Trennung und differentielle Charakterisierung von mikrobiellen extrazellulären Vesikeln im Darm bei salzempfindlichen Ratten unter salzreichen Ernährungsbedingungen

Das Protokoll beschreibt die Isolierung von mikrobiellen EVs im Darm von salzempfindlichen Ratten, die mit HSD gefüttert wurden, mittels Dichtegradientenzentrifugation. EVs wurden durch Nanopartikel-Tracking, TEM, LPS/BCA-Assays und 16S rRNA-Sequenzierung charakterisiert, um die Größe, Morphologie, Zusammensetzung und Herkunft der Mikrobiota zu analysieren.

Eine hohe Salzaufnahme ist ein Hauptrisikofaktor für Bluthochdruck, und der zugrunde liegende Mechanismus kann eng mit extrazellulären Vesikeln (EVs) verbunden sein, die von der Darmmikrobiota sezerniert werden. Diese EVs, die von der Darmmikrobiota produziert werden, tragen verschiedene bioaktive Komponenten, die eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung von Bluthochdruck spielen können, der durch eine salzreiche Ernährung (HSD) induziert wird. Um diesen Mechanismus zu untersuchen, haben wir eine effiziente Extraktionsmethode entwickelt, die auf Dichtegradientenzentrifugation basiert, um EVs aus der Darmmikrobiota von salzempfindlichen Ratten zu isolieren, die mit einem HSD gefüttert wurden. Durch Partikelgrößenanalyse, Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) und Lipopolysaccharid (LPS)-Detektion identifizierten wir die Gradientenverteilung von EVs der Darmmikrobiota und erreichten eine präzise Extraktion. Darüber hinaus wurde die 16S rRNA-Gensequenzierung eingesetzt, um den Ursprung und die Unterschiede in der Zusammensetzung von EVs zwischen der Normal- und der HSD-Gruppe zu analysieren und den Einfluss einer hohen Salzaufnahme auf die genetischen Eigenschaften von EVs der Darmmikrobiota aufzuzeigen. Diese Studie liefert wertvolle Werkzeuge und wissenschaftliche Einblicke in die Mechanismen der Darmmikrobiota, die der salzinduzierten Hypertonie zugrunde liegen, und bietet neue Perspektiven für die Prävention und Behandlung verwandter Krankheiten.

Die Darmmikrobiota, auch bekannt als Darmmikrobiota Mikroflora oder Darmmikroökologie, ist ein Komplex aus Zehntausenden von Mikroorganismen, die sich im biologischen Magen-Darm-Trakt befinden und eine entscheidende Rolle bei der Erhaltung der menschlichen Gesundheit spielen¹. In den letzten Jahren wurde mit weiteren Forschungen festgestellt, dass die Darmmikrobiota extrazelluläre Vesikel (EVs) produzieren ^kann2. EVs sind kleine Vesikel, die von Zellen freigesetzt werden und verschiedene Moleküle in der Zelle tragen, wie Proteine, Nukleinsäuren und Lipide ^3,4. Sie können mit anderen Mikroben⁵, Darmepithelzellen und sogar entfernten Geweben und Organen⁶ interagieren und so die Gesundheit des menschlichen Körpers beeinträchtigen ^7,8. Es besteht eine enge Verbindung zwischen den von diesen Darmmikrobiota produzierten Elektrofahrzeugen und der Ernährung⁹.

EVs, die von der Darmmikrobiota produziert werden, können wichtige Wirkstoffe sein, durch die eine salzreiche Ernährung (HSD) die Gesundheit des Körpers beeinflusst. HSD stört nicht nur direkt das Gleichgewicht der Darmmikrobiota¹⁰, was zu einer signifikanten Verringerung der Anzahl nützlicher Bakterien (wie Lactobacillus)¹¹ führt, sondern fördert auch die Vermehrung schädlicher Bakterien (wie Bacteroides usw.)¹². Dieses Ungleichgewicht verringert die Darmbarrierefunktion und erhöht das Risiko von Darmentzündungen. Darüber hinaus beeinflusst eine HSD auch das Säure-Basen-Gleichgewicht und die Nährstoffaufnahme im Darm, indem sie die Stoffwechselaktivitäten¹³ der Darmmikrobiota verändert, wie z. B. die Verringerung der Produktion von kurzkettigen Fettsäuren ^14,15 mit mehreren physiologischen Funktionen.

