הפרדה ואפיון דיפרנציאלי של שלפוחיות חוץ-תאיות של חיידקי מעיים בחולדות רגישות למלח בתנאי תזונה עתירי מלח

הפרוטוקול מתאר בידוד של EVs מיקרוביאליים במעיים מחולדות רגישות למלח המוזנות ב-HSD באמצעות צנטריפוגה של שיפוע צפיפות. EVs אופיינו במעקב אחר ננו-חלקיקים, מבחני TEM, LPS/BCA וריצוף 16S rRNA כדי לנתח את הגודל, המורפולוגיה, ההרכב ומקור המיקרוביוטה.

צריכת מלח גבוהה היא גורם סיכון עיקרי ליתר לחץ דם, והמנגנון הבסיסי שלו עשוי להיות קשור קשר הדוק לשלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) המופרשות על ידי מיקרוביוטת המעיים. EVs אלה, המיוצרים על ידי מיקרוביוטת המעיים, נושאים רכיבים ביו-אקטיביים שונים שעשויים למלא תפקיד מכריע בהתפתחות יתר לחץ דם הנגרם על ידי תזונה עתירת מלח (HSD). כדי לחקור את המנגנון הזה, פיתחנו שיטת מיצוי יעילה המבוססת על צנטריפוגה של שיפוע צפיפות כדי לבודד EVs ממיקרוביוטת המעיים של חולדות רגישות למלח שניזונו מ-HSD. באמצעות ניתוח גודל חלקיקים, מיקרוסקופ אלקטרונים הולכה (TEM) וזיהוי ליפופוליסכריד (LPS), זיהינו את התפלגות השיפוע של EVs של מיקרוביוטת המעיים והשגנו מיצוי מדויק. יתר על כן, ריצוף גנים 16S rRNA שימש לניתוח המקור וההבדלים בהרכב של EVs בין הקבוצה הנורמלית לקבוצת HSD, וחשף את ההשפעה של צריכת מלח גבוהה על המאפיינים הגנטיים של EVs של מיקרוביוטת המעיים. מחקר זה מספק כלים חשובים ותובנות מדעיות לגבי מנגנוני המיקרוביוטה של המעיים העומדים בבסיס יתר לחץ דם המושרה על ידי מלח ומציע נקודות מבט חדשות למניעה וטיפול במחלות קשורות.

מיקרוביוטת המעיים, הידועה גם בשם מיקרוביוטת המעיים או מיקרואקולוגיה של המעיים, היא קומפלקס של עשרות אלפי מיקרואורגניזמים הממוקמים במערכת העיכול הביולוגית וממלאת תפקיד מכריע בשמירה על בריאות האדם¹. בשנים האחרונות, עם מחקר נוסף, נמצא כי מיקרוביוטת המעיים יכולה לייצר שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs)². EVs הם שלפוחיות קטנות המשתחררות על ידי תאים, הנושאות מולקולות שונות בתא, כגון חלבונים, חומצות גרעין ושומנים ^3,4. הם יכולים לקיים אינטראקציה עם חיידקים אחרים⁵, תאי אפיתל במעי ואפילו רקמות ואיברים מרוחקים⁶, ובכך להשפיע על בריאות גוף האדם ^7,8. קיים קשר הדוק בין ה-EVs המיוצרים על ידי מיקרוביוטת המעיים הללו לבין דיאטה⁹.

EVs המיוצרים על ידי מיקרוביוטת המעיים עשויים להיות גורמים משמעותיים שדרכם תזונה עתירת מלח (HSD) משפיעה על בריאות הגוף. HSD לא רק משבש באופן ישיר את האיזון של חיידקי המעיים¹⁰, מה שמוביל להפחתה משמעותית במספר החיידקים המועילים (כגון לקטובצילוס)¹¹, אלא גם מקדם התפשטות של חיידקים מזיקים (כגון בקטרואידים וכו').¹². חוסר איזון זה מפחית את תפקוד מחסום המעי ומגביר את הסיכון לדלקת מעיים. בנוסף, HSD משפיע עוד יותר על איזון החומצה-בסיס וספיגת החומרים המזינים במעי על ידי שינוי הפעילויות המטבוליות¹³ של מיקרוביוטת המעי, כגון הפחתת ייצור חומצות שומן קצרות שרשרת ^14,15 עם פונקציות פיזיולוגיות מרובות.

