고염 식단 조건에서 소금에 민감한 쥐의 장내 미생물 세포 외 소포의 분리 및 차등 특성화

이 프로토콜은 밀도 구배 원심분리를 사용하여 HSD를 먹인 염분에 민감한 쥐로부터 장내 미생물 EV를 분리하는 방법을 설명합니다. EV는 나노입자 추적, TEM, LPS/BCA 분석 및 16S rRNA 염기서열분석을 통해 크기, 형태, 구성 및 미생물군 기원을 분석했습니다.

높은 염분 섭취는 고혈압의 주요 위험 요소이며, 그 기저에 있는 메커니즘은 장내 미생물총(microbiota)이 분비하는 세포외 소포체(EV)와 밀접하게 관련되어 있을 수 있습니다. 장내 미생물총(microbiota)에 의해 생산되는 이러한 EV는 고염 식단(HSD)으로 인한 고혈압 발병에 중요한 역할을 할 수 있는 다양한 생체 활성 성분을 가지고 있습니다. 이 메커니즘을 조사하기 위해 우리는 HSD를 먹인 염분에 민감한 쥐의 장내 미생물군에서 EV를 분리하기 위해 밀도 구배 원심분리를 기반으로 하는 효율적인 추출 방법을 개발했습니다. 입자 크기 분석, 투과전자현미경(TEM) 및 지질다당류(LPS) 검출을 통해 장내 미생물군 EV의 기울기 분포를 확인하고 정밀한 추출을 달성했습니다. 또한, 16S rRNA 유전자 염기서열분석을 통해 정상 그룹과 HSD 그룹 간 EV의 기원 및 구성 차이를 분석하여 높은 염분 섭취가 장내 미생물군 EV의 유전적 특성에 미치는 영향을 밝혔습니다. 이 연구는 염분 유발 고혈압의 기저에 있는 장내 미생물군 메커니즘에 대한 귀중한 도구와 과학적 통찰력을 제공하고 관련 질병의 예방 및 치료에 대한 새로운 관점을 제공합니다.

장내 미생물총(microbiota microflora) 또는 장내 미생물 생태학(gut microecology)으로도 알려진 장내 미생물군(microbiota)은 생물학적 위장관에 위치한 수만 개의 미생물로 이루어진 복합체로, 인간의 건강 유지에 중요한 역할을 합니다¹. 최근 몇 년 동안 추가 연구를 통해 장내 미생물총(microbiota)이 세포외 소포체(EV)를 생성할 수 있다는 사실이 밝혀졌습니다². EV는 세포에서 방출되는 작은 소포로, 세포에서 단백질, 핵산 및 지질과 같은 다양한 분자를 운반합니다 ^3,4. 그들은 다른 미생물⁵, 장 상피 세포, 심지어 먼 조직 및 장기⁶와 상호 작용할 수 있으므로 인체 건강 ^7,8에 영향을 미칠 수 있습니다. 이러한 장내 미생물총(microbiota)에 의해 생성되는 전기차와 식단 사이에는 밀접한 연관성이 있습니다⁹.

장내 미생물총(microbiota)에 의해 생성되는 EV는 고염 식단(HSD)이 신체 건강에 영향을 미치는 중요한 병원체일 수 있습니다. HSD는 장내 미생물총(microbiota¹⁰)의 균형을 직접적으로 교란시켜 유익한 박테리아(예: 락토바실러스)11의 수를 현저히 감소시킬 뿐만 아니라¹¹ 해로운 박테리아(예: 박테로이드(Bacteroides) 등)의 증식을 촉진합니다.¹². 이러한 불균형은 장 장벽 기능을 감소시키고 장 염증의 위험을 증가시킵니다. 또한, HSD는 여러 생리적 기능을 가진 단쇄 지방산^14,15의 생성을 감소시키는 것과 같이 장내 미생물총(microbiota)의 대사 활동⁽¹³)을 변화시킴으로써 장에서의 산-염기 균형과 영양소 흡수에 더 많은 영향을 미친다.