Diese Veränderungen wirken sich nicht nur auf die Darmgesundheit aus, sondern können auch indirekt die Produktion und Freisetzung von Elektrofahrzeugen regulieren und die Zusammensetzung und Funktion des Elektrofahrzeugs verändern. Die salzreiche Umgebung kann die normalen physiologischen Funktionen von Darmzellen beeinträchtigen, einschließlich der Freisetzung und des Transports von EVs, wodurch die Rolle von EVs bei der interzellulären Informationsübertragung und Immunregulation gestört wird. Gleichzeitig kann eine Darmentzündung eine Vielzahl von EVs mit besonderen Funktionen^{fördern 16} und sich über die Darm-Organ-Achse und andere Wege auf den gesamten Körper ausbreiten^17,18, was eng mit dem Auftreten und der Entwicklung von Bluthochdruck ^19,20, Herz-Kreislauf-Erkrankungen²¹ und zerebrovaskulären Erkrankungen^22,23, Fettleibigkeit^24,25 und Diabetes²⁶ zusammenhängt und andere chronische Krankheiten.

Daher bestand das übergeordnete Ziel dieser Studie darin, eine effiziente und zuverlässige Methode zur Extraktion von EVs aus der Darmmikrobiota von salzempfindlichen Ratten, die mit einem HSD gefüttert wurden, zu entwickeln und ihre physikalischen Eigenschaften, Zusammensetzung und Funktionen systematisch zu untersuchen. Aufgrund der Merkmale des signifikanten Anstiegs des Blutdrucks nach einer salzreichen Diät wurden salzempfindliche Ratten ausgewählt und zeigten die Wirkung von HSD auf die Darmmikrobiota EV durch die Konstruktion einer effizienten Extraktionsmethode. Die Methode basierte auf der Dichtegradientenzentrifugation und kombinierte verschiedene dynamische Identifikationstechniken wie Partikelgrößenerkennung, LPS/BCA-Messung, Transmissionselektronenmikroskopie und Proteomanalyse. Das Protokoll zielt darauf ab, die Auswirkungen von HSD auf die Darmmikrobiota EV und ihre Mechanismen bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen aufzudecken. Mit seiner hohen Effizienz, Reproduzierbarkeit und breiten Anwendbarkeit bietet dieser Ansatz nicht nur ein wichtiges Werkzeug zur Erforschung des Mechanismus von Darmmikrobiota-EVs bei salzinduzierter Hypertonie, sondern legt auch die theoretische Grundlage für die Entwicklung von Krankheitsinterventionsstrategien auf der Grundlage von EVs. Wir hoffen, durch diese Studie neue Wege für die Prävention und Behandlung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen wie Bluthochdruck zu eröffnen^27,28.

Diese tierexperimentelle Studie entspricht den einschlägigen ethischen Richtlinien und internationalen Standards. Studien mit Tieren wurden von der Labortierschutz- und Ethikkommission der Chengdu University of Chinese Medicine (Institution: Chengdu University of Chinese Medicine; Protokollnummer: 2018-21) genehmigt.

1. Vorbereitung der Tiere und Diät

1. Akklimatisierung von 6 Wochen alten männlichen männlichen Dahl-Ratten mit einem Körpergewicht von 180-200 g durch Aufzucht bei 50 % ± 10 % Luftfeuchtigkeit; 12 h / 12 h Lichtzyklus; 20,0 ± 2,0 °C für 1 Woche unter spezifischen erregerfreien Bedingungen.
2. Anschließend teilen Sie die Ratten gleichmäßig in zwei Gruppen auf (n = 6). Geben Sie jeder Gruppe eine andere Diät, die 6 Wochen lang anhält: eine normale Salzdiät (NSD) mit 0,5 % Natriumchlorid und eine HSD mit 8 % Natriumchlorid, die in veröffentlichten Studien häufig verwendet wird 29,30,31. Die Mäuse hatten während der gesamten Studie unbegrenzten Zugang zu Futter und Wasser.

2. Überwachung des Blutdrucks

HINWEIS: Die Plethysmographie der Schwanzmanschette wurde als nicht-invasive Methode zur Blutdruckmessung verwendet, und die volumetrische Druckaufzeichnung (VPR) wurde verwendet, wenn der Blutdruck anhand des Blutvolumens des Schwanzes gemessen wurde.

