Delftia, Burkholderia_Ca ve Clostridium_sen'in ise HSD grubunda daha bol olduğunu göstermiştir (Şekil 4E). Ek olarak, bu çalışmada HSD grubu ile NSD grubu arasındaki bağırsak mikrobiyota EV'lerindeki farklılıkları göstermek için ısı haritaları da kullanılmıştır (Şekil 4F). Yüksek tuzlu müdahaleden sonra, bazı bakterilerin, Delftia ve Burkholderia_Ca'in bolluğu önemli ölçüde artmış ve Nevskia ve Acinetobacter önemli ölçüde azalmıştır (Şekil 4G). Sonuç olarak, yüksek tuz müdahalesi, bağırsak mikroflorasından türetilen EV'lerin üretimindeki farkı önemli ölçüde değiştirdi, çünkü esas olarak ebeveyn bakterilerinin dağılımını değiştirdi ve temel özellikler çeşitlilikteki azalmalar, denge yapısındaki değişiklikler ve farklı bakterilerin bolluğundaki değişikliklerdi.

Şekil 1: Bağırsak mikrobiyal kaynaklı dış veziküllerin ekstraksiyonu ve karakterizasyonu. (A) Dış vezikül ekstraksiyonunun akış şeması. (B) Dış veziküllerin karakterizasyonu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: EV'lerin temel karakterizasyonu ve yerel yoğunluk gradyanının analizi. (A) Farklı yoğunluk gradyanları (nm; partikül / mL) ile ekstra vezikül konsantrasyonu ve partikül boyutu ölçümleri. (B) Çözelti dış vezikül konsantrasyonlarının yoğunluk gradyanı 3 - 16 (partikül / mL) ile karşılaştırılması. (C) BCA kiti (μg / mL) ile yoğunluk gradyanı 6-12'de çözelti protein içeriği tayini. (D) Bir endotoksin tespit kiti (Abs) ile yoğunluk gradyanı 7-11 ile çözelti LPS ekspresyon ölçümü. (E) Yoğunluk gradyanı 6 - 12 olan çözeltiler SDS-PAGE jel elektroforezine tabi tutuldu ve Coomassie parlak mavisi ile boyandı. (F) TEM: Ölçek çubuğu 100 nm'dir; Resimde tek tek veziküller gösterilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Farklı diyetler altında kan basıncındaki ve EV'lerdeki değişikliklerin analizi. (A) SBP; (b) DBP; (c) MBP; (D) HSD ve NSD gruplarındaki eksternal vezikül konsantrasyonlarının karşılaştırılması; (E) HSD ve NSD gruplarında dış vezikül boyutunun karşılaştırılması. (F) Spektrofotometri ile belirlenen NSD ve HSD numunelerindeki LPS. *p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001 ve NS anlamlılık olmadığı anlamına gelir, t-testi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Farklı diyetler altında 16s rRNA testinin analizi. (A) α çeşitliliği analizi; (B) Temel koordinat analizi; (C) filum düzeyinde bağırsak mikrobiyotasının bolluğu; (D) Filum düzeyindeki bakterilerdeki değişiklikler; (E) LEfSe sonucu; (F) diferansiyel bakteri cinslerine dayalı küme ısı haritası analizi; (G) Cins düzeyindeki bakterilerdeki değişiklikler. *p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001 ve NS anlamlılık olmadığı anlamına gelir, t-testi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bu çalışmada, HSD'deki tuza duyarlı sıçanlarda bağırsak mikrobiyotası EV'lerine odaklandık ve bir dizi önemli başarı elde ettik. İlk olarak, EV'leri HSD üzerindeki tuza duyarlı sıçan bağırsak mikrobiyotasından izole etmek için yoğunluk gradyan santrifüjlemeye dayalı verimli bir ekstraksiyon yöntemi başarıyla oluşturuldu ve EV olmayan bileşenlerin çoğu titiz, standartlaştırılmış bir hayvan deneysel manipülasyonu ve numune işleme süreci yoluyla izole edildi. EV'lerin yoğunluk gradyanlı santrifüjleme ekstraksiyon yöntemi, yüksek verimli ve tekrarlanabilirdir, geleneksel ultrasantrifüjleme yönteminden daha iyidir ve EV'lerin bütünlüğünü ve işlevselliğini daha iyi koruyabilir, numune kalitesini ve çalışma fizibilitesini sağlar.

