JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف البروتوكول عزل المركبات الكهربائية الميكروبية في الأمعاء عن الفئران الحساسة للملح التي تتغذى على HSD باستخدام الطرد المركزي المتدرج الكثافة. تميزت المركبات الكهربائية بتتبع الجسيمات النانوية ، ومقايسات TEM ، و LPS / BCA ، وتسلسل 16S rRNA لتحليل الحجم والتشكل والتكوين وأصل الجراثيم.

Abstract

يعد تناول كميات كبيرة من الملح عامل خطر رئيسي لارتفاع ضغط الدم ، وقد ترتبط آليته الأساسية ارتباطا وثيقا بالحويصلات خارج الخلية (EVs) التي تفرزها ميكروبات الأمعاء. تحمل هذه المركبات الكهربائية ، التي تنتجها ميكروبات الأمعاء ، العديد من المكونات النشطة بيولوجيا التي قد تلعب دورا مهما في تطور ارتفاع ضغط الدم الناجم عن نظام غذائي عالي الملح (HSD). للتحقيق في هذه الآلية ، قمنا بتطوير طريقة استخراج فعالة تعتمد على الطرد المركزي المتدرج للكثافة لعزل المركبات الكهربائية من ميكروبات الأمعاء للفئران الحساسة للملح التي تتغذى على HSD. من خلال تحليل حجم الجسيمات ، والفحص المجهري الإلكتروني للإرسال (TEM) ، والكشف عن عديدات السكاريد الدهنية (LPS) ، حددنا التوزيع المتدرج لميكروبات الأمعاء EVs وحققنا استخراجا دقيقا. علاوة على ذلك ، تم استخدام تسلسل جين 16S rRNA لتحليل الأصل والاختلافات التركيبية للمركبات الكهربائية بين المجموعات العادية و HSD ، مما يكشف عن تأثير تناول كميات كبيرة من الملح على الخصائص الوراثية لميكروبات الأمعاء EVs. توفر هذه الدراسة أدوات قيمة ورؤى علمية حول آليات الجراثيم الأمعاء الكامنة وراء ارتفاع ضغط الدم الناجم عن الملح وتقدم وجهات نظر جديدة للوقاية من الأمراض ذات الصلة وعلاجها.

Introduction

الجراثيم الأمعاء ، والمعروفة أيضا باسم ميكروبيوتا الأمعاء أو ميكروبيورا الأمعاء ، هي مجموعة من عشرات الآلاف من الكائنات الحية الدقيقة الموجودة في الجهاز الهضمي البيولوجي وتلعب دورا مهما في الحفاظ على صحةالإنسان 1. في السنوات الأخيرة ، مع مزيد من البحث ، وجد أن ميكروبات الأمعاء يمكن أن تنتج حويصلات خارج الخلية (EVs)2. EVs عبارة عن حويصلات صغيرة تطلقها الخلايا ، والتي تحمل جزيئات مختلفة في الخلية ، مثل البروتينات والأحماض النووية والدهون3،4. يمكن أن تتفاعل مع الميكروبات الأخرى5 ، والخلايا الظهارية المعوية ، وحتى الأنسجة والأعضاء البعيدة6 ، مما يؤثر على صحة جسم الإنسان7،8. هناك صلة وثيقة بين المركبات الكهربائية التي تنتجها ميكروبات الأمعاء والنظام الغذائي9.

قد تكون المركبات الكهربائية التي تنتجها ميكروبات الأمعاء عوامل مهمة يؤثر من خلالها النظام الغذائي الغني بالملح (HSD) على صحة الجسم. لا يعطل HSD توازن ميكروبات الأمعاءبشكل مباشر 10 فحسب ، مما يؤدي إلى انخفاض كبير في عدد البكتيريا المفيدة (مثل Lactobacillus)11 ، ولكنه يعزز أيضا تكاثر البكتيريا الضارة (مثل Bacteroides ، إلخ.)12. يقلل هذا الخلل من وظيفة الحاجز المعوي ويزيد من خطر الإصابة بالتهاب الأمعاء. بالإضافة إلى ذلك ، يؤثر HSD أيضا على التوازن الحمضي القاعدي وامتصاص العناصر الغذائية في الأمعاء عن طريق تغيير أنشطة التمثيل الغذائي13 من ميكروبات الأمعاء ، مثل تقليل إنتاج الأحماض الدهنية قصيرة السلسلة14،15 مع وظائف فسيولوجية متعددة.

لا تؤثر هذه التغييرات على صحة الأمعاء فحسب ، بل قد تنظم أيضا بشكل غير مباشر إنتاج المركبات الكهربائية وإطلاقها وتغير تكوين المركبات الكهربائية ووظيفتها. قد تؤثر البيئة عالية الملح على الوظائف الفسيولوجية الطبيعية للخلايا المعوية ، بما في ذلك إطلاق المركبات الكهربائية ونقلها ، مما يزعج دور المركبات الكهربائية في نقل المعلومات بين الخلايا وتنظيم المناعة. في الوقت نفسه ، قد يعزز التهاب الأمعاء مجموعة متنوعة من المركبات الكهربائية ذات الوظائف الخاصة16 وينتشر إلى الجسم كله من خلال محور الأمعاء والأعضاء وطرق أخرى17،18 ، والذي يرتبط ارتباطا وثيقا بحدوث وتطور ارتفاع ضغط الدم19،20 ، وأمراض القلب والأوعية الدموية21 وأمراض الأوعية الدمويةالدماغية 22،23 ، والسمنة24،25 ، ومرض السكري26 والأمراض المزمنة الأخرى.