1. Setzen Sie Ratten einzeln in kleine Käfige mit Sägemehl, die 10 Minuten lang bei ca. 37 °C erhitzt werden, und setzen Sie sie in eine speziell angefertigte Nagetiersicherung mit verstellbarer Nase und Tür für den Eintritt der Tiere. Legen Sie die Ratten in Bauchlage auf ein Heizkissen, um ihre Körpertemperatur auf 37 °C zu halten.
2. Schließen Sie den VPR-Sensor an der Unterseite des Hecks an und stellen Sie mindestens 10 Anpassungszyklen ein, um den BP²⁸ zu stabilisieren.
   1. Füllen Sie die aufblasbare Manschette an der Schwanzwurzel und platzieren Sie den plethysmographischen Sensor (oder optoelektronischen Sensor) darunter. Langsam auf über den systolischen Druck (normalerweise 200 mmHg) aufblasen und dann langsam loslassen. Das Instrument erkennt automatisch den Druckwert des Verschwindens der Pulswelle (systolischer Blutdruck) und der Genesung (diastolischer Blutdruck). Messen Sie 3-5 Mal hintereinander und nehmen Sie den Durchschnittswert.
3. Trainieren Sie alle Ratten, sich an das Fixierungsverfahren anzupassen, und führen Sie diese Studie in einem ruhigen Labor gegen 9 Uhr morgens durch, um die Auswirkungen der zirkadianen Variation zu minimieren.
4. Messen Sie den systolischen Blutdruck (SBP) und den diastolischen Blutdruck (DBP) jeden zweiten Tag vor der Opferung. Schätzung des mittleren arteriellen Drucks (MAP) aus SBP und DBP
   MAP = (SBP + 2 DBP)/3