İkinci olarak, EV'ler çeşitli dinamik teknolojiler aracılığıyla kapsamlı bir şekilde tanımlandı: parçacık boyutu ve konsantrasyon tespiti, EV'lerin belirli bir boyut dağılımına sahip olduğunu gösterir; LPS ve BCA ölçümleri, EV'lerin protein içeriğini ve LPS ekspresyonunu ölçer; TEM, EV'lerin morfolojik yapısını açıkça göstermektedir; ve protein özellikleri, protein spektrumunu tanımlar. Bu tanımlama sonuçları, EV'lerin fiziksel ve biyokimyasal özelliklerini kapsamlı bir şekilde ortaya koymakta ve sonraki çalışmalar için güvenilir veri desteği sağlamaktadır.

Ek olarak, normal ve HSD EV'lerin kökeni ve bileşimi arasındaki farkların derinlemesine analizini kullanan 16S rRNA gen dizileme teknolojisi ve α çeşitlilik analizi ve β çeşitlilik analizi, yüksek tuz alımının, yüksek tuzlu diyetin bağırsak mikrobiyotası EV'leri üzerindeki etkilerini daha kapsamlı bir şekilde çözmek için mikrobiyal topluluk yapısı, tür zenginliği ve çeşitliliği dahil olmak üzere bağırsak mikrobiyal EV'lerinin genetik özelliklerini önemli ölçüde etkilediğini gösterdi. Mekanik çalışmalar için çok sayıda kanıt sağlar.

Bu yöntem, eksozom geri kazanımı ve bütünlüğü açısından geleneksel aşırı hızlı santrifüjleme yöntemine göre bazı avantajlara sahip olsa da, yüksek numune talebi ve konakçıyı mikroflora kaynağından ayırt etmede zorluk gibi bazı sınırlamalar vardır. Bununla birlikte, mevcut yöntemlerle karşılaştırıldığında, yoğunluk gradyanlı santrifüjleme, eksozomların fonksiyonel bütünlüğünün korunmasında benzersiz avantajlara sahiptir, bu da yüksek tuzlu bir diyetin bağırsak florası yoluyla konakçı kan basıncını etkilediği mekanizmanın daha fazla araştırılması için güvenilir teknik destek sağlar. Ayrıca, deney sırasında karşılaşılan belirsiz gradyan tabakalaşması için, santrifüjleme süresini uzatarak veya daha yüksek performanslı rotoru değiştirerek de iyileştirdik.

Gelecekte, yüksek tuzlu bir diyetin neden olduğu hipertansiyonda bağırsak mikrobiyotası EV'lerinin mekanizmasını, özellikle pro-inflamatuar T hücreleri gibi bağışıklık sistemi ile etkileşimini daha fazla keşfedebiliriz^39,40; veya bağırsak mikrobiyotasına^müdahale etmek için bitki kaynaklı ürünler kullanın EV'ler ^41,42, hastalıklara daha fazla müdahale etmek ve konakçı metabolizmasını ve bağışıklık tepkisini düzenlemedeki rollerini keşfetmek.

Sonuç olarak, bu çalışma, tuza duyarlı sıçan modeli aracılığıyla bağırsak mikrobiyotasının tuza bağlı hipertansiyon mekanizmasını araştırmak için önemli bir araç sağlamakla kalmayıp, HSD, bağırsak mikrobiyotası ve EV'ler arasındaki ilişkinin anlaşılmasını derinleştirmekle kalmayıp, aynı zamanda hipertansiyon gibi kardiyovasküler hastalıkların önlenmesi ve tedavisi için yeni bir yol açmış, diyet-mikrop-konak etkileşiminin incelenmesi için benzersiz bir bakış açısı sunmaktadır.

Yazarlar, bu yazıda rapor edilen çalışmayı etkilemiş gibi görünebilecek bilinen hiçbir rakip mali çıkarları veya kişisel ilişkileri olmadığını beyan ederler.

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82205240), Sichuan Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (2025ZNSFSC1836) ve Sichuan İl Ortopedi Hastanesi (PY202414) Klinik Temel Projesi tarafından desteklenmiştir.