이러한 변화는 장 건강에 영향을 미칠 뿐만 아니라 EV의 생산 및 방출을 간접적으로 조절하고 EV의 구성과 기능을 변화시킬 수 있습니다. 고염분 환경은 EV의 방출 및 수송을 포함한 장 세포의 정상적인 생리적 기능에 영향을 미칠 수 있으며, 이로 인해 세포 간 정보 전달 및 면역 조절에서 EV의 역할을 방해할 수 있습니다. 동시에, 장 염증은 특수 기능¹⁶을 가진 다양한 EV를 촉진하고 장 장기 축 및 기타 방법을 통해 전신으로 퍼질 수 있습니다^{17, 18}, 이는 고혈압^{19, 20}, 심혈관²¹ 및 뇌 혈관 질환^{22, 23}, 비만^{24, 25}, 당뇨병²⁶의 발생 및 발병과 밀접한 관련이 있습니다 및 기타 만성 질환.

따라서 본 연구의 전반적인 목표는 HSD를 먹인 염분에 민감한 쥐의 장내 미생물군에서 EV를 추출하고 그 물리적 특성, 구성 및 기능을 체계적으로 연구하는 효율적이고 신뢰할 수 있는 방법을 개발하는 것이었습니다. 고염 식단 후 혈압이 현저히 상승하는 특성으로 인해 염분에 민감한 쥐를 선정하여 효율적인 추출 방법을 구축하여 HSD가 장내 미생물총에 미치는 영향을 밝혔습니다. 이 방법은 밀도 구배 원심분리를 기반으로 하며 입자 크기 감지, LPS/BCA 측정, 투과 전자 현미경 및 단백질체 분석과 같은 다양한 동적 식별 기술을 결합했습니다. 이 프로토콜은 HSD가 장내 미생물총(microbiota EV)에 미치는 영향과 심혈관 질환에 대한 HSD의 메커니즘을 밝히는 것을 목표로 합니다. 높은 효율성, 재현성 및 광범위한 적용 가능성을 갖춘 이 접근 방식은 염분 유발 고혈압에서 장내 미생물군 EV의 메커니즘을 탐구하는 데 중요한 도구를 제공할 뿐만 아니라 EV를 기반으로 질병 중재 전략을 개발하기 위한 이론적 토대를 마련합니다. 이 연구를 통해 고혈압과 같은 심혈관 질환의 예방과 치료를 위한 새로운 길을 열 수 있기를 희망한다^27,28.

이 동물 실험 연구는 관련 윤리 지침 및 국제 표준을 준수합니다. 동물을 대상으로 한 연구는 청두중의과대학 실험동물복지윤리위원회(기관: Chengdu University of Chinese Medicine, 프로토콜 번호: 2018-21)의 승인을 받았다.

1. 동물 준비 및 식단 체계

1. 6 주 된 수컷 Dahl 소금에 민감한 쥐, 체중 180-200g을 50 % ± 10 % 습도에서 사육하여 적응하십시오. 12시간 / 12시간 광 주기; 20.0 ± 2.0 °C에서 1주일 동안 특정 병원체가 없는 조건에서 사용합니다.
2. 그런 다음 쥐를 두 그룹(n = 6)으로 균등하게 나눕니다. 각 그룹에게 6주 동안 지속되는 다른 식단을 제공하십시오: 0.5% 염화나트륨이 함유된 일반 소금 식단(NSD)과 8% 염화나트륨이 함유된 HSD는 발표된 연구에서 일반적으로 사용됩니다 29,30,31. 쥐는 연구 기간 동안 음식과 물에 무제한으로 접근할 수 있었습니다.

2. 혈압 모니터링

참고: 꼬리 커프 혈량측정은 혈압 측정을 위한 비침습적 방법으로 사용되었으며, 꼬리 혈액량에서 혈압을 측정할 때 체적 압력 기록(VPR)이 사용되었습니다.