3. Extraktion von Elektrofahrzeugen

1. Musterkollektion
   1. Tauchen Sie ein steriles Wattestäbchen in 75%igen Alkohol und verwenden Sie es, um den Anus der Ratte zu stimulieren. Die Stimulation sollte die Darmperistaltik fördern und den Analschließmuskel entspannen, wodurch der Stuhlgang gefördert wird. Nachdem der Kot ausgestoßen wurde, sammeln Sie ihn mit einer sterilen Pinzette in sterilen Behältern geeigneter Größe und lagern Sie ihn sofort bei -80 °C.
2. Probenvorbereitung
   1. Mit einem Löffel 5 g Kot in ein vorgewogenes 50-ml-Zentrifugenröhrchen geben. Geben Sie 50 mL vorgewärmtes 37 °C endotoxinfreies PBS (maximale Probenkonzentration 10 %) in das Röhrchen und drehen Sie es 30 Minuten lang. Kühlen Sie die Hochgeschwindigkeitszentrifuge auf 4 °C ab.
   2. Zentrifugieren Sie 15 Minuten lang bei 8.000 x g , nachdem die Proben symmetrisch platziert wurden, damit die Zentrifuge sich äquilibrieren kann. Nach der Zentrifugation wird der Überstand abgesaugt und in ein neues steriles Zentrifugenröhrchen überführt.
   3. Erneut bei 8.000 x g für 15 min zentrifugieren. Aspirieren Sie den Überstand und verwenden Sie ihn für die weitere Analyse.
3. Zubereitung von Rohextrakten
   1. Verwenden Sie eine sterile 0,22 μm Filtereinheit. Stellen Sie die Filtereinheit auf Eis und halten Sie die Vakuumpumpe fest. Den erhaltenen Überstand an die Oberseite des Filters übertragen. Schalten Sie die Vakuumpumpe ein, um die gefilterten Proben zu sammeln.
   2. Das Filtrat in einen Zentrifugalfilter (10 kDa, 15 mL) überführen, 30 min lang bei 4 °C, 3.000 x g zentrifugieren und die Probe auf mindestens 1400 μl konzentrieren.
   3. Entnehmen Sie die konzentrierte Probe und verdünnen Sie sie bei Bedarf mit vorgekühltem endotoxinfreiem PBS auf 1400 μl. Bewahren Sie die Probe unmittelbar nach der Verdünnung auf Eis auf.
      HINWEIS: Der Rohextrakt kann sofort verwendet oder mehrere Monate bei -80 °C gelagert werden.
4. Trennung von Elektrofahrzeugen
   1. Bereiten Sie den Gradientenpuffer A und den Gradientenpuffer B wie unten beschrieben vor. Bereiten Sie den Puffer einen Tag im Voraus vor, da es mehrere Stunden dauert, bis sich die Verbindung vollständig aufgelöst hat. Der vorbereitete Puffer kann bei 4 °C 6 Monate gelagert werden.
      1. Herstellung von Gradientenpuffer A: 0,25 M Saccharose, 6 mM EDTA und 60 mM Tris in 800 mL endotoxinfreiem Wasser durch magnetisches Mischerrühren auflösen, wobei der pH-Wert mit Salzsäure auf 7,4 eingestellt wird. Mit endotoxinfreiem Wasser auf 1 l verdünnen. Verwenden Sie einen 0,22-μm-Filter mit Flaschenaufsatz, um den Puffer zu filtern.
      2. Herstellung von Gradientenpuffer B: 0,25 M Saccharose, 1 mM EDTA und 10 mM Tris in 800 mL endotoxinfreiem Wasser durch magnetisches Mischerrühren lösen, wobei der pH-Wert mit Salzsäure auf 7,4 eingestellt wird. Verdünnt auf 1 L mit endotoxinfreiem Wasser. Verwenden Sie einen 0,22-μm-Flaschenaufsatzfilter, um den Puffer zu filtern.
   2. Mischen Sie 1 Volumen Gradientenpuffer A und 5 Volumen Dichtegradientenmedium (das Medium besteht aus 60%iger Iodixanollösung), um die Arbeitslösung herzustellen.
   3. Herstellung von Iodixanollösung (10%, 20%, 40%): Zur Herstellung einer 10%igen Iodixanollösung mischen Sie 1 Einheit Arbeitslösung und 4 Einheiten Puffer B; für 20%ige Iodixanollösung 2 Einheiten Arbeitslösung und 3 Einheiten Puffer B mischen; Für 40% ige Iodixanollösung mischen Sie 4 Einheiten Arbeitslösung und 1 Einheit Puffer B. Bereiten Sie jede Lösung frisch vor und lagern Sie sie auf Eis.
      HINWEIS: Für jedes Experiment sollten frische Arbeitslösungen hergestellt werden, und es können zusätzliche 10 % der Lösungen hergestellt werden, um den experimentellen Fehler zu berücksichtigen.
   4. Die in Schritt 3.3.3 hergestellte Lösung wird mit 7 ml Dichtegradientenmedium zu einer 50%igen Iodixanollösung vermischt.
   5. Um einen Dichtegradienten herzustellen, fügen Sie Trypanblaulösung zu 40%iger Lösung und 10% (wt/vol) Iodixanollösung hinzu, um einen klaren Umriss zwischen den verschiedenen Schichten zu schaffen.
   6. Übertragen Sie 8 ml 50%ige Iodixanollösung auf den Boden des dünnwandigen Polypropylen-Zentrifugenröhrchens. Kippen Sie das Röhrchen um 70° und geben Sie 8 ml 40%ige Iodixanollösung auf die Flüssigkeitsoberfläche. Fügen Sie 8 ml 20%ige Iodixanollösung, dann 7 ml 10%ige Iodixanollösung und schließlich 2 ml endotoxinfreies PBS hinzu.
      HINWEIS: Das Vorbereiten eines Dichtegradienten erfordert Übung. Die Qualität des Dichtegradienten hat einen großen Einfluss auf die experimentellen Ergebnisse. Stellen Sie das Rohr nicht aufrecht zwischen verschiedenen Schritten des Zugabeprozesses, da sich dies negativ auf die Qualität des Dichtegradienten auswirkt.
   7. Kühlen Sie die Zentrifuge vorher vor und geben Sie den vorbereiteten Dichtegradienten in die Ultrazentrifuge. Eingabeparameter zum Start, Parameterwerte: 100.000 x g, 20 h, 10 °C.
   8. Für die manuelle Gradientendichtetrennung ziehen Sie langsam 2 mL der Lösung aus der Mitte der Oberfläche des Systems, die insgesamt 34 mL Flüssigkeit enthält. Jeder 2 ml ist ein Gradient, wodurch die Lösung des Dichtegradienten in 17 Gradienten unterteilt wird.
   9. Übertragen Sie die Dichtefraktionen mit einer Pipette in ein steriles Probenröhrchen und legen Sie sie sofort auf Eis. Klemmen Sie das Zentrifugenröhrchen zwischen Daumen und Zeigefinger, um sicherzustellen, dass es aufrecht bleibt.
5. Rückgewinnung von Elektrofahrzeugen
   1. Mit einem vollautomatischen EVs-Extraktionssystem, das eine Unterdruckoszillation durch ein Doppelkupplungs-Ultraschalloszillationssystem auf dem Ultrafiltrationschip anwendet, werden Nukleinsäure- und Proteinverunreinigungen in der Probe durch die Nanopore entfernt und EVs abgefangen, was zur Anreicherung und Reinigung von EVs führt.
      1. Entfernen Sie das Filtrat in Schritt 3.4.7 und fügen Sie es dem Ultrafiltrationschip hinzu.
      2. Betreiben Sie das Gerät gemäß den Geräteanweisungen und sammeln Sie das gefilterte Filtrat, d. h. die mit Exosomen angereicherte Lösung. Der Hauptprozess ist in Abbildung 1 dargestellt.

