Nörogelişimsel Sonuçlar Üzerindeki Etkisini Değerlendirmek için Prenatal Delta-9-Tetrahidrokanabinol Maruziyetinin Klinik Öncesi Modeli

Yasal kısıtlamalar değiştikçe, kannabinoid ürünlerinin erişilebilirliğinin artmasına neden olarak, özellikle hamilelik sırasında bu maruziyetlerin etkisini incelemek için modeller geliştirmek kritik öneme sahiptir. Gönüllü yutma yoluyla orta derecede prenatal kanabinoid maruziyetinin klinik öncesi bir modeli geliştirilmiştir ve bu da daha derinlemesine araştırmalara olanak tanır.

Doğum öncesi kannabinoid maruziyeti (PCE), Amerika Birleşik Devletleri'nde daha fazla eyalet eğlence amaçlı esrarı (kannabinoidler) yasallaştırdıkça giderek daha sık hale geliyor. Hamilelik sırasında kannabinoid ürünlerinin tüketimi, çeşitli anormal sonuçlarla ilişkilendirilmiştir, ancak bu ürünlerin potansiyelinin mevcut ürünlerden yaklaşık% 300 daha düşük olduğu bir dönemde tarihsel çalışmalar yapılmıştır. Kannabinoidlerin artan kullanımı göz önüne alındığında, PCE'nin fetal nörogelişim ve sonraki bebek ve çocuk gelişimi üzerindeki potansiyel etkilerini anlamak önemlidir. Önceki çalışmalar, PCE'nin yavrularda öğrenme ve hafızayı, davranış becerilerini, uykuyu ve dikkati olumsuz etkilediğini göstermiştir. Bu çalışmanın amacı, kannabinoid ürünlerin psikoaktif bileşeni olan delta-9-tetrahidrokanabinolün (THC) gebelik sırasında preklinik bir modelde gönüllü olarak alınması yoluyla PCE'yi özetlemektir. Bu makale, gebelik boyunca orta derecede PCE elde etme prosedürünü özetlemektedir. Bu modelde, kontrol grubu sade mini çikolata/fıstık ezmeli kurabiye tüketirken, PCE grubu mini çikolatalı kurabiyelerle eşleştirilmiş fıstık ezmesine karıştırılmış THC tüketir. Bu yaklaşım, PCE'nin gelişimsel sonuçlar üzerindeki etkisinin daha fazla araştırılmasını sağlar.

Doğum öncesi kannabinoid ürün