1. 약 37°C에서 10분 동안 가열된 톱밥이 있는 작은 케이지에 쥐를 개별적으로 넣고 동물 진입을 위해 조절 가능한 코와 문이 있는 맞춤형 설치류 보호 장치에 넣습니다. 쥐를 엎드린 자세로 가열 패드에 올려 체온을 37°C로 유지합니다.
2. VPR 센서를 꼬리 하단에 연결하고 BP 10을 안정화하기 위해^{최소 28}개의 적응 주기를 설정합니다.
   1. 꼬리 뿌리에 팽창식 커프를 채우고 아래에 혈량 측정 센서(또는 광전 센서)를 놓습니다. 수축기 혈압(보통 200mmHg) 이상으로 천천히 팽창한 다음 천천히 풀어줍니다. 기기는 맥파 소실(수축기 혈압) 및 회복(이완기 혈압)의 압력 값을 자동으로 감지합니다. 3-5회 연속으로 측정하고 평균값을 취합니다.
3. 모든 쥐가 구속 절차를 수용하도록 훈련시키고 생체 변화의 영향을 최소화하기 위해 오전 9시경에 조용한 실험실에서 이 연구를 수행합니다.
4. 희생 전에 격일로 수축기 혈압(SBP)과 이완기 혈압(DBP)을 측정합니다. SBP 및 DBP에서 평균 동맥압(MAP) 추정
   지도 = (SBP + 2DBP)/3