4. Identifizierung von Elektrofahrzeugen

1. Erfassung von Partikelgröße und -konzentration
   1. Bewerten Sie die Größenverteilung und das Zetapotenzial mit einem auf resistiver Impulsmessung (RPS) basierenden Nanocoulometerzähler. Wählen Sie für dieses Experiment Nanoporen-Chips mit einem Messbereich von 60-200 nm aus. Bewerten Sie außerdem die Partikelgrößenverteilung und das Zetapotenzial der EVs mit Hilfe eines Nanobibliothekszählers.
      1. Nehmen Sie eine angemessene Menge EVs-Lösung und verdünnen Sie sie in (1/10, 1/100, 1/1000, 1/10000).
      2. Unterschiedliche Verdünnungen von EV-Lösungen wurden zum Testen auf das Gerät gegeben.
      3. Das Verdünnungsvielfache mit besserer Stabilität wurde ausgewählt und erneut getestet, um genauere Daten zu erhalten.
2. LPS- und BCA-Assay
   1. BCA-Assay: EVs mit RIPA-Puffer lysieren und dann die Proteine trennen. Bestimmen Sie den Proteingehalt der EVs mit dem BCA-Proteinkonzentrationsbestimmungskit.
   2. LPS-Assay: Fügen Sie mit dem Endotoxin-Nachweiskit Proben, einen Endotoxin-Detektor und chromogen gemäß den Schritten des Kits hinzu. Messen Sie die Extinktion bei 545 nm und berechnen Sie die LPS-Expression der externen Vesikel gemäß der Standardkurve.
3. TEM-Bewertung: Für die Negativfärbung und TEM-Analyse werden die Proben auf ein lumineszierendes Kupfergitter aufgetragen, das mit einem kontinuierlichen Kohlenstofffilm beschichtet ist, und mit 0,75 % Uranylformiat gebeizt. Für Kryo-EM absorbieren Sie die EVs in ein 300-Mesh-EM-Kohlenstoffgitter mit hydrophiler Oberfläche und frieren sie in flüssigem Stickstoff ein. Beobachten und analysieren Sie die Gitter mit dem Cryo-TEM und zeichnen Sie die Bilder mit 22.000 Vergrößerungen^{auf 32}.
4. Charakterisierung von Proteinen: EVs mit RIPA-Puffer lysieren und anschließend die Proteine trennen. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration mit dem BCA-Protein-Assay-Kit, trennen Sie die gleichen Proteinmengen aus jeder Probe mittels SDS-PAGE und färben Sie sie nach der Elektrophorese mit Coomassie-Blau-Farbstofflösung, um die Proteinprofile^{zu visualisieren 33,34}.
5. S-Sequenzierung und -Analyse: Extrahieren Sie genomische DNA aus den Stuhlproben mit einem Stuhl-DNA-Extraktionskit. Beurteilen Sie die Integrität und Konzentration der DNA durch Agarosegelelektrophorese und ein Spektralphotometer. Amplifizieren Sie die V3-V4-Region des 16S rRNA-Gens mit universellen Primern, reinigen Sie die PCR-Produkte, quantifizieren Sie sie und sequenzieren Sie sie auf der Illumina-Plattform. Führen Sie Datenanalysen mit der QIIME2-Pipeline³⁵ durch.
   1. Klassifizieren Sie Amplikon-Sequenzvarianten (ASVs) mit DADA2 und gleichen Sie sie mit der Silva-Datenbank mit dem VSEARCH-Algorithmus ab. Verwenden Sie die α-Diversitätsanalyse, um den Artenreichtum und die Diversität innerhalb der Stichproben zu bewerten, hauptsächlich unter Verwendung von Indizes wie dem Shannon-Index und dem Chao1-Index. Die β-Diversitätsanalyse vergleicht die Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft zwischen Proben und wird in der Regel durch die Hauptkoordinatenanalyse (PCoA) visualisiert. Verwenden Sie Methoden der Differentialanalyse, wie z. B. die lineare Diskriminanzanalyse, die Effektgröße (LEfSe) und die Vulkandiagrammanalyse, um mikrobielle Taxa mit signifikant unterschiedlichen Bedingungen oder zwischen Gruppen zu identifizieren.

Die EV-Konzentrationen wurden in verschiedenen Fraktionen bestimmt (Abbildung 2A). Die experimentellen Ergebnisse zeigten, dass die Konzentration der EVs in einer Reihe von Dichtegradientenlösungen ein typisches Normalverteilungsmuster aufwies (Abbildung 2B). Insbesondere in Fraktion 9 erreichte die Konzentration von EVs ihren höchsten Punkt (3,85 x 10⁹), was darauf hindeutet, dass der Hauptverteilungsanteil von EVs 9³⁶ betragen könnte.