لذلك ، كان الهدف العام لهذه الدراسة هو تطوير طريقة فعالة وموثوقة لاستخراج المركبات الكهربائية من ميكروبات الأمعاء للفئران الحساسة للملح التي تتغذى على HSD ودراسة خصائصها الفيزيائية وتكوينها ووظائفها بشكل منهجي. نظرا لخصائص الزيادة الكبيرة في ضغط الدم بعد اتباع نظام غذائي عالي الملح ، تم اختيار الفئران الحساسة للملح وكشفت عن تأثير HSD على ميكروبات الأمعاء EV من خلال بناء طريقة استخراج فعالة. استندت الطريقة إلى الطرد المركزي المتدرج للكثافة وجمعت بين تقنيات تحديد ديناميكية مختلفة مثل اكتشاف حجم الجسيمات ، وقياس LPS / BCA ، والفحص المجهري الإلكتروني للإرسال ، والتحليل البروتيني. يهدف البروتوكول إلى الكشف عن آثار HSD على ميكروبات الأمعاء EV وآلياتها في أمراض القلب والأوعية الدموية. بفضل كفاءته العالية وقابليته للتكاثر وقابليته للتطبيق الواسع ، لا يوفر هذا النهج أداة مهمة لاستكشاف آلية ميكروبات الأمعاء EVs في ارتفاع ضغط الدم الناجم عن الملح فحسب ، بل يضع أيضا الأساس النظري لتطوير استراتيجيات التدخل في المرض بناء على المركبات الكهربائية. من خلال هذه الدراسة ، نأمل في فتح طرق جديدة للوقاية والعلاج من أمراض القلب والأوعية الدموية ، مثل ارتفاع ضغط الدم27،28.

Protocol

تتوافق هذه الدراسة التجريبية على مع المبادئ التوجيهية الأخلاقية والمعايير الدولية ذات الصلة. تمت الموافقة على الدراسات التي شملت من قبل لجنة رعاية وأخلاقيات المختبر التابعة لجامعة تشنغدو للطب الصيني (مؤسسة: جامعة تشنغدو للطب الصيني ؛ رقم البروتوكول: 2018-21).

1. إعداد ونظام النظام الغذائي

  1. تأقلم ذكور الفئران الحساسة للملح البالغة من العمر 6 أسابيع ، وزن الجسم 180-200 جم ، عن طريق التربية عند 50٪ ± 10٪ رطوبة ؛ دورة ضوئية 12 ساعة / 12 ساعة ؛ 20.0 ± 2.0 درجة مئوية لمدة أسبوع واحد في ظل ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض.
  2. بعد ذلك ، قسم الفئران بالتساوي إلى مجموعتين (ن = 6). زود كل مجموعة بنظام غذائي مختلف يستمر لمدة 6 أسابيع: نظام غذائي عادي بالملح (NSD) يحتوي على 0.5٪ كلوريد الصوديوم و HSD مع 8٪ كلوريد الصوديوم ، والذي يشيع استخدامه في الدراسات المنشورة29،30،31. كان للفئران وصول غير محدود إلى الطعام والماء طوال الدراسة.

2. مراقبة ضغط الدم

ملاحظة: تم استخدام تخطيط تحجم الكفة الذيل كطريقة غير جراحية لقياس ضغط الدم ، وتم استخدام تسجيل الضغط الحجمي (VPR) عند قياس ضغط الدم من حجم دم الذيل.

  1. ضع الفئران بشكل فردي في أقفاص صغيرة مع نشارة الخشب ، وتسخينها لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية تقريبا وضعها في مقعد مخصص للقوارض مع أنف وباب قابل للتعديل لدخول. ضع الفئران على وسادة تدفئة في وضع الانبطاح للحفاظ على درجة حرارة أجسامها عند 37 درجة مئوية.
  2. قم بتوصيل مستشعر VPR بالجزء السفلي من الذيل واضبط 10 دورات تكيف على الأقل لتثبيت BP28.
    1. املأ الكفة القابلة للنفخ على جذر الذيل وضع مستشعر التضخم (أو المستشعر الكهروضوئي) أدناه. تضخيم ببطء إلى أعلى من الضغط الانقباضي (عادة 200 مم زئبق) ثم حرره ببطء. تكتشف الأداة تلقائيا قيمة ضغط اختفاء موجة النبض (ضغط الدم الانقباضي) والتعافي (ضغط الدم الانبساطي). قم بالقياس 3-5 مرات متتالية وخذ متوسط القيمة.
  3. قم بتدريب جميع الفئران على استيعاب إجراء ضبط النفس وإجراء هذه الدراسة في مختبر هادئ حوالي الساعة 9 صباحا لتقليل آثار التباين اليومي.
  4. قم بقياس ضغط الدم الانقباضي (SBP) وضغط الدم الانبساطي (DBP) كل يومين قبل التضحية. تقدير متوسط الضغط الشرياني (MAP) من SBP و DBP
    MAP = (SBP + 2 DBP) / 3