3. EV 추출

1. 시료 채취
   1. 멸균 면봉을 75% 알코올에 담그고 쥐의 항문을 자극하는 데 사용합니다. 이 자극은 장 연동 운동을 촉진하고 항문 괄약근을 이완시켜 배변을 촉진하기 위한 것이었습니다. 대변을 배출한 후에는 멸균 겸자를 사용하여 적절한 크기의 멸균 용기에 모아 즉시 -80°C에서 보관하십시오.
2. 시료 전처리
   1. 숟가락을 사용하여 대변 5g을 미리 계량된 50mL 원심분리 튜브에 넣습니다. 예열된 37°C 내독소가 없는 PBS(최대 샘플 농도 10%) 50mL를 튜브에 넣고 30분 동안 회전합니다. 고속 원심분리기를 4°C로 냉각합니다.
   2. 8,000 x g 에서 15분 동안 원심분리기를 원심분리기를 대칭으로 배치하여 원심분리기가 평형을 이룰 수 있도록 합니다. 원심분리 후 상층액을 흡인하고 새로운 멸균 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
   3. 8,000 x g 에서 15분 동안 다시 원심분리기를 사용합니다. 상층액을 흡인하고 추가 분석에 사용합니다.
3. 미처리 추출물 준비
   1. 멸균 0.22μm 필터 장치를 사용하십시오. 필터 장치를 얼음 위에 놓고 진공 펌프를 단단히 잡으십시오. 얻어진 상등액을 필터 상부로 옮깁니다. 진공 펌프를 켜서 여과된 샘플을 수집합니다.
   2. 여과액을 원심 필터(10kDa, 15mL)로 옮기고 4°C, 3,000 x g 에서 30분 동안 원심분리한 다음 샘플을 1400μL 이상으로 농축합니다.
   3. 농축된 샘플을 수집하고 필요한 경우 사전 냉각된 내독소가 없는 PBS를 사용하여 1400μL로 희석합니다. 희석 직후 샘플을 얼음 위에 보관하십시오.
      참고: 미처리 추출물은 즉시 사용하거나 -80°C에서 몇 달 동안 보관할 수 있습니다.
4. EV의 분리
   1. 아래와 같이 그래디언트 버퍼 A와 그래디언트 버퍼 B를 준비합니다. 화합물이 완전히 용해되는 데 몇 시간이 걸리므로 하루 전에 완충액을 준비하십시오. 준비된 완충액은 4°C에서 6개월 동안 보관할 수 있습니다.
      1. 그래디언트 완충액 A의 준비: 0.25M 자당, 6mM EDTA 및 60mM Tris를 자성 믹서 교반으로 800mL의 내독소가 없는 물에 용해시키고 염산을 사용하여 pH를 7.4로 조정합니다. 내독소가 없는 물로 1L로 희석합니다. 0.22μm 병탑 필터를 사용하여 버퍼를 필터링합니다.
      2. 그래디언트 완충액 B의 준비: 0.25M 자당, 1mM EDTA 및 10mM Tris를 자성 믹서 교반으로 800mL의 내독소가 없는 물에 용해시키고 염산으로 pH를 7.4로 조정합니다. 내독소가 없는 물로 1L로 희석했습니다. 0.22μm 보틀탑 필터를 사용하여 버퍼를 필터링합니다.
   2. 1부피의 그래디언트 버퍼 A와 5부피의 밀도 그래디언트 배지(배지는 60% 요오딕산올 용액)를 혼합하여 작업 용액을 준비합니다.
   3. 요오딕산올 용액 (10 %, 20 %, 40 %)의 제조 : 10 % 요오딕산올 용액을 준비하려면 1 단위 작업 용액과 4 단위 버퍼 B를 혼합합니다. 20% 요오딕산올 용액의 경우 2개의 단위 작업 용액과 3개의 단위 버퍼 B를 혼합합니다. 40% 요오딕산올 용액의 경우 4개 단위 작업 용액과 1개 단위 버퍼 B를 혼합합니다. 각 용액을 신선하게 준비하고 얼음에 보관하십시오.
      참고: 각 실험에 대해 새로운 작업 용액을 준비해야 하며, 실험 오류를 설명하기 위해 추가로 10% 부피의 용액을 준비할 수 있습니다.
   4. 3.3.3단계에서 준비한 용액을 7mL의 밀도 구배 배지와 혼합하여 50% 요오딕산올 용액을 만듭니다.
   5. 밀도 구배를 준비하려면 40% 용액과 10%(wt/vol) 요오딕산올 용액에 트리판 블루 용액을 추가하여 뚜렷한 층 사이에 명확한 윤곽을 제공합니다.
   6. 50% 요오딕산올 용액 8mL를 얇은 두께의 폴리프로필렌 원심분리기 튜브 바닥으로 옮깁니다. 튜브를 70°로 기울이고 40% 요오딕산올 용액 8mL를 액체 표면으로 옮깁니다. 20% 요오딕산올 용액 8mL, 10% 요오딕산올 용액 7mL, 마지막으로 내독소가 없는 PBS 2mL를 추가합니다.
      참고: 밀도 구배를 준비하려면 연습이 필요합니다. 밀도 구배의 품질은 실험 결과에 큰 영향을 미칩니다. 덧셈 과정의 다른 단계 사이에 튜브를 똑바로 세우지 마십시오., 이는 밀도 구배의 품질에 부정적인 영향을 미치기 때문입니다.
   7. 원심분리기를 미리 예열하고 준비된 밀도 구배를 초원심분리기에 넣습니다. 시작할 매개변수 입력, 매개변수 값: 100,000 x g, 20 h, 10 °C.
   8. 수동 그래디언트 밀도 분리의 경우 총 34mL의 액체가 포함된 시스템 표면 중앙에서 2mL의 용액을 천천히 추출합니다. 각 2mL는 그래디언트이므로 밀도 그래디언트 용액을 17개의 그래디언트로 나눕니다.
   9. 피펫을 사용하여 밀도 분획을 멸균 샘플 튜브로 옮기고 즉시 얼음 위에 놓습니다. Clamp 엄지와 검지 사이에 원심분리기 튜브를 끼워 똑바로 세워져 있는지 확인합니다.
5. EV의 회복
   1. 한외여과 칩의 이중 커플링 초음파 진동 시스템을 통해 음압 진동을 가하는 완전 자동화된 EV 추출 시스템을 사용하여 나노포어를 통해 샘플의 핵산 및 단백질 불순물을 제거하고 EV를 차단하여 EV의 농축 및 정제로 이어집니다.
      1. 3.4.7단계에서 여과액을 제거하고 한외여과 칩에 추가합니다.
      2. 기기 지침에 따라 기기를 작동하고 여과된 여과액, 즉 엑소좀 농축 용액을 수집합니다. 주요 프로세스는 그림 1에 나와 있습니다.