שינויים אלה לא רק משפיעים על בריאות המעיים אלא גם עשויים לווסת בעקיפין את הייצור והשחרור של רכבים חשמליים ולשנות את הרכב ותפקוד ה-EV. סביבת המלח הגבוהה עלולה להשפיע על התפקודים הפיזיולוגיים הרגילים של תאי המעי, כולל שחרור והובלה של EVs, ובכך להפריע לתפקידם של EVs בהעברת מידע בין-תאי ובוויסות חיסוני. יחד עם זאת, דלקת מעיים עלולה לקדם מגוון EVs בעלי פונקציות מיוחדות¹⁶ ולהתפשט לכל הגוף דרך ציר המעי-איבר ודרכים אחרות^17,18, הקשור קשר הדוק להתרחשות והתפתחות יתר לחץ דם^19,20, לב וכלי דם²¹ ומחלות כלי דם במוח^22,23, השמנת יתר^24,25, סוכרת²⁶ ומחלות כרוניות אחרות.

לכן, המטרה הכוללת של מחקר זה הייתה לפתח שיטה יעילה ואמינה לחלץ EVs ממיקרוביוטת המעיים של חולדות רגישות למלח שניזונו מ-HSD ולחקור באופן שיטתי את התכונות הפיזיקליות, ההרכב והתפקודים שלהן. בשל המאפיינים של העלייה המשמעותית בלחץ הדם לאחר דיאטה עתירת מלח, נבחרו חולדות רגישות למלח וחשפו את השפעת HSD על חיידקי המעיים EV על ידי בניית שיטת מיצוי יעילה. השיטה התבססה על צנטריפוגה של שיפוע צפיפות ושילבה טכניקות זיהוי דינמיות שונות כגון זיהוי גודל חלקיקים, מדידת LPS/BCA, מיקרוסקופ אלקטרונים הולכה וניתוח פרוטאומי. הפרוטוקול נועד לחשוף את ההשפעות של HSD על מיקרוביוטת המעיים EV והמנגנונים שלה במחלות לב וכלי דם. עם היעילות הגבוהה, יכולת השחזור והיישום הרחב שלה, גישה זו לא רק מספקת כלי חשוב לחקר המנגנון של חיידקי המעיים EVs ביתר לחץ דם המושרה על ידי מלח, אלא גם מניחה את הבסיס התיאורטי לפיתוח אסטרטגיות התערבות במחלות המבוססות על EVs. באמצעות מחקר זה, אנו מקווים לפתוח אפיקים חדשים למניעה וטיפול במחלות לב וכלי דם, כגון יתר לחץ דם^27,28.

מחקר ניסיוני זה בבעלי חיים עומד בהנחיות האתיות הרלוונטיות ובתקנים הבינלאומיים. מחקרים הכוללים בעלי חיים אושרו על ידי ועדת רווחת חיות מעבדה ואתיקה של אוניברסיטת צ'נגדו לרפואה סינית (מוסד: אוניברסיטת צ'נגדו לרפואה סינית; מספר פרוטוקול: 2018-21).

1. הכנת בעלי חיים ומשטר תזונה

1. התאקלמות חולדות דאהל זכרות בנות 6 שבועות רגישות למלח, משקל גוף 180-200 גרם, על ידי גידול ב-50% ±-10% לחות; מחזור אור של 12 שעות / 12 שעות; 20.0 ±-2.0 מעלות צלזיוס למשך שבוע בתנאים ספציפיים ללא פתוגנים.
2. לאחר מכן, חלקו את החולדות באופן שווה לשתי קבוצות (n = 6). ספקו לכל קבוצה תזונה שונה שנמשכת 6 שבועות: דיאטת מלח רגילה (NSD) עם 0.5% נתרן כלורי ו-HSD עם 8% נתרן כלורי, שנמצא בשימוש נפוץ במחקרים שפורסמו 29,30,31. לעכברים הייתה גישה בלתי מוגבלת למזון ומים לאורך כל המחקר.

2. ניטור לחץ דם

הערה: פלתיסמוגרפיה של שרוול הזנב שימשה כשיטה לא פולשנית למדידת לחץ דם, ונעשה שימוש ברישום לחץ נפחי (VPR) כאשר לחץ הדם נמדד מנפח הדם של הזנב.