3. استخراج المركبات الكهربائية

  1. جمع العينات
    1. اغمس قطعة قطن معقمة في 75٪ كحول واستخدمها لتحفيز فتحة الشرج في الفئران. كان الغرض من التحفيز هو تعزيز التمعج المعوي وإرخاء العضلة العاصرة الشرجية ، وبالتالي تعزيز التغوط. بعد طرد البراز ، اجمعها باستخدام ملقط معقم في حاويات معقمة ذات حجم مناسب وقم بتخزينها على الفور عند -80 درجة مئوية.
  2. تحضير العينة
    1. باستخدام ملعقة ، انقل 5 جم من البراز إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل يزن مسبقا. أضف 50 مل من PBS الخالي من السموم الداخلية المسخن مسبقا بدرجة حرارة 37 درجة مئوية (أقصى تركيز للعينة 10٪) إلى الأنبوب وقم بتدويره لمدة 30 دقيقة. قم بتبريد جهاز الطرد المركزي عالي السرعة إلى 4 درجات مئوية.
    2. جهاز طرد مركزي عند 8,000 × جم لمدة 15 دقيقة بعد وضع العينات بشكل متماثل للسماح لجهاز الطرد المركزي بالتوازن. بعد الطرد المركزي ، قم بشفط المادة الطافية ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي معقم جديد.
    3. جهاز طرد مركزي مرة أخرى عند 8,000 × جم لمدة 15 دقيقة. استنشق المادة الطافية واستخدمها لمزيد من التحليل.
  3. تحضير المستخلصات الخام
    1. استخدم وحدة فلتر معقمة 0.22 ميكرومتر. ضع وحدة الفلتر على الثلج وأمسك مضخة التفريغ بإحكام. انقل المادة الطافية التي تم الحصول عليها إلى الجزء العلوي من الفلتر. قم بتشغيل مضخة التفريغ لجمع العينات المفلترة.
    2. انقل المرشح إلى مرشح طرد مركزي (10 كيلو دالتون ، 15 مل) ، وجهاز طرد مركزي عند 4 درجات مئوية ، 3,000 × جم لمدة 30 دقيقة ، وتركيز العينة على 1400 ميكرولتر على الأقل.
    3. اجمع العينة المركزة ، وإذا لزم الأمر ، قم بتخفيفها إلى 1400 ميكرولتر باستخدام PBS الخالي من السموم الداخلية المبرد مسبقا. احتفظ بالعينة على الجليد مباشرة بعد التخفيف.
      ملاحظة: يمكن استخدام المستخلص الخام على الفور أو تخزينه في درجة حرارة -80 درجة مئوية لعدة أشهر.
  4. فصل المركبات الكهربائية
    1. قم بإعداد المخزن المؤقت للتدرج A والنطاق المؤقت للتدرج B كما هو موضح أدناه. قم بإعداد المخزن المؤقت قبل يوم واحد ، حيث يستغرق الأمر عدة ساعات حتى يذوب المركب تماما. يمكن تخزين المخزن المؤقت المحضر عند 4 درجات مئوية لمدة 6 أشهر.
      1. تحضير المخزن المؤقت المتدرج أ: قم بإذابة 0.25 م من السكروز ، و 6 ملي مولار EDTA ، و 60 ملي تريس في 800 مل من الماء الخالي من السموم الداخلية عن طريق التحريك بالخلاط المغناطيسي ، مع تعديل الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 باستخدام حمض الهيدروكلوريك. خفف إلى 1 لتر بالماء الخالي من السموم الداخلية. استخدم مرشحا أعلى الزجاجة 0.22 ميكرومتر لتصفية المخزن المؤقت.
      2. تحضير المخزن المؤقت المتدرج ب: قم بإذابة 0.25 م من السكروز ، و 1 ملي مولار EDTA ، و 10 ملي تريس في 800 مل من الماء الخالي من السموم الداخلية عن طريق التحريك بالخلاط المغناطيسي ، مع تعديل الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 مع حمض الهيدروكلوريك. مخفف إلى 1 لتر بماء خال من السموم الداخلية. استخدم مرشحا علويا للزجاجة 0.22 ميكرومتر لتصفية المخزن المؤقت.
    2. امزج حجما واحدا من المخزن المؤقت المتدرج A و 5 أحجام من وسط تدرج الكثافة (الوسط هو 60٪ محلول يوديكسانول) لتحضير محلول العمل.
    3. تحضير محلول اليوديكسانول (10٪ ، 20٪ ، 40٪): لتحضير محلول يوديكسانول بنسبة 10٪ ، امزج محلول عمل واحد و 4 وحدات عازلة B ؛ لمحلول اليوديكسانول بنسبة 20٪ ، امزج محلول عمل 2 وحدة و 3 وحدات عازلة B ؛ للحصول على محلول يوديكسانول بنسبة 40٪ ، امزج 4 وحدات من محلول العمل ووحدة عازلة واحدة ب. قم بإعداد كل محلول طازجا وتخزينه على الثلج.
      ملاحظة: يجب إعداد حلول عمل جديدة لكل تجربة ، ويمكن إعداد حجم إضافي بنسبة 10٪ من الحلول لحساب الخطأ التجريبي.
    4. امزج المحلول المحضر في الخطوة 3.3.3 مع 7 مل من وسط تدرج الكثافة لعمل محلول يوديكسانول بنسبة 50٪.
    5. لتحضير تدرج الكثافة ، أضف محلول تريبان الأزرق إلى محلول 40٪ و 10٪ (بالوزن / الحجم) محلول يوديكسانول لتوفير مخطط واضح بين الطبقات المتميزة.
    6. انقل 8 مل من محلول اليوديكسانول بنسبة 50٪ إلى قاع أنبوب الطرد المركزي الرقيق من مادة البولي بروبيلين. قم بإمالة الأنبوب إلى 70 درجة وانقل 8 مل من محلول اليوديكسانول بنسبة 40٪ إلى سطح السائل. أضف 8 مل من محلول اليوديكسانول 20٪ ، ثم 7 مل من محلول اليوديكسانول بنسبة 10٪ ، وأخيرا 2 مل من PBS الخالي من السموم الداخلية.
      ملاحظة: يتطلب تحضير تدرج الكثافة ممارسة. جودة تدرج الكثافة له تأثير كبير على النتائج التجريبية. لا تضع الأنبوب في وضع مستقيم بين خطوات مختلفة في عملية الإضافة ، لأن هذا يؤثر سلبا على جودة تدرج الكثافة.
    7. قم بتبريد جهاز الطرد المركزي مسبقا وضع تدرج الكثافة المحضر في جهاز الطرد المركزي الفائق. معلمات الإدخال للبدء ، قيم المعلمات: 100,000 × جم ، 20 ساعة ، 10 درجة مئوية.
    8. لفصل كثافة التدرج اليدوي ، ارسم ببطء 2 مل من المحلول من مركز سطح النظام الذي يحتوي على إجمالي 34 مل من السائل. كل 2 مل هو تدرج ، وبالتالي يقسم محلول تدرج الكثافة إلى 17 تدرجا.
    9. انقل كسور الكثافة إلى أنبوب عينة معقم باستخدام ماصة وضعها على الفور على الجليد. قم بتثبيت أنبوب الطرد المركزي بين الإبهام والسبابة للتأكد من بقائه في وضع مستقيم.
  5. استعادة المركبات الكهربائية
    1. باستخدام نظام استخراج المركبات الكهربائية الآلي بالكامل الذي يطبق تذبذب الضغط السلبي من خلال نظام تذبذب بالموجات فوق الصوتية مزدوج الاقتران على شريحة الترشيح الفائق ، قم بإزالة شوائب الحمض النووي والبروتين في العينة من خلال المسام النانوية واعتراض المركبات الكهربائية ، مما يؤدي إلى إثراء وتنقية المركبات الكهربائية.
      1. قم بإزالة المرشح في الخطوة 3.4.7 وأضفه إلى شريحة الترشيح الفائق.
      2. قم بتشغيل الجهاز وفقا لتعليمات الجهاز وجمع المرشح المفلتر ، أي المحلول المخصب بالإكسوسوم. العملية الرئيسية موضحة في الشكل 1.