4. EV 식별

1. 입자 크기 및 농도 감지
   1. 저항 펄스 감지(RPS) 기반 나노열량계 카운터를 사용하여 크기 분포와 제타 전위를 평가합니다. 이 실험을 위해 측정 범위가 60-200nm인 나노포어 칩을 선택하십시오. 또한 나노 라이브러리 카운터를 사용하여 EV의 입자 크기 분포와 제타 전위를 평가합니다.
      1. EV 용액을 적당량(1/10, 1/100, 1/1000, 1/10000)으로 희석합니다.
      2. 테스트를 위해 다양한 희석액의 EV 용액을 기기에 배치했습니다.
      3. 보다 정확한 데이터를 얻기 위해 안정성이 더 나은 희석 배수를 선택하고 다시 테스트했습니다.
2. LPS 및 BCA 분석
   1. BCA 분석: RIPA 완충액을 사용하여 EV를 용해한 다음 단백질을 분리합니다. BCA 단백질 농도 측정 키트를 사용하여 EV의 단백질 함량을 측정합니다.
   2. LPS 분석: 내독소 검출 키트를 사용하여 키트 단계에 따라 샘플, 내독소 검출기 및 발색을 추가합니다. 545 nm에서 흡광도를 측정하고 표준 곡선에 따라 외부 소포의 LPS 발현을 계산합니다.
3. TEM 평가: 음성 염색 및 TEM 분석을 위해 연속 탄소 필름으로 코팅된 발광 구리 그릴에 샘플을 적용하고 0.75% 포름산 우라닐로 염색합니다. Cryo-EM의 경우, EV를 친수성 표면의 300메시 EM 탄소 그리드에 흡수하고 액체 질소에서 동결합니다. Cryo-TEM을 사용하여 그리드를 관찰 및 분석하고 22,000 배율³²로 이미지를 기록합니다.
4. 단백질의 특성화: RIPA 완충액을 사용하여 EV를 용해한 다음 단백질을 분리합니다. BCA 단백질 분석 키트를 사용하여 단백질 농도를 측정하고, SDS-PAGE로 각 샘플에서 동일한 양의 단백질을 분리하고, 전기 영동 후 Coomassie 파란색 염료 용액으로 염색하여 단백질 프로파일을 시각화합니다^33,34.
5. S 염기서열분석 및 분석: 분변 DNA 추출 키트를 사용하여 대변 샘플에서 게놈 DNA를 추출합니다. 아가로스 젤 전기영동과 분광 광도계로 DNA의 무결성과 농도를 평가합니다. 범용 프라이머로 16S rRNA 유전자의 V3 - V4 영역을 증폭하고, PCR 산물을 정제하고, 정량화하고, Illumina 플랫폼에서 염기서열분석을 수행합니다. QIIME2 파이프라인³⁵을 사용하여 데이터 분석을 수행합니다.
   1. DADA2를 사용하여 앰플리콘 염기서열 변이체(ASV)를 분류하고 VSEARCH 알고리즘을 사용하여 Silva 데이터베이스와 일치시킵니다. α-Diversity 분석을 사용하여 주로 Shannon 지수 및 Chao1 지수와 같은 지수를 사용하여 표본 내의 종 풍부도와 다양성을 평가합니다. β-다양성 분석은 샘플 간의 미생물 군집 구성을 비교하며 일반적으로 주좌표 분석(PCoA)으로 시각화합니다. 선형 판별 분석 효과 크기(LEfSe) 및 화산 플롯 분석과 같은 차등 분석 방법을 사용하여 조건이 크게 다르거나 그룹 간에 미생물 분류군을 식별할 수 있습니다.

EV의 농도는 서로 다른 분획으로 측정되었습니다(그림 2A). 실험 결과는 EV의 농도가 일련의 밀도 구배 솔루션에서 일반적인 정규 분포 패턴을 나타내는 것으로 나타났습니다(그림 2B). 구체적으로, 분수 9에서 EV의 농도가 최고점(3.85 x 10⁹)에 도달했으며, 이는 EV의 주분포 분율이 9³⁶일 수 있음을 시사합니다.