Für die Bestimmung des Proteingehalts wurden BCA-Kits verwendet, um den Proteingehalt in verschiedenen Fraktionen zu bestimmen (Abbildung 2C). Bei dieser Methode betrug der Proteingehalt in Fraktion 9 0,417 μg/μL, was die Verteilung der EVs weiter demonstriert. Da LPS ein einzigartiger Bestandteil von gramnegativen Bakterien^{ist 37,38}, wurden Endotoxin-Nachweiskits auch verwendet, um die Expression von LPS zu bestimmen (Abbildung 2D), um die Verteilung von EVs in verschiedenen Fraktionen zu beurteilen. Die experimentellen Ergebnisse zeigten, dass in den Fraktionen 9 und 10 die LPS-Expression signifikant höher war als in den anderen Fraktionen (Extinktion für Fraktion 9 = 0,8086, für Fraktion 10 = 0,8515), und ihre Verteilung eine Normalverteilung zeigte, was beweist, dass die EVs hauptsächlich in Fraktion 9 verteilt sind. Relativ größere Mengen an Protein in Fraktion 9 wurden auch in der SDS-PAGE-Gelelektrophorese von EVs beobachtet, die aus verschiedenen Fraktionen isoliert wurden (Abbildung 2E).

In dieser Studie wurden Elektrofahrzeuge mit Hilfe der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM; Abbildung 2F). Durch hochauflösende Bildgebung durch TEM war es in der Lage, die morphologische Struktur von EVs mit kreisförmigen membranartigen Strukturen klar sichtbar zu machen, was für das Verständnis der Biologie von EVs entscheidend ist.

Blutdruckveränderungen wurden in der NSD- und HSD-Gruppe nach 2-monatiger Aufzucht in der NSD und HSD der Ratten festgestellt. Wir können sehen, dass die SBP (Abbildung 3A), DBP (Abbildung 3B) und MBP (Abbildung 3C) in der HSD-Gruppe signifikant erhöht waren, was darauf hindeutet, dass das Hypertoniemodell dieser Studie erfolgreich konstruiert wurde.

In dieser Studie wurde die Konzentration von EVs in verschiedenen Gruppen nachgewiesen (Abbildung 3D), und die Ergebnisse zeigten, dass die Konzentration von EVs in der HSD-Gruppe signifikant höher war als die von Ratten in der NSD-Gruppe. Dies deutet darauf hin, dass HSD den Spiegel der EVs beeinflusst, möglicherweise aufgrund von Veränderungen in der Zusammensetzung der Darmmikrobiota, aus der die EVs stammen.

In dieser Studie wurde dann die Partikelgröße der EVs gemessen. Die Messergebnisse deuten darauf hin, dass die Partikelgröße der EVs überwiegend bei etwa 60 nm liegt (Abbildung 3E) und die Partikelgröße der HSD-Gruppe etwas geringer ist als die der NSD-Gruppe. Die gemessenen Daten liefern wichtige Informationen für die Beurteilung der Größenverteilung und Homogenität der Elektrofahrzeuge, die das anschließende Versuchsdesign und die Anwendungsentwicklung erleichtern.

In dieser Studie wurde dann die Menge der LPS-Expression von EVs in der HSD-Gruppe und der NSD-Gruppe untersucht (Abbildung 3F). Die Ergebnisse zeigten, dass die Expression von LPS durch EVs in der HSD-Gruppe ebenfalls signifikant höher war als in der NSD-Gruppe. Dies kann auf die Zunahme gramnegativer Bakterien in der aus Exovesikeln abgeleiteten Darmmikrobiota oder auf die höhere Konzentration von EVs in der HSD-Gruppe als in der NSD-Gruppe zurückzuführen sein.

Um die Unterschiede zwischen EVs in der HSD- und NSD-Gruppe weiter zu untermauern, untersuchte diese Studie die abgeleitete Darmmikrobiota und führte eine 16S rRNA-Sequenzierung von EV-Proben aus der NSD- und HSD-Gruppe durch, um die Wirkung von HSD auf EVs in der Darmmikrobiota bei Mäusen weiter zu klären.

α-Diversitätsanalyse zeigte, dass die Diversität der Darmmikrobiota in der HSD-Gruppe signifikant reduziert war, wobei sowohl der Shannon- als auch der ACE-Index abnahmen (Abbildung 4A). β-Diversitätsanalyse, basierend auf PCoA (Abbildung 4B), unterschied die mikrobiellen Phänotypen zwischen den Gruppen auf ASV-Ebene. Die Intervention mit hohem Salzgehalt kehrte die phänotypischen Veränderungen in der Darmflora teilweise um und fand signifikante Unterschiede in der Zusammensetzung der externen Vesikel-abgeleiteten Darmmikrobiota zwischen den Gruppen (p = 0,001).