4. تحديد المركبات الكهربائية

  1. كشف حجم الجسيمات وتركيزها
    1. تقييم توزيع الحجم وإمكانات زيتا باستخدام عداد مقياس الكولوم النانوي القائم على استشعار النبض المقاوم (RPS). حدد رقائق nanopore بنطاق قياس يتراوح بين 60 و 200 نانومتر لهذه التجربة. علاوة على ذلك ، قم بتقييم توزيع حجم الجسيمات وإمكانات زيتا للمركبات الكهربائية باستخدام عداد مكتبة نانوية.
      1. خذ كمية مناسبة من محلول المركبات الكهربائية وقم بتخفيفه (1/10 ، 1/100 ، 1/1000 ، 1/10000).
      2. تم وضع تخفيفات مختلفة من حلول المركبات الكهربائية على الجهاز للاختبار.
      3. تم اختيار مضاعف التخفيف مع ثبات أفضل واختباره مرة أخرى للحصول على بيانات أكثر دقة.
  2. اختبار LPS و BCA
    1. مقايسة BCA: Lyse EVs باستخدام المخزن المؤقت RIPA ثم فصل البروتينات. حدد محتوى البروتين في المركبات الكهربائية باستخدام مجموعة تحديد تركيز بروتين BCA.
    2. مقايسة LPS: باستخدام مجموعة الكشف عن السموم الداخلية ، أضف عينات ، وكاشف السموم الداخلية ، ومولوك الألوان وفقا لخطوات المجموعة. قم بقياس الامتصاص عند 545 نانومتر واحسب تعبير LPS للحويصلات الخارجية وفقا للمنحنى القياسي.
  3. تقييم TEM: للتلطيخ السلبي وتحليل TEM، ضع العينات على شبكة نحاسية مضيئة مطلية بغشاء كربوني مستمر وصمة عار بفورمات اليورانيل بنسبة 0.75٪. بالنسبة إلى cryo-EM ، امتصاص المركبات الكهربائية في شبكة كربون EM 300 شبكة مع سطح محب للماء وقم بتجميد النيتروجين السائل. راقب الشبكات وحللها باستخدام Cryo-TEM وسجل الصور بتكبير22,000 32.
  4. توصيف البروتينات: Lyse EVs باستخدام RIPA buffer ثم فصل البروتينات. حدد تركيز البروتين باستخدام مجموعة فحص البروتين BCA ، وافصل كميات متساوية من البروتين من كل عينة بواسطة SDS-PAGE ، وصمة عار بمحلول صبغة Coomassie الزرقاء بعد الرحلان الكهربائي لتصور ملامح البروتين33،34.
  5. تسلسل وتحليل S: استخراج الحمض النووي الجيني من عينات البراز باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي البرازي. تقييم سلامة وتركيز الحمض النووي عن طريق الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز ومقياس الطيف الضوئي. قم بتضخيم منطقة V3 - V4 من جين 16S rRNA باستخدام بادئات عالمية ، وتنقية منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل ، وتحديدها كميا ، وتسلسلها على منصة Illumina. قم بإجراء تحليل البيانات باستخدام خط أنابيب QIIME235.
    1. تصنيف متغيرات تسلسل الamplicon (ASVs) باستخدام DADA2 ومطابقتها مع قاعدة بيانات Silva باستخدام خوارزمية VSEARCH. استخدم تحليل α-Diversity لتقييم ثراء الأنواع وتنوعها داخل العينات، باستخدام مؤشرات مثل مؤشر شانون ومؤشر Chao1 بشكل أساسي. يقارن تحليل β-التنوع تكوين المجتمع الميكروبي بين العينات وعادة ما يتم تصوره من خلال تحليل الإحداثيات الرئيسية (PCoA). استخدم طرق التحليل التفاضلي ، مثل حجم تأثير التحليل التمييزي الخطي (LEfSe) وتحليل مؤامرة البركان ، لتحديد الأصناف الميكروبية ذات الظروف المختلفة بشكل كبير أو بين المجموعات.

النتائج

تم تحديد تركيزات المركبات الكهربائية في كسور مختلفة (الشكل 2 أ). أظهرت النتائج التجريبية أن تركيز المركبات الكهربائية أظهر نمط توزيع طبيعي نموذجي في سلسلة من محاليل تدرج الكثافة (الشكل 2 ب). على وجه التحديد ، في الجزء 9 ، وصل تركيز المركبات الكهربائية إلى أعلى نقطة له (3.85 × 109) ، مما يشير إلى أن جزء التوزيع الرئيسي للمركبات الكهربائية قد يكون 936.