단백질 함량을 측정하기 위해 BCA 키트를 사용하여 다양한 분획의 단백질 함량을 평가했습니다(그림 2C). 이 방법에서 분획 9의 단백질 함량은 0.417μg/μL였으며, 이는 EV의 분포를 더욱 입증합니다. LPS는 그람 음성 박테리아 ^37,38의 고유한 구성 요소이기 때문에 내독소 검출 키트를 사용하여 LPS의 발현을 결정하고(그림 2D) 다른 분획의 EV 분포를 평가했습니다. 실험 결과 분수 9와 10에서 LPS 발현이 다른 분획보다 유의하게 높았고(분수 9에 대한 흡광도 = 0.8086, 분수 10에 대한 흡광도 = 0.8515), 분포가 정규 분포를 보였으며, 이는 EV가 주로 분수 9에 분포되어 있음을 증명했습니다. 분획 9에서 상대적으로 더 많은 양의 단백질이 다른 분획에서 분리된 EV의 SDS-PAGE 겔 전기영동에서도 관찰되었습니다(그림 2E).

이 연구는 투과전자현미경(TEM; 그림 2F). TEM의 고해상도 이미징을 통해 EV의 생물학을 이해하는 데 중요한 원형 멤브레인과 같은 구조를 특징으로 하는 EV의 형태학적 구조를 명확하게 시각화할 수 있었습니다.

혈압 변화는 쥐의 NSD 및 HSD에서 사육 2개월 후 NSD 및 HSD 그룹에서 결정되었습니다. HSD 그룹에서 SBP(그림 3A), DBP(그림 3B) 및 MBP(그림 3C)가 유의하게 증가한 것을 볼 수 있으며, 이는 본 연구의 고혈압 모델이 성공적으로 구축되었음을 나타냅니다.

본 연구에서는 서로 다른 그룹에서 EV의 농도를 감지했으며(그림 3D), 그 결과 HSD 그룹의 EV의 농도가 NSD 그룹의 쥐보다 유의하게 높은 것으로 나타났습니다. 이는 HSD가 EV의 수준에 영향을 미치며, 이는 잠재적으로 EV가 유래한 장내 미생물총(microbiota)의 구성 변화로 인한 것임을 시사합니다.

그런 다음 이 연구에서 EV의 입자 크기를 측정했습니다. 측정 결과에 따르면 EV의 입자 크기는 주로 약 60nm이며(그림 3E), HSD 그룹의 입자 크기는 NSD 그룹의 입자 크기보다 약간 낮습니다. 측정된 데이터는 EV의 크기 분포와 균질성을 평가하기 위한 중요한 정보를 제공하여 후속 실험 설계 및 애플리케이션 개발을 용이하게 합니다.

그런 다음 본 연구에서는 HSD 그룹과 NSD 그룹에서 EV의 LPS 발현량을 조사했습니다(그림 3F). 그 결과, HSD 그룹에서 EV에 의한 LPS 발현도 NSD 그룹보다 유의하게 높은 것으로 나타났습니다. 이는 엑소베시클 유래 장내 미생물총(exovesicle-derived gut microbiota)에서 그람 음성 박테리아(Gram-negative bacteria)가 증가하거나 NSD 그룹보다 HSD 그룹에서 EV의 농도가 더 높기 때문일 수 있습니다.

HSD군과 NSD 군의 EV의 차이를 더욱 뒷받침하기 위해 본 연구는 유래된 장내 미생물군을 조사하고 NSD 및 HSD 그룹의 EV 샘플에 대해 16S rRNA 염기서열분석을 수행하여 생쥐의 장내 미생물군에서 EV에 대한 HSD의 영향을 더욱 명확히 했습니다.

α-다양성 분석은 HSD 그룹에서 장내 미생물총의 다양성이 크게 감소했으며 Shannon 및 ACE 지수가 모두 감소하는 것으로 나타났습니다(그림 4A). β - PCoA(그림 4B)를 기반으로 한 다양성 분석은 ASV 수준에서 그룹 간의 미생물 표현형을 구별했습니다. 고염도 중재는 장내 미생물군의 표현형 변화를 부분적으로 역전시켰고 그룹 간 외부 소포 유래 장내 미생물총(microbiota)의 구성에서 상당한 차이를 발견했습니다(p = 0.001).