1. הניחו חולדות בנפרד בכלובים קטנים עם נסורת, מחוממים למשך 10 דקות בטמפרטורה של כ-37 מעלות צלזיוס והניחו בריסון מכרסמים מותאם אישית עם אף ודלת מתכווננים לכניסת בעלי חיים. הניחו חולדות על כרית חימום במצב נוטה כדי לשמור על טמפרטורת גופן על 37 מעלות צלזיוס.
2. חבר את חיישן ה-VPR לתחתית הזנב והגדר לפחות 10 מחזורי הסתגלות כדי לייצב את ה-BP²⁸.
   1. מלאו את השרוול המתנפח בשורש הזנב והניחו את החיישן הפלתיסמוגרפי (או החיישן הפוטואלקטרי) מתחת. יש לנפח לאט ללחץ מעל הלחץ הסיסטולי (בדרך כלל 200 מ"מ כספית) ולאחר מכן לשחרר לאט. המכשיר מזהה אוטומטית את ערך הלחץ של היעלמות גלי הדופק (לחץ דם סיסטולי) והתאוששות (לחץ דם דיאסטולי). מדוד 3-5 פעמים רצופות וקח את הערך הממוצע.
3. אמן את כל החולדות להתאים את נוהל הריסון ובצע מחקר זה במעבדה שקטה בסביבות השעה 9 בבוקר כדי למזער את ההשפעות של השונות הצירקדית.
4. מדדו לחץ דם סיסטולי (SBP) ולחץ דם דיאסטולי (DBP) כל יומיים לפני ההקרבה. הערכת לחץ עורקי ממוצע (MAP) מ-SBP ו-DBP
   MAP = (SBP + 2 DBP)/3