لتحديد محتوى البروتين ، تم استخدام مجموعات BCA لتقييم محتوى البروتين في أجزاء مختلفة (الشكل 2 ج). في هذه الطريقة ، كان محتوى البروتين في الجزء 9 0.417 ميكروغرام / ميكرولتر ، مما يوضح بشكل أكبر توزيع المركبات الكهربائية. نظرا لأن LPS هو مكون فريد من نوعه للبكتيريا سالبة الجرام37،38 ، فقد تم استخدام مجموعات الكشف عن السموم الداخلية أيضا لتحديد التعبير عن LPS (الشكل 2 د) من أجل تقييم توزيع المركبات الكهربائية في كسور مختلفة. أظهرت النتائج التجريبية أنه في الكسرين 9 و 10 ، كان تعبير LPS أعلى بشكل ملحوظ من الكسور الأخرى (امتصاص الكسر 9 = 0.8086 ، للكسر 10 = 0.8515) ، وأظهر توزيعه توزيعا طبيعيا ، مما أثبت أن المركبات الكهربائية موزعة بشكل أساسي في الكسر 9. كما لوحظت كميات أكبر نسبيا من البروتين في الجزء 9 في الرحلان الكهربائي للهلام SDS-PAGE للمركبات الكهربائية المعزولة من كسور مختلفة (الشكل 2 ه).

فحصت هذه الدراسة المركبات الكهربائية باستخدام المجهر الإلكتروني للإرسال (TEM; الشكل 2F). من خلال التصوير عالي الدقة بواسطة TEM ، تمكنت من تصور التركيب المورفولوجي للمركبات الكهربائية بوضوح ، والتي تتميز بهياكل دائرية تشبه الغشاء ، وهو أمر بالغ الأهمية لفهم بيولوجيا المركبات الكهربائية.

تم تحديد تغيرات ضغط الدم في مجموعات NSD و HSD بعد شهرين من التربية في NSD و HSD للفئران. يمكننا أن نرى أن SBP (الشكل 3 أ) و DBP (الشكل 3 ب) و MBP (الشكل 3 ج) قد زادت بشكل كبير في مجموعة HSD ، مما يشير إلى أن نموذج ارتفاع ضغط الدم لهذه الدراسة قد تم إنشاؤه بنجاح.

في هذه الدراسة ، تم الكشف عن تركيز المركبات الكهربائية في مجموعات مختلفة (الشكل 3 د) ، وأظهرت النتائج أن تركيز المركبات الكهربائية في مجموعة HSD كان أعلى بكثير من تركيز الفئران في مجموعة NSD. يشير هذا إلى أن HSD يؤثر على مستوى المركبات الكهربائية ، ويرجع ذلك إلى التغيرات في تكوين ميكروبات الأمعاء التي تنشأ منها المركبات الكهربائية.

ثم تم قياس حجم جسيمات المركبات الكهربائية في هذه الدراسة. تشير نتائج القياس إلى أن حجم جسيمات المركبات الكهربائية يبلغ في الغالب حوالي 60 نانومتر (الشكل 3E) ، وأن حجم الجسيمات لمجموعة HSD أقل قليلا من حجم مجموعة NSD. توفر البيانات المقاسة معلومات مهمة لتقييم توزيع حجم المركبات الكهربائية وتجانسها ، مما يسهل التصميم التجريبي اللاحق وتطوير التطبيقات.

بعد ذلك ، في هذه الدراسة ، تم فحص مقدار تعبير LPS للمركبات الكهربائية في مجموعة HSD ومجموعة NSD (الشكل 3F). أظهرت النتائج أن التعبير عن LPS بواسطة المركبات الكهربائية في مجموعة HSD كان أيضا أعلى بكثير من ذلك في مجموعة NSD. قد يكون هذا بسبب الزيادة في البكتيريا سالبة الجرام في ميكروبات الأمعاء المشتقة من exovesicle أو بسبب ارتفاع تركيز EVs في مجموعة HSD مقارنة بمجموعة NSD.

لمزيد من الدعم للاختلافات بين المركبات الكهربائية في مجموعات HSD و NSD ، بحثت هذه الدراسة في ميكروبات الأمعاء المشتقة وأجرت تسلسل 16S rRNA لعينات EVs من مجموعات NSD و HSD لتوضيح تأثير HSD على المركبات الكهربائية في ميكروبات الأمعاء في الفئران.

أظهر تحليل α-التنوع أن تنوع ميكروبات الأمعاء قد انخفض بشكل كبير في مجموعة HSD ، مع انخفاض كل من مؤشري شانون و ACE (الشكل 4 أ). β - ميز تحليل التنوع ، المستند إلى PCoA (الشكل 4 ب) ، الأنماط الظاهرية الميكروبية بين المجموعات على مستوى ASV. عكس التدخل العالي الملح جزئيا التغيرات المظهرية في بكتيريا الأمعاء ووجد اختلافات كبيرة في تكوين ميكروبيوتا الأمعاء الخارجية المشتقة من الحويصلة بين المجموعات (ص = 0.001).

بعد تصفية البكتيريا منخفضة الوفرة وتوحيد البيانات ، حدد التعليق التوضيحي التصنيفي نطاقات مختلفة من المجتمعات الميكروبية في العينات. تتكون ميكروبات الأمعاء المشتقة من exovesicle بشكل أساسي من البكتيريا البروتينية (93.19٪) و Firmicutes (4.57٪) و Bacteroidota (1.19٪. الشكل 4 ج). زادت مجموعة HSD بشكل كبير من وفرة الحويصلات الخارجية Firmicutes (الشكل 4 د). على مستوى الجنس ، أظهرت النتائج أن الأجناس مثل Nevskia و Acinetobacter كانت أكثر وفرة في مجموعة NSD ، بينما كانت Delftia و Burkholderia_Ca و Clostridium_sen أكثر وفرة في مجموعة HSD (الشكل 4E). بالإضافة إلى ذلك ، استخدمت هذه الدراسة أيضا خرائط الحرارة لإظهار الاختلافات في ميكروبات الأمعاء EVs بين مجموعة HSD ومجموعة NSD (الشكل 4F). بعد التدخل عالي الملح ، زادت وفرة بعض البكتيريا ، Delftia و Burkholderia_Ca بشكل كبير ، وانخفضت Nevskia و Acinetobacter بشكل ملحوظ (الشكل 4G). في الختام ، أدى التدخل العالي للملح إلى تغيير كبير في الفرق في إنتاج المركبات الكهربائية المشتقة من البكتيريا المعوية ، ويرجع ذلك أساسا إلى أنه غير توزيع البكتيريا الأبوية ، وكانت الخصائص الرئيسية هي انخفاض التنوع ، والتغيرات في بنية التوازن ، والتغيرات في وفرة البكتيريا المختلفة.