저농도 박테리아를 필터링하고 데이터를 표준화한 후 분류학 주석은 샘플에서 다양한 범위의 미생물 군집을 식별했습니다. 엑소베시클 유래 장내 미생물군은 주로 프로테오박테리아(Proteobacteria, 93.19%), 피르미쿠테스(Firmicutes, 4.57%), 박테로이도타(Bacteroidota, 1.19%)로 구성되었다. 그림 4C). HSD 그룹은 Firmicutes 외부 소포의 풍부도를 유의하게 증가시켰습니다(그림 4D). 속 수준에서는 Nevskia 및 Acinetobacter와 같은 속이 NSD 그룹에서 더 풍부했던 반면, Delftia, Burkholderia_Ca 및 Clostridium_sen 속은 HSD 그룹에서 더 풍부했습니다(그림 4E). 또한 이 연구에서는 히트맵을 사용하여 HSD 그룹과 NSD 그룹 간의 장내 미생물총 EV의 차이를 보여주었습니다(그림 4F). 고염분 중재 후 일부 박테리아인 Delftia 및 Burkholderia_Ca의 풍부함은 크게 증가했으며 Nevskia와 Acinetobacter는 크게 감소했습니다(그림 4G). 결론적으로, 높은 염분 개입은 주로 부모 박테리아의 분포를 변화시켰기 때문에 장내 미생물 유래 EV의 생산 차이를 크게 변화시켰으며, 주요 특징은 다양성의 감소, 평형 구조의 변화, 다른 박테리아의 풍부도의 변화였습니다.

그림 1: 장내 미생물 유래 외소포의 추출 및 특성화. (A) 외소포 추출의 흐름도. (B) 외부 소포의 특성화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: EV의 기본 특성화 및 국소 밀도 구배 분석. (A) 다양한 밀도 구배(nm, 입자/mL)를 사용한 소포외 농도 및 입자 크기 측정. (B) 밀도 구배 3 - 16(입자수/mL)에 의한 용액 외부 소포 농도 비교. (C) BCA 키트에 의한 밀도 구배 6-12에 대한 용액 단백질 함량 측정(μg/mL). (D) 용액: 내독소 검출 키트(Abs)를 사용한 밀도 구배 7-11에 의한 LPS 발현 측정. (E) 밀도 구배가 6 - 12인 용액을 SDS-PAGE 겔 전기영동을 실시하고 Coomassie brilliant blue로 염색했습니다. (F) TEM : 스케일 바는 100nm입니다. 개별 소포가 이미지에 표시되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 다양한 식단에 따른 혈압 및 EV의 변화 분석. (A) SBP; (B) DBP; (C) MBP; (D) HSD 및 NSD 그룹의 외부 소포 농도 비교; (E) HSD 및 NSD 그룹의 외부 소포 크기 비교. (F) 분광 광도계에 의해 결정된 NSD 및 HSD 샘플의 LPS. *p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, NS는 유의성 없음을 의미하며, t-검정입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 다양한 식단에서 16s rRNA 테스트 분석. (A) α 다양성 분석; (B) 주요 좌표 분석; (C) 문(phyla) 수준에서 장내 미생물총(microbiota)의 풍부함; (D) 문 수준 박테리아의 변화; (E) LEfSe 결과; (F) 차등 박테리아 속을 기반으로 한 클러스터 히트맵 분석; (G) 속 수준 박테리아의 변화. *p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, NS는 유의성 없음을 의미하며, t-검정입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

이 연구에서는 HSD에서 염분에 민감한 쥐의 장내 미생물군 EV에 초점을 맞추고 일련의 주요 성과를 달성했습니다. 첫째, HSD의 염분에 민감한 쥐의 장내 미생물군으로부터 EV를 분리하기 위해 밀도 구배 원심분리를 기반으로 하는 효율적인 추출 방법을 성공적으로 구축했으며, 세심하고 표준화된 동물 실험 조작 및 샘플 처리 프로세스를 통해 대부분의 비 EV 구성 요소를 분리했습니다. 밀도 구배 원심분리의 EV 추출 방법은 매우 효율적이고 재현성이 뛰어나 기존의 초원심분리 방법보다 우수하며 EV의 무결성과 기능을 더 잘 유지할 수 있어 시료 품질과 연구 타당성을 보장할 수 있습니다.