Nach dem Herausfiltern von Bakterien mit geringer Abundanz und der Standardisierung der Daten identifizierte die taxonomische Annotation verschiedene Bereiche mikrobieller Gemeinschaften in den Proben. Die aus Exovesikeln gewonnene Darmmikrobiota bestand hauptsächlich aus Proteobakterien (93,19 %), Firmicutes (4,57 %) und Bacteroidota (1,19 %; Abbildung 4C). Die HSD-Gruppe erhöhte signifikant die Häufigkeit der externen Vesikel des Firmicutes (Abbildung 4D). Auf Gattungsebene zeigten die Ergebnisse, dass Gattungen wie Nevskia und Acinetobacter in der NSD-Gruppe häufiger vorkamen, während Delftia, Burkholderia_Ca und Clostridium_sen in der HSD-Gruppe häufiger vorkamen (Abbildung 4E). Darüber hinaus wurden in dieser Studie auch Heatmaps verwendet, um die Unterschiede in den EVs der Darmmikrobiota zwischen der HSD-Gruppe und der NSD-Gruppe zu zeigen (Abbildung 4F). Nach der salzreichen Intervention nahm die Abundanz einiger Bakterien, Delftia und Burkholderia_Ca, signifikant zu, während Nevskia und Acinetobacter signifikant abnahmen (Abbildung 4G). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Intervention mit hohem Salzgehalt den Unterschied in der Produktion von aus der Darmflora gewonnenen EVs signifikant veränderte, hauptsächlich weil sie die Verteilung ihrer Elternbakterien veränderte, und die Hauptmerkmale waren eine Abnahme der Diversität, Veränderungen in der Gleichgewichtsstruktur und Veränderungen in der Häufigkeit verschiedener Bakterien.

Abbildung 1: Extraktion und Charakterisierung von mikrobiell aus dem Darm stammenden äußeren Vesikel. (A) Flussdiagramm der Extraktion aus äußeren Vesikel. (B) Charakterisierung der äußeren Bläschen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Grundlegende Charakterisierung der EVs und die Analyse des lokalen Dichtegradienten. (A) Extra-Vesikelkonzentration und Partikelgrößenmessungen mit unterschiedlichen Dichtegradienten (nm; Partikel/ml). (B) Vergleich der Konzentrationen der externen Vesikel der Lösung anhand des Dichtegradienten 3 - 16 (Partikel/ml). (C) Bestimmung des Gehalts an Lösungsproteinen am Dichtegradienten 6-12 mit dem BCA-Kit (μg/ml). (D) LPS-Expressionsmessung der Lösung mittels Dichtegradient 7-11 mit einem Endotoxin-Nachweiskit (Abs). (E) Lösungen mit einem Dichtegradienten von 6 - 12 wurden einer SDS-PAGE-Gelelektrophorese unterzogen und mit Coomassie Brilliant Blue gefärbt. (F) TEM: Der Maßstabsbalken beträgt 100 nm; Auf dem Bild sind einzelne Vesikel zu sehen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Analyse der Veränderungen des Blutdrucks und der EVs unter verschiedenen Diäten. (A) SBP; (B) DBP; c) MBP; (D) Vergleich der externen Vesikelkonzentrationen in der HSD- und NSD-Gruppe; (E) Vergleich der Größe der äußeren Vesikel in der HSD- und NSD-Gruppe. (F) LPS in den NSD- und HSD-Proben, bestimmt durch Spektrophotometrie. *p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, und NS bedeutet keine Signifikanz, t-Test. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Analyse des 16s rRNA-Tests unter den verschiedenen Diäten. (A) Die α-Diversitätsanalyse; (B) Analyse der Hauptkoordinaten; (C) die Häufigkeit der Darmmikrobiota auf der Ebene der Stämme; (D) Veränderungen bei Bakterien auf Stammebene; (E) LEfSe-Ergebnis; (F) die Cluster-Heatmap-Analyse auf der Grundlage unterschiedlicher Bakteriengattungen; (G) Veränderungen bei den Bakterien auf Gattungsebene. *p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, und NS bedeutet keine Signifikanz, t-Test. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

In dieser Studie konzentrierten wir uns auf die EVs der Darmmikrobiota bei salzempfindlichen Ratten mit einem HSD und erzielten eine Reihe wichtiger Erfolge. Zunächst wurde erfolgreich eine effiziente Extraktionsmethode auf der Grundlage der Dichtegradientenzentrifugation entwickelt, um EVs aus salzempfindlichen Darmmikrobiota von Ratten auf HSD zu isolieren, und die meisten Nicht-EV-Komponenten wurden durch einen sorgfältigen, standardisierten tierexperimentellen Manipulations- und Probenverarbeitungsprozess isoliert. Die EVs-Extraktionsmethode der Dichtegradientenzentrifugation ist hocheffizient und reproduzierbar, besser als die herkömmliche Ultrazentrifugationsmethode und kann die Integrität und Funktionalität von EVs besser erhalten, wodurch die Probenqualität und die Durchführbarkeit der Studie sichergestellt werden.

Zweitens wurden EVs durch verschiedene dynamische Technologien umfassend identifiziert: Die Detektion von Partikelgröße und -konzentration deutet darauf hin, dass EVs eine spezifische Größenverteilung aufweisen; LPS- und BCA-Messungen quantifizieren den Proteingehalt und die LPS-Expression von EVs; TEM zeigt deutlich die morphologische Struktur von Elektrofahrzeugen; und Proteineigenschaften definieren das Proteinspektrum. Diese Identifizierungsergebnisse zeigen umfassend die physikalischen und biochemischen Eigenschaften von Elektrofahrzeugen auf und bieten eine zuverlässige Datenunterstützung für nachfolgende Studien.

Darüber hinaus zeigten die 16S rRNA-Gensequenzierungstechnologie unter Verwendung einer eingehenden Analyse der Unterschiede zwischen dem Ursprung und der Zusammensetzung von normalen und HSD-EVs sowie die α-Diversitätsanalyse und die β-Diversitätsanalyse, dass eine hohe Salzaufnahme die genetischen Eigenschaften von mikrobiellen EVs im Darm, einschließlich der Struktur der mikrobiellen Gemeinschaft, des Artenreichtums und der Diversität, signifikant beeinflusst, um die Auswirkungen einer salzreichen Ernährung auf die EVs der Darmmikrobiota umfassender aufzuklären. bietet mehrere Evidenzebenen für mechanistische Studien.

Obwohl diese Methode einige Vorteile gegenüber der herkömmlichen Überdrehzahl-Zentrifugationsmethode in Bezug auf die Rückgewinnung und Integrität der Exosomen hat, gibt es immer noch einige Einschränkungen, wie z. B. einen hohen Probenbedarf und Schwierigkeiten bei der Unterscheidung des Wirts von der Mikroflora-Quelle. Im Vergleich zu bestehenden Methoden hat die Dichtegradientenzentrifugation jedoch einzigartige Vorteile bei der Aufrechterhaltung der funktionellen Integrität von Exosomen, was eine zuverlässige technische Unterstützung für die weitere Untersuchung des Mechanismus bietet, durch den eine salzreiche Ernährung den Blutdruck des Wirts durch die Darmflora beeinflusst. Darüber hinaus haben wir die unklare Gradientenschichtung, die während des Experiments aufgetreten ist, auch verbessert, indem wir die Zentrifugationszeit verlängert oder den leistungsstärkeren Rotor ausgetauscht haben.

In Zukunft können wir den Mechanismus der Darmmikrobiota EVs bei Bluthochdruck, der durch eine salzreiche Ernährung induziert wird, weiter untersuchen, insbesondere seine Interaktion mit dem Immunsystem, wie z. B. entzündungsfördernden T-Zellen^39,40; oder pflanzliche Produkte verwenden, um in die EVs der Darmmikrobiota^{einzugreifen 41,42}, weiter in Krankheiten einzugreifen und ihre Rolle bei der Regulierung des Wirtsstoffwechsels und der Immunantwort zu erforschen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Studie nicht nur ein wichtiges Instrument zur Erforschung des Mechanismus der salzinduzierten Hypertonie der Darmmikrobiota durch das salzempfindliche Rattenmodell bietet, das Verständnis der Beziehung zwischen HSD, Darmmikrobiota und EVs vertieft und auch einen neuen Weg für die Prävention und Behandlung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen wie Bluthochdruck eröffnet, sondern auch eine einzigartige Perspektive für die Untersuchung der Interaktion zwischen Nahrung, Mikrobe und Wirt bietet.

Die Autoren erklären, dass ihnen keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder persönlichen Beziehungen bekannt sind, die die in diesem Artikel berichtete Arbeit beeinflusst haben könnten.

Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (82205240), der Natural Science Foundation der Provinz Sichuan (2025ZNSFSC1836) und dem Clinical Basic Project des Sichuan Provincial Orthopedic Hospital (PY202414) unterstützt.