figure-results-5657
الشكل 1: استخراج وتوصيف الحويصلات الخارجية المشتقة من ميكروبات الأمعاء. (أ) مخطط تدفق استخراج الحويصلة الخارجية. (ب) توصيف الحويصلات الخارجية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-6178
الشكل 2: التوصيف الأساسي للمركبات الكهربائية وتحليل تدرج الكثافة المحلية. (أ) تركيز الحويصلة خارج وقياسات حجم الجسيمات بتدرجات كثافة مختلفة (نانومتر ؛ جسيمات / مل). (ب) مقارنة تركيزات الحويصلة الخارجية للمحلول حسب تدرج الكثافة 3-16 (جسيمات/مل). (ج) تحديد محتوى بروتين المحلول على تدرج الكثافة 6-12 بواسطة مجموعة BCA (ميكروغرام / مل). (د) قياس تعبير LPS بالمحلول بواسطة تدرج الكثافة 7-11 باستخدام مجموعة الكشف عن السموم الداخلية (Abs). (ه) تعرضت المحاليل ذات التدرج الكثافة من 6 إلى 12 للرحلان الكهربائي للهلام SDS-PAGE وملطخة باللون الأزرق اللامع Coomassie. (F) TEM: شريط المقياس 100 نانومتر؛ تظهر الحويصلات الفردية في الصورة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-7251
الشكل 3: تحليل التغيرات في ضغط الدم والمركبات الكهربائية في ظل أنظمة غذائية مختلفة. (أ) SBP؛ (ب) DBP؛ (ج) MBP؛ (د) مقارنة تركيزات الحويصلة الخارجية في فئتي HSD و NSD ؛ (ه) مقارنة حجم الحويصلة الخارجية في مجموعتي HSD و NSD. (و) LPS في عينات NSD و HSD التي يتم تحديدها بواسطة قياس الطيف الضوئي. * ص < 0.05 ، ** ص < 0.01 ، *** ص < 0.001 ، و NS تعني عدم وجود أهمية ، اختبار t. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-8070
الشكل 4: تحليل اختبار 16s rRNA في ظل الأنظمة الغذائية المختلفة. (أ) تحليل α التنوع ؛ (ب) تحليل الإحداثيات الرئيسية؛ (ج) وفرة ميكروبات الأمعاء على مستوى الشعب ؛ (د) التغيرات في البكتيريا على مستوى الشعبة. (ه) نتيجة LEfSe؛ (و) تحليل خريطة الحرارة العنقودية على أساس الأجناس البكتيرية التفاضلية؛ (ز) التغيرات في البكتيريا على مستوى الجنس. * ص < 0.05 ، ** ص < 0.01 ، *** ص < 0.001 ، و NS تعني عدم وجود أهمية ، اختبار t. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

في هذه الدراسة ، ركزنا على ميكروبات الأمعاء EVs في الفئران الحساسة للملح على HSD وحققنا سلسلة من الإنجازات الرئيسية. أولا ، تم إنشاء طريقة استخراج فعالة تعتمد على الطرد المركزي المتدرج للكثافة بنجاح لعزل المركبات الكهربائية من ميكروبات أمعاء الفئران الحساسة للملح على HSD ، وتم عزل معظم المكونات غير الكهربائية من خلال عملية معالجة تجريبية ومعالجة عينات دقيقة وموحدة للحيوانات. تتميز طريقة استخراج المركبات الكهربائية للطرد المركزي المتدرج بالكثافة بكفاءة عالية وقابلة للتكرار ، وأفضل من طريقة الطرد المركزي الفائقة التقليدية ، ويمكن أن تحتفظ بشكل أفضل بسلامة ووظائف المركبات الكهربائية ، مما يضمن جودة العينة وجدوى الدراسة.

ثانيا ، تم تحديد المركبات الكهربائية بشكل شامل من خلال تقنيات ديناميكية مختلفة: يشير اكتشاف حجم الجسيمات وتركيزها إلى أن المركبات الكهربائية لها توزيع حجم محدد. تحدد قياسات LPS و BCA محتوى البروتين وتعبير LPS للمركبات الكهربائية ؛ يوضح TEM بوضوح التركيب المورفولوجي للمركبات الكهربائية. وخصائص البروتين تحدد طيف البروتين. تكشف نتائج التعريف هذه بشكل شامل عن الخصائص الفيزيائية والكيميائية الحيوية للمركبات الكهربائية ، مما يوفر دعما موثوقا للبيانات للدراسات اللاحقة.

بالإضافة إلى ذلك ، أظهرت تقنية تسلسل الجينات 16S rRNA باستخدام تحليل متعمق للاختلافات بين أصل وتكوين المركبات الكهربائية العادية و HSD ، وتحليل التنوع α وتحليل التنوع β أن تناول كميات كبيرة من الملح يؤثر بشكل كبير على الخصائص الوراثية للمركبات الكهربائية الميكروبية في الأمعاء ، بما في ذلك بنية المجتمع الميكروبي وثراء الأنواع والتنوع ، لحل آثار النظام الغذائي عالي الملح بشكل أكثر شمولا على ميكروبات الأمعاء EVs ، يوفر مستويات متعددة من الأدلة للدراسات الميكانيكية.

على الرغم من أن هذه الطريقة لها بعض المزايا مقارنة بطريقة الطرد المركزي التقليدية ذات السرعة الزائدة من حيث استعادة الإكسوسوم وسلامته ، إلا أنه لا تزال هناك بعض القيود ، مثل ارتفاع الطلب على العينة وصعوبة التمييز بين المضيف ومصدر البكتيريا. ومع ذلك ، بالمقارنة مع الطرق الحالية ، فإن الطرد المركزي المتدرج للكثافة له مزايا فريدة في الحفاظ على السلامة الوظيفية للإكسوسومات ، مما يوفر دعما تقنيا موثوقا به لمزيد من التحقيق في الآلية التي يؤثر بها النظام الغذائي عالي الملح على ضغط الدم المضيف من خلال النباتات المعوية. علاوة على ذلك ، بالنسبة للتقسيم الطبقي غير الواضح للتدرج الذي تمت مواجهته أثناء التجربة ، قمنا أيضا بتحسين من خلال إطالة وقت الطرد المركزي أو استبدال الدوار عالي الأداء.