둘째, EV는 다양한 동적 기술을 통해 종합적으로 식별되었습니다: 입자 크기 및 농도 감지는 EV가 특정 크기 분포를 가지고 있음을 나타냅니다. LPS 및 BCA 측정은 EV의 단백질 함량과 LPS 발현을 정량화합니다. TEM은 EV의 형태학적 구조를 명확하게 보여줍니다. 그리고 단백질 특성은 단백질 스펙트럼을 정의합니다. 이러한 식별 결과는 EV의 물리적 및 생화학적 특성을 종합적으로 밝혀 후속 연구를 위한 신뢰할 수 있는 데이터 지원을 제공합니다.

또한, 정상 EV와 HSD EV의 기원과 구성 차이에 대한 심층 분석, α-다양성 분석 및 β-다양성 분석을 이용한 16S rRNA 유전자 염기서열 분석 기술을 통해 높은 염분 섭취가 미생물 군집 구조, 종 풍부도, 다양성 등 장내 미생물 EV의 유전적 특성에 유의한 영향을 미친다는 것을 보여주었으며, 이를 통해 고염 식단이 장내 미생물군 EV에 미치는 영향을 보다 종합적으로 해결할 수 있었습니다. 기계론적 연구를 위한 여러 수준의 증거를 제공합니다.

이 방법은 엑소좀 회수율 및 무결성 측면에서 기존의 과속 원심분리 방법에 비해 몇 가지 장점이 있지만, 샘플 수요가 많고 미생물 소스와 숙주를 구별하기 어려운 등 여전히 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 그러나 밀도 구배 원심분리는 기존 방법과 비교했을 때 엑소좀의 기능적 무결성을 유지하는 데 있어 고유한 장점이 있으며, 이는 고염분 식단이 장내 세균총을 통해 숙주 혈압에 영향을 미치는 메커니즘에 대한 추가 연구를 위한 신뢰할 수 있는 기술 지원을 제공합니다. 또한, 실험 중에 발생한 불분명한 구배 층화에 대해서는 원심분리 시간을 연장하거나 고성능 로터를 교체하여 개선했습니다.

미래에는 고염 식단에 의해 유발된 고혈압에서 장내 미생물군 EV의 메커니즘, 특히 전염증성 T 세포와 같은 면역 체계와의 상호 작용에 대해 더 자세히 탐구할 수 있습니다^39,40; 또는 식물 유래 제품을 사용하여 장내 미생물 EVs^41,42에 개입하고, 질병에 더 나아가 개입하고, 숙주 대사 및 면역 반응을 조절하는 역할을 탐구합니다.

결론적으로, 본 연구는 염분에 민감한 쥐 모델을 통해 장내 미생물총(microbiota)의 염분 유발 고혈압 기전을 규명할 수 있는 중요한 도구를 제공할 뿐만 아니라, HSD, 장내 미생물군 및 EV의 관계에 대한 이해를 심화시킬 뿐만 아니라, 고혈압과 같은 심혈관 질환의 예방 및 치료를 위한 새로운 길을 열었으며, 식이-미생물-숙주 상호작용 연구를 위한 독특한 관점을 제공합니다.

저자들은 이 논문에 보고된 연구에 영향을 미칠 수 있는 경쟁적인 재정적 이해관계나 개인적 관계를 알려진 바가 없다고 선언합니다.

이 연구는 중국 국립자연과학재단(82205240), 쓰촨성 자연과학재단(2025ZNSFSC1836), 쓰촨성 정형외과 병원의 임상 기초 프로젝트(PY202414)의 지원을 받았다.