3. חילוץ רכבים חשמליים

1. איסוף דוגמאות
   1. טבלו צמר גפן סטרילי באלכוהול 75% והשתמשו בו כדי לעורר את פי הטבעת של החולדה. הגירוי נועד לקדם תנועתיות מעיים ולהרגיע את הסוגר האנאלי, ובכך לקדם את עשיית הצרכים. לאחר הוצאת הצואה, אספו אותם בעזרת מלקחיים סטריליים למיכלים סטריליים בגודל מתאים ואחסנו אותם מיד בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
2. הכנת מדגם
   1. בעזרת כף מעבירים 5 גרם צואה לצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל שנשקל מראש. הוסף 50 מ"ל של PBS נטול אנדוטוקסין 37 מעלות צלזיוס מחומם מראש (ריכוז דגימה מקסימלי 10%) לצינור וסובב למשך 30 דקות. מצננים את הצנטריפוגה המהירה ל-4 מעלות צלזיוס.
   2. צנטריפוגה ב-8,000 x גרם למשך 15 דקות לאחר הנחת דגימות באופן סימטרי כדי לאפשר לצנטריפוגה להתאזן. לאחר הצנטריפוגה, שאפו את הסופרנטנט והעבירו אותו לצינור צנטריפוגה סטרילי חדש.
   3. שוב צנטריפוגה ב 8,000 x גרם למשך 15 דקות. שאפו את הסופרנטנט והשתמשו בו לניתוח נוסף.
3. הכנת תמצית גולמית
   1. השתמש ביחידת פילטר סטרילית של 0.22 מיקרומטר. הנח את יחידת המסנן על קרח והחזק את משאבת הוואקום בחוזקה. העבירו את הסופרנטנט שהתקבל לראש המסנן. הפעל את משאבת הוואקום כדי לאסוף את הדגימות המסוננות.
   2. מעבירים את המסנן למסנן צנטריפוגלי (10 kDa, 15 מ"ל), צנטריפוגה ב-4 מעלות צלזיוס, 3,000 x גרם למשך 30 דקות, ומרכזים את הדגימה ל-1400 מיקרוליטר לפחות.
   3. אסוף את הדגימה המרוכזת ובמידת הצורך דלל אותה ל -1400 מיקרוליטר באמצעות PBS נטול אנדוטוקסינים מקורר מראש. שמור את הדגימה על קרח מיד לאחר הדילול.
      הערה: ניתן להשתמש בתמצית הגולמית באופן מיידי או לאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס למשך מספר חודשים.
4. הפרדת רכבים חשמליים
   1. הכן את מאגר השיפוע A ואת מאגר השיפוע B כמתואר להלן. הכן את המאגר יום מראש, מכיוון שלוקח מספר שעות עד שהתרכובת מתמוססת לחלוטין. ניתן לאחסן את המאגר המוכן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 6 חודשים.
      1. הכנת מאגר שיפוע A: ממיסים 0.25 M סוכרוז, 6 מ"מ EDTA ו-60 מ"מ טריס ב-800 מ"ל של מים נטולי אנדוטוקסין על ידי ערבוב מערבל מגנטי, כאשר ה-pH מותאם ל-7.4 באמצעות חומצה הידרוכלורית. יש לדלל ל-1 ליטר במים ללא אנדוטוקסין. השתמש במסנן בקבוק של 0.22 מיקרומטר כדי לסנן את המאגר.
      2. הכנת מאגר שיפוע B: ממיסים 0.25 M סוכרוז, 1 מ"מ EDTA ו-10 מ"מ טריס ב-800 מ"ל של מים נטולי אנדוטוקסין על ידי ערבוב מערבל מגנטי, עם pH מותאם ל-7.4 עם חומצה הידרוכלורית. מדולל ל-1 ליטר במים ללא אנדוטוקסין. השתמש במסנן עליון של בקבוק 0.22 מיקרומטר כדי לסנן את המאגר.
   2. מערבבים נפח אחד של מאגר שיפוע A ו-5 נפחים של מדיום שיפוע צפיפות (המדיום הוא תמיסת יודיקסנול של 60%) כדי להכין את תמיסת העבודה.
   3. הכנת תמיסת יודיקסנול (10%, 20%, 40%): להכנת תמיסת יודיקסנול של 10%, מערבבים תמיסת עבודה אחת יחידה ו-4 יחידות מאגר B; לתמיסת יודיקסנול של 20%, מערבבים תמיסת עבודה של 2 יחידות ומאגר B של 3 יחידות; לקבלת תמיסת יודיקסנול של 40%, מערבבים 4 יחידות תמיסת עבודה ומאגר יחידה אחת B. מכינים כל תמיסה טרייה ומאחסנים על קרח.
      הערה: יש להכין פתרונות עבודה חדשים לכל ניסוי, וניתן להכין נפח נוסף של 10% של פתרונות כדי להסביר את שגיאת הניסוי.
   4. מערבבים את התמיסה שהוכנה בשלב 3.3.3 עם 7 מ"ל של מדיום שיפוע צפיפות ליצירת תמיסת יודיקסנול של 50%.
   5. כדי להכין שיפוע צפיפות, הוסף תמיסת טריפאן כחולה לתמיסה של 40% ותמיסת יודיקסנול של 10% (wt/vol) כדי לספק מתאר ברור בין השכבות המובהקות.
   6. העבירו 8 מ"ל של תמיסת יודיקסנול של 50% לתחתית צינור הצנטריפוגה מפוליפרופילן בעל דופן דקה. הטה את הצינור ל-70° והעביר 8 מ"ל של תמיסת יודיקסנול של 40% למשטח הנוזל. הוסף 8 מ"ל של תמיסת יודיקסנול של 20%, לאחר מכן 7 מ"ל של תמיסת יודיקסנול של 10%, ולבסוף 2 מ"ל של PBS ללא אנדוטוקסין.
      הערה: הכנת שיפוע צפיפות דורשת תרגול. לאיכות שיפוע הצפיפות יש השפעה רבה על תוצאות הניסוי. אל תניח את הצינור זקוף בין שלבים שונים בתהליך ההוספה, מכיוון שהדבר משפיע לרעה על איכות שיפוע הצפיפות.
   7. מצננים מראש את הצנטריפוגה ומניחים את שיפוע הצפיפות המוכן לתוך האולטרה-צנטריפוגה. פרמטרי קלט להתחלה, ערכי פרמטרים: 100,000 x גרם, 20 שעות, 10 מעלות צלזיוס.
   8. להפרדת צפיפות שיפוע ידנית, משוך לאט 2 מ"ל מהתמיסה ממרכז פני המערכת המכילה בסך הכל 34 מ"ל נוזל. כל 2 מ"ל הוא שיפוע, ובכך מחלק את פתרון שיפוע הצפיפות ל-17 שיפועים.
   9. העבירו את שברי הצפיפות לצינור דגימה סטרילי באמצעות פיפטה והניחו אותם מיד על קרח. מהדק את צינור הצנטריפוגה בין האגודל לאצבע המורה כדי להבטיח שהוא יישאר זקוף.
5. שחזור רכבים חשמליים
   1. באמצעות מערכת חילוץ EVs אוטומטית לחלוטין המפעילה תנודת לחץ שלילי באמצעות מערכת תנודה אולטראסונית עם צימוד כפול על שבב האולטרה-סינון, הסר זיהומי חומצות גרעין וחלבונים בדגימה דרך הננו-נקבוביות ויירוט EVs, מה שמוביל להעשרה וטיהור של EVs.
      1. הסר את המסנן בשלב 3.4.7 והוסף אותו לשבב האולטרה-סינון.
      2. הפעל את המכשיר בהתאם להוראות המכשיר ואסוף את המסנן המסונן, כלומר התמיסה המועשרת באקסוזום. התהליך העיקרי מוצג באיור 1.

4. זיהוי רכבים חשמליים

1. זיהוי גודל חלקיקים וריכוז
   1. הערך את התפלגות הגודל ופוטנציאל הזטה באמצעות מונה ננוקולומטר מבוסס חישת דופק התנגדות (RPS). בחר שבבי ננו-נקבוביות עם טווח מדידה של 60-200 ננומטר לניסוי זה. יתר על כן, הערך את התפלגות גודל החלקיקים ופוטנציאל הזטה של ה-EVs באמצעות מונה ננו-ספריות.
      1. קח כמות מתאימה של תמיסת EVs ודלל אותה (1/10, 1/100, 1/1000, 1/10000).
      2. דילולים שונים של פתרונות EVs הונחו על המכשיר לבדיקה.
      3. מכפיל הדילול עם יציבות טובה יותר נבחר ונבדק שוב כדי לקבל נתונים מדויקים יותר.
2. בדיקת LPS ו-BCA
   1. בדיקת BCA: ליז EVs באמצעות מאגר RIPA ולאחר מכן להפריד את החלבונים. קבע את תכולת החלבון של ה-EVs באמצעות ערכת קביעת ריכוז החלבון BCA.
   2. בדיקת LPS: באמצעות ערכת זיהוי האנדוטוקסין, הוסף דגימות, גלאי אנדוטוקסין וכרומוגני בהתאם לשלבי הערכה. מדוד את הספיגה ב-545 ננומטר וחשב את ביטוי ה-LPS של שלפוחיות חיצוניות לפי העקומה הסטנדרטית.
3. הערכת TEM: לצביעה שלילית וניתוח TEM, יש למרוח דגימות על סורג נחושת זוהר המצופה בסרט פחמן רציף ולצבוע בפורמט אורניל של 0.75%. עבור cryo-EM, ספגו את הרכבים החשמליים לרשת פחמן EM של 300 רשת עם משטח הידרופילי והקפיאו בחנקן נוזלי. התבונן ונתח את הרשתות באמצעות Cryo-TEM והקלט את התמונות ב-22,000 הגדלות³².
4. אפיון חלבונים: Lyse EVs באמצעות מאגר RIPA ולאחר מכן מפרידים את החלבונים. קבע את ריכוז החלבון באמצעות ערכת בדיקת החלבון BCA, הפרד כמויות שוות של חלבון מכל דגימה על ידי SDS-PAGE, וצבוע בתמיסת צבע כחול של Coomassie לאחר אלקטרופורזה כדי להמחיש את פרופילי החלבון^33,34.
5. ריצוף וניתוח S: חלץ DNA גנומי מדגימות הצואה באמצעות ערכת מיצוי DNA צואתית. להעריך את שלמות וריכוז ה- DNA על ידי אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז וספקטרופוטומטר. הגבירו את אזור V3 - V4 של הגן 16S rRNA עם פריימרים אוניברסליים, טהרו את תוצרי ה-PCR, כמתו אותם ורצפו אותם על פלטפורמת Illumina. בצע ניתוח נתונים באמצעות צינור QIIME2³⁵.
   1. סווג וריאנטים של רצף אמפליקון (ASV) באמצעות DADA2 והתאם מול מסד הנתונים של Silva באמצעות אלגוריתם VSEARCH. השתמש בניתוח α-מגוון כדי להעריך את העושר והמגוון של המינים בתוך המדגמים, בעיקר באמצעות מדדים כגון מדד שאנון ומדד Chao1. ניתוח β-Diversity משווה את הרכב הקהילה המיקרוביאלית בין דגימות ובדרך כלל מומחש על ידי ניתוח קואורדינטות ראשי (PCoA). השתמש בשיטות ניתוח דיפרנציאליות, כגון גודל אפקט ניתוח מבחין ליניארי (LEfSe) וניתוח עלילת הר געש, כדי לזהות טקסונים מיקרוביאליים עם תנאים שונים באופן משמעותי או בין קבוצות.

ריכוזי EVs נקבעו בשברים שונים (איור 2A). תוצאות הניסוי הראו שריכוז ה-EVs הציג דפוס התפלגות נורמלי טיפוסי בסדרה של פתרונות שיפוע צפיפות (איור 2B). באופן ספציפי, בשבר 9, ריכוז הרכבים החשמליים הגיע לנקודה הגבוהה ביותר שלו (3.85 x 10⁹), מה שמצביע על כך שחלק ההפצה העיקרי של רכבים חשמליים עשוי להיות 9³⁶.

לקביעת תכולת החלבון, ערכות BCA שימשו להערכת תכולת החלבון בשברים שונים (איור 2C). בשיטה זו, תכולת החלבון בשבר 9 הייתה 0.417 מיקרוגרם/מיקרוליטר, מה שמדגים עוד יותר את התפלגות ה-EVs. מכיוון ש-LPS הוא מרכיב ייחודי של חיידקים גראם-שליליים ^37,38, ערכות זיהוי אנדוטוקסין שימשו גם לקביעת הביטוי של LPS (איור 2D) על מנת להעריך את התפלגות ה-EVs בשברים שונים. תוצאות הניסוי הראו כי בשברים 9 ו-10, ביטוי LPS היה גבוה משמעותית מהשברים האחרים (ספיגה עבור שבר 9 = 0.8086, עבור שבר 10 = 0.8515), והתפלגותו הראתה התפלגות נורמלית, שהוכיחה כי ה-EVs מפוזרים בעיקר בשבר 9. כמויות גדולות יחסית של חלבון בשבר 9 נצפו גם באלקטרופורזה של ג'ל SDS-PAGE של EVs שבודדו משברים שונים (איור 2E).

מחקר זה בדק רכבים חשמליים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים הולכה (TEM; איור 2F). באמצעות הדמיה ברזולוציה גבוהה על ידי TEM, הוא הצליח לדמיין בבירור את המבנה המורפולוגי של EVs, הכולל מבנים דמויי ממברנה עגולים, שהוא חיוני להבנת הביולוגיה של EVs.

שינויים בלחץ הדם נקבעו בקבוצות NSD ו-HSD לאחר חודשיים של גידול ב-NSD ו-HSD של החולדות. אנו יכולים לראות ש-SBP (איור 3A), DBP (איור 3B) ו-MBP (איור 3C) גדלו באופן משמעותי בקבוצת HSD, מה שמצביע על כך שמודל יתר לחץ הדם של מחקר זה נבנה בהצלחה.

במחקר הזה, ריכוז ה-EVs זוהה בקבוצות שונות (איור 3D), והתוצאות הראו שריכוז ה-EVs בקבוצת ה-HSD היה גבוה משמעותית מזה של חולדות בקבוצת ה-NSD. זה מצביע על כך ש-HSD משפיע על רמת ה-EVs, אולי עקב שינויים בהרכב המיקרוביוטה של המעיים שממנה מקורם של ה-EVs.

לאחר מכן נמדד גודל החלקיקים של הרכבים החשמליים במחקר זה. תוצאות המדידה מצביעות על כך שגודל החלקיקים של ה-EVs הוא בעיקר בסביבות 60 ננומטר (איור 3E), וגודל החלקיקים של קבוצת HSD נמוך מעט מזה של קבוצת ה-NSD. הנתונים הנמדדים מספקים מידע חשוב להערכת התפלגות הגודל וההומוגניות של הרכבים החשמליים, מה שמקל על תכנון הניסוי ופיתוח היישומים שלאחר מכן.

לאחר מכן, במחקר זה, נבדקה כמות ביטוי ה-LPS של EVs בקבוצת HSD ובקבוצת NSD (איור 3F). התוצאות הראו כי הביטוי של LPS על ידי EVs בקבוצת HSD היה גם גבוה משמעותית מזה בקבוצת NSD. ייתכן שהסיבה לכך היא העלייה בחיידקים גראם-שליליים במיקרוביוטת המעיים שמקורה באקסובסיקל או מהריכוז הגבוה יותר של EVs בקבוצת HSD מאשר בקבוצת NSD.

כדי לתמוך עוד יותר בהבדלים בין EVs בקבוצות HSD ו-NSD, מחקר זה חקר את מיקרוביוטת המעיים הנגזרת וערך ריצוף 16S rRNA של דגימות EVs מקבוצות NSD ו-HSD כדי להבהיר עוד יותר את ההשפעה של HSD על EVs במיקרוביוטת המעיים בעכברים.

ניתוח α-Diversity הראה כי המגוון של מיקרוביוטת המעיים הצטמצם באופן משמעותי בקבוצת HSD, כאשר מדדי שאנון ו-ACE ירדו (איור 4A). β -ניתוח גיוון, המבוסס על PCoA (איור 4B), הבחין בין הפנוטיפים המיקרוביאליים בין הקבוצות ברמת ASV. התערבות המלח הגבוהה הפכה חלקית את השינויים הפנוטיפיים במיקרופלורת המעי ומצאה הבדלים משמעותיים בהרכב מיקרוביוטת המעי שמקורה בשלפוחית החיצונית בין הקבוצות (p = 0.001).

לאחר סינון חיידקים בשפע נמוך וסטנדרטיזציה של הנתונים, הערות טקסונומיות זיהו טווחים שונים של קהילות מיקרוביאליות בדגימות. מיקרוביוטת המעיים שמקורה באקסובסיקל כללה בעיקר פרוטאובקטריה (93.19%), Firmicutes (4.57%) ובקטרואידוטה (1.19%; איור 4C). קבוצת HSD הגדילה משמעותית את שפע השלפוחיות החיצוניות של Firmicutes (איור 4D). ברמת הסוג, התוצאות הראו שסוגים כמו Nevskia ו-Acinetobacter היו נפוצים יותר בקבוצת NSD, בעוד ש-Delftia, Burkholderia_Ca ו-Clostridium_sen היו נפוצים יותר בקבוצת HSD (איור 4E). נוסף על כך, המחקר הזה גם השתמש במפות חום כדי להראות את ההבדלים במיקרוביוטה של המעיים בין קבוצת HSD לקבוצת NSD (איור 4F). לאחר ההתערבות העשירה במלח, השפע של חלק מהחיידקים, Delftia ו-Burkholderia_Ca, גדל באופן משמעותי, ו-Nevskia ו-Acinetobacter פחתו באופן משמעותי (איור 4G). לסיכום, ההתערבות הגבוהה במלח שינתה באופן משמעותי את ההבדל בייצור EVs שמקורם במיקרופלורה במעי, בעיקר מכיוון שהיא שינתה את התפלגות החיידקים ההורים שלהם, והמאפיינים העיקריים היו ירידה במגוון, שינויים במבנה שיווי המשקל ושינויים בשפע החיידקים השונים.

איור 1: מיצוי ואפיון של שלפוחיות חיצוניות שמקורן בחיידקי מעיים. (A) תרשים זרימה של מיצוי שלפוחית חיצונית. (ב) אפיון השלפוחיות החיצוניות. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: אפיון בסיסי של ה-EVs וניתוח שיפוע הצפיפות המקומית. (A) מדידות ריכוז חוץ-שלפוחית וגודל חלקיקים עם שיפועי צפיפות שונים (nm; חלקיקים/מ"ל). (B) השוואה של ריכוזי השלפוחית החיצונית של התמיסה לפי שיפוע צפיפות 3 - 16 (חלקיקים/מ"ל). (C) קביעת תכולת חלבון התמיסה בשיפוע צפיפות 6-12 על ידי ערכת BCA (מיקרוגרם/מ"ל). (D) מדידת ביטוי LPS תמיסה על ידי שיפוע צפיפות 7-11 עם ערכת זיהוי אנדוטוקסין (Abs). (E) תמיסות עם שיפוע צפיפות של 6 - 12 עברו אלקטרופורזה של ג'ל SDS-PAGE ונצבעו בכחול מבריק של Coomassie. (F) TEM: סרגל קנה המידה הוא 100 ננומטר; שלפוחיות בודדות מוצגות בתמונה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: ניתוח השינויים בלחץ הדם וב-EVs תחת דיאטות שונות. (א) SBP; (ב) DBP; (ג) MBP; (ד) השוואה של ריכוזי שלפוחית חיצונית בקבוצות HSD ו-NSD; (E) השוואה של גודל השלפוחית החיצונית בקבוצות HSD ו-NSD. (F) LPS בדגימות NSD ו-HSD שנקבעו על ידי ספקטרופוטומטריה. *p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, ו-NS פירושו אין מובהקות, מבחן t. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: ניתוח מבחן ה-rRNA של 16 שניות תחת הדיאטות השונות. (A) ניתוח α-diversity; (ב) ניתוח קואורדינטות עיקריות; (C) שפע המיקרוביוטה של המעיים ברמת הפילה; (D) שינויים בחיידקים ברמת פילום; (ה) תוצאת LEfSe; (F) ניתוח מפת החום של האשכול המבוסס על סוגי חיידקים דיפרנציאליים; (G) שינויים בחיידקים ברמת הסוג. *p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, ו-NS פירושו אין מובהקות, מבחן t. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

במחקר זה, התמקדנו במיקרוביוטת המעיים EVs בחולדות רגישות למלח ב-HSD והשגנו סדרה של הישגים מרכזיים. ראשית, שיטת מיצוי יעילה המבוססת על צנטריפוגה של שיפוע צפיפות נבנתה בהצלחה כדי לבודד EVs ממיקרוביוטת מעיים של חולדות רגישה למלח ב-HSD, ורוב הרכיבים שאינם EV בודדו באמצעות מניפולציה ניסויית קפדנית וסטנדרטית של בעלי חיים ותהליך עיבוד דגימות. שיטת מיצוי הרכבים החשמליים של צנטריפוגת שיפוע צפיפות יעילה ביותר וניתנת לשחזור, טובה יותר משיטת האולטרה-צנטריפוגה הקונבנציונלית, ויכולה לשמור טוב יותר על השלמות והפונקציונליות של רכבים חשמליים, מה שמבטיח את איכות הדגימה והיתכנות המחקר.

שנית, רכבים חשמליים זוהו באופן מקיף באמצעות טכנולוגיות דינמיות שונות: גודל חלקיקים וזיהוי ריכוז מצביעים על כך שלרכבים חשמליים יש התפלגות גודל ספציפית; מדידות LPS ו-BCA מכמתות את תכולת החלבון וביטוי ה-LPS של EVs; TEM מראה בבירור את המבנה המורפולוגי של EVs; ומאפייני החלבון מגדירים את ספקטרום החלבונים. תוצאות זיהוי אלה חושפות באופן מקיף את התכונות הפיזיקליות והביוכימיות של רכבים חשמליים, ומספקות תמיכה אמינה בנתונים למחקרים הבאים.

בנוסף, טכנולוגיית ריצוף גנים 16S rRNA המשתמשת בניתוח מעמיק של ההבדלים בין המקור וההרכב של EVs נורמליים ו-HSD, וניתוח גיוון α וניתוח מגוון β הראו כי צריכת מלח גבוהה משפיעה באופן משמעותי על המאפיינים הגנטיים של EVs מיקרוביאליים במעיים, כולל מבנה הקהילה המיקרוביאלית, עושר המינים והמגוון, כדי לפתור באופן מקיף יותר את ההשפעות של תזונה עתירת מלח על חיידקי המעיים. מספק רמות מרובות של ראיות למחקרים מכניסטיים.

למרות שלשיטה זו יש כמה יתרונות על פני שיטת הצנטריפוגה הקונבנציונלית במהירות יתר מבחינת התאוששות ושלמות אקסוזומים, עדיין ישנן כמה מגבלות, כגון ביקוש גבוה לדגימה וקושי להבחין בין המארח למקור המיקרופלורה. עם זאת, בהשוואה לשיטות הקיימות, לצנטריפוגה בשיפוע צפיפות יש יתרונות ייחודיים בשמירה על השלמות התפקודית של אקסוזומים, מה שמספק תמיכה טכנית אמינה לחקירה נוספת של המנגנון שבאמצעותו דיאטה עתירת מלח משפיעה על לחץ הדם של המארח דרך פלורת המעיים. יתר על כן, עבור ריבוד השיפוע הלא ברור שנתקלנו בו במהלך הניסוי, שיפרנו גם על ידי הארכת זמן הצנטריפוגה או החלפת הרוטור בעל הביצועים הגבוהים יותר.

בעתיד, נוכל להמשיך ולחקור את המנגנון של חיידקי המעיים EVs ביתר לחץ דם הנגרם על ידי תזונה עתירת מלח, במיוחד האינטראקציה שלו עם מערכת החיסון, כגון תאי T פרו-דלקתיים^39,40; או להשתמש במוצרים שמקורם בצמחים כדי להתערב במיקרוביוטה של המעיים^41,42, להתערב עוד יותר במחלות ולחקור את תפקידם בוויסות חילוף החומרים של המארח והתגובה החיסונית.

לסיכום, מחקר זה לא רק מספק כלי חשוב לחקר המנגנון של יתר לחץ דם המושרה על ידי מלח של מיקרוביוטת המעיים, באמצעות מודל החולדות הרגישות למלח, מעמיק את ההבנה של הקשר בין HSD, מיקרוביוטת מעיים ו-EVs, וגם פותח דרך חדשה למניעה וטיפול במחלות לב וכלי דם כגון יתר לחץ דם, מספק נקודת מבט ייחודית לחקר האינטראקציה בין דיאטה-חיידק-מארח.

המחברים מצהירים כי לא ידוע על אינטרסים פיננסיים מתחרים או קשרים אישיים שיכולים היו להשפיע על העבודה המדווחת במאמר זה.

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82205240), הקרן למדעי הטבע של מחוז סצ'ואן (2025ZNSFSC1836), והפרויקט הבסיסי הקליני של בית החולים האורתופדי המחוזי של סצ'ואן (PY202414).