في المستقبل ، يمكننا استكشاف آلية ميكروبات الأمعاء EVs في ارتفاع ضغط الدم الناجم عن نظام غذائي عالي الملح ، وخاصة تفاعله مع جهاز المناعة ، مثل الخلايا التائية المؤيدة للالتهابات39،40. أو استخدام المنتجات المشتقة من النباتات للتدخل في ميكروبات الأمعاء EVs41،42 ، والتدخل بشكل أكبر في الأمراض واستكشاف دورها في تنظيم التمثيل الغذائي للمضيف والاستجابة المناعية.

في الختام ، لا توفر هذه الدراسة أداة مهمة لاستكشاف آلية ارتفاع ضغط الدم الناجم عن الملح في ميكروبات الأمعاء ، من خلال نموذج الفئران الحساسة للملح ، وتعميق فهم العلاقة بين HSD وميكروبات الأمعاء والمركبات الكهربائية ، كما فتحت طريقة جديدة للوقاية من أمراض القلب والأوعية الدموية وعلاجها مثل ارتفاع ضغط الدم ، وتوفر منظورا فريدا لدراسة التفاعل بين النظام الغذائي والميكروبات والمضيف.

Disclosures

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة معروفة أو علاقات شخصية يمكن أن يبدو أنها تؤثر على العمل المبلغ عنه في هذه الورقة.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82205240) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية لمقاطعة سيتشوان (2025ZNSFSC1836) ، والمشروع الأساسي السريري لمستشفى جراحة العظام بمقاطعة سيتشوان (PY202414).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Essential Supplies
Centrifugal Filter (10nkDa 2 mL)MilliporeUFC903096
Centrifuge Tude(50 mL)BKMAN20220404
Centrifuge TudesBECKMAN COULTERZ30815SCA
Vacuum Filtration SystemBiosharp24902581
Reagents
Chromogenic LAL Endotoxin Assay KitBeyotime022124240705
Coomassie Blue Fast Staining SolutionBeyotimeZ972241010
EDTADamas-betaP3117308
Enhanced BCA Protein Assay KitBeyotimeA006241112
EthanolKESH
HCl
OptiPrep (60% wt/vol, iodixanol)Serumwerk00124
PBSLabshark130114005
phosphotungstic acidRUIXIN
SucroseDamas-betaP1917057
Tris (VWR)Damas-betaP3061764
Trypan blue staining solution (0.4%)BeyotimeBD07242904
Equipment
Absorbance Microplate ReaderSpectraMaxABP01690
BiomicroscopeMoticBA210Digital
Desk centrifugeCenceCHT210R
Desktop high-speed micro centrifugeDLABD3024
Fixed Angle Aluminum Rotor + 500 mL Centrifugal CupCence
High precision electronic balanceSKRBN-200
Laminar flow cabinetNantong Hunan Scientific Instrument Co., Ltd.SW-CJ-2FDS
SW 32.1 Ti Swing bucket turn+ SW 32.1 Ti Rotor bucketBECKMAN COULTER
Transmission electron microscopeJEOLJEM-1400FLASH
Tube rotator
UltracentrifugeBECKMAN COULTEROptima XE-100
Ultra-pure water systemULPHWUPR-II-15TNZ
Water-Cieculation Multifunction Vacuum PumpQiang QiangSHZ-D(III)

References

  1. Thursby, E., Juge, N. Introduction to the human gut microbiota. Biochem J. 474 (11), 1823-1836 (2017).
  2. Aschtgen, M. S., et al. Rotation of Vibrio fischeri Flagella Produces Outer Membrane Vesicles That Induce Host Development. J Bacteriol. 198 (16), 2156-2165 (2016).
  3. Gurung, S., Perocheau, D., Touramanidou, L., Baruteau, J. The exosome journey: from biogenesis to uptake and intracellular signalling. Cell Comm Signal. 19 (1), 47(2021).
  4. Avila-Calderón, E. D., et al. Outer Membrane Vesicles of Gram-Negative Bacteria: An Outlook on Biogenesis. Front Microbiol. 12, 557902(2021).
  5. Melo-Marques, I., Cardoso, S. M., Empadinhas, N. Bacterial extracellular vesicles at the interface of gut microbiota and immunity. Gut Microbes. 16 (1), 2396494(2024).
  6. Kim, N. Y., et al. Effect of gut microbiota-derived metabolites and extracellular vesicles on neurodegenerative disease in a gut-brain axis chip. Nano Converg. 11 (1), 7(2024).
  7. Ahmadi Badi, S., et al. Microbiota-Derived Extracellular Vesicles as New Systemic Regulators. Front Microbiol. 8, 1610(2017).
  8. Barathan, M., Ng, S. L., Lokanathan, Y., Ng, M. H., Law, J. X. The Profound Influence of Gut Microbiome and Extracellular Vesicles on Animal Health and Disease. Int J Mol Sci. 25 (7), 4024(2024).
  9. Maukonen, J., Saarela, M. Human gut microbiota: does diet matter. Proc Nutri Soc. 74 (1), 23-36 (2015).
  10. Bier, A., et al. A High Salt Diet Modulates the Gut Microbiota and Short Chain Fatty Acids Production in a Salt-Sensitive Hypertension Rat Model. Nutrients. 10 (9), 1154(2018).
  11. Aghamohammad, S., et al. Anti-inflammatory and immunomodulatory effects of Lactobacillus spp. as a preservative and therapeutic agent for IBD control. Immun Inflamm Dis. 10 (6), e635(2022).
  12. Dong, Z., et al. The Effects of High-Salt Gastric Intake on the Composition of the Intestinal Microbiota in Wistar Rats. Med Sci Monit. 26, e922160(2020).
  13. Yan, X., et al. Intestinal Flora Modulates Blood Pressure by Regulating the Synthesis of Intestinal-Derived Corticosterone in High Salt-Induced Hypertension. Circ Res. 126 (7), 839-853 (2020).
  14. Wang, X., Lang, F., Liu, D. High-Salt Diet and Intestinal Microbiota: Influence on Cardiovascular Disease and Inflammatory Bowel Disease. Biology. 13 (9), 674(2024).
  15. Qi, L., et al. Microbiome-metabolome analysis insight into the effects of high-salt diet on hemorheological functions in SD rats. Front Nutri. 11, 1408778(2024).
  16. Wu, Q., et al. Insights into the unique roles of extracellular vesicles for gut health modulation: Mechanisms, challenges, and perspectives. Curr Res Microb Sci. 7, 100301(2024).
  17. Zhang, H., et al. Effects of bacterial extracellular vesicles derived from oral and gastrointestinal pathogens on systemic diseases. Microbiol Res. 285, 127788(2024).
  18. Wang, H. X., Wang, Y. P. Gut Microbiota-brain Axis. Chinese Med J. 129 (19), 2373-2380 (2016).
  19. Huang, S., et al. A cross-tissue transcriptome association study identifies key genes in essential hypertension. Front Genet. 14, 1114174(2023).
  20. Gao, H., et al. Microbial DNA Enrichment Promotes Adrenomedullary Inflammation, Catecholamine Secretion, and Hypertension in Obese Mice. J Am Heart Assoc. 11 (4), e024561(2022).
  21. Chen, P. Gut Microbiota and Pathogenesis of Organ Injury. , Springer. Singapore. (2020).
  22. Xie, N., et al. hPSCs-derived brain organoids for disease modeling, toxicity testing and drug evaluation. Exp Neurol. 385, 115110(2024).
  23. Liu, N., et al. The underlying mechanisms of DNA methylation in high salt memory in hypertensive vascular disease. Sci Rep. 14 (1), 925(2024).
  24. Li, M., et al. Wheat β-glucan reduces obesity and hyperlipidemia in mice with high-fat and high-salt diet by regulating intestinal flora. Int J Biol Macromol. 288, 138754(2024).
  25. Kerem, G., et al. Small intestinal microbiota composition altered in obesity-T2DM mice with high salt fed. Sci Rep. 13 (1), 8256(2023).
  26. Díez-Sainz, E., Milagro, F. I., Riezu-Boj, J. I., Lorente-Cebrián, S. Effects of gut microbiota-derived extracellular vesicles on obesity and diabetes and their potential modulation through diet. J Physiol Biochem. 78 (2), 485-499 (2022).
  27. Wu, S., et al. Liuzijue training improves hypertension and modulates gut microbiota profile. Front Cardiovasc Med. 10, 1075084(2023).
  28. Qi, L. M., et al. Salvia miltiorrhiza bunge extract improves the Th17/Treg imbalance and modulates gut microbiota of hypertensive rats induced by high-salt diet. J Funct Foods. 117, 106211(2024).
  29. Wilck, N., et al. Salt-responsive gut commensal modulates T(H)17 axis and disease. Nature. 551 (7682), 585-589 (2017).
  30. Jiang, X., et al. Intestinal Gastrin/CCKBR (Cholecystokinin B Receptor) Ameliorates Salt-Sensitive Hypertension by Inhibiting Intestinal Na(+)/H(+) Exchanger 3 Activity Through a PKC (Protein Kinase C)-Mediated NHERF1 and NHERF2 Pathway. Hypertension. 79 (8), 1668-1679 (2022).
  31. Zheng, T., et al. Hypertension of liver-yang hyperactivity syndrome induced by a high salt diet by altering components of the gut microbiota associated with the glutamate/GABA-glutamine cycle. Front Nutr. 9, 964273(2022).
  32. Mulligan, S. K., et al. Multiplexed TEM Specimen Preparation and Analysis of Plasmonic Nanoparticles. Microsc Microanal. 21 (4), 1017-1025 (2015).
  33. Olson, B. Assays for Determination of Protein Concentration. Curr Protoc Pharmacol. 73, A.3a.1-a.3a.32 (2016).
  34. Matsumoto, H., Haniu, H., Komori, N. Determination of Protein Molecular Weights on SDS-PAGE. Methods Mol Biol. 1855, 101-105 (2019).
  35. Sanschagrin, S., Yergeau, E. Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons. J Vis Exp. (90), e51709(2014).
  36. Tulkens, J., De Wever, O., Hendrix, A. Analyzing bacterial extracellular vesicles in human body fluids by orthogonal biophysical separation and biochemical characterization. Nat Protoc. 15 (1), 40-67 (2020).
  37. Ruhal, R., Kataria, R. Biofilm patterns in gram-positive and gram-negative bacteria. Microbiol Res. 251, 126829(2021).
  38. Maldonado, R. F., Sá-Correia, I., Valvano, M. A. Lipopolysaccharide modification in Gram-negative bacteria during chronic infection. FEMS Microbio Rev. 40 (4), 480-493 (2016).
  39. Honda, K., Littman, D. R. The microbiota in adaptive immune homeostasis and disease. Nature. 535 (7610), 75-84 (2016).
  40. Guzik, T. J., et al. Role of the T cell in the genesis of angiotensin II induced hypertension and vascular dysfunction. J Exp Med. 204 (10), 2449-2460 (2007).
  41. Huang, J., et al. Extracellular vesicles as a novel mediator of interkingdom communication. Cytokine Growth Factor Rev. 73, 173-184 (2023).
  42. Li, W., et al. Alleviation of colitis by honeysuckle MIR2911 via direct regulation of gut microbiota. J Control Release. 376, 123-137 (2024).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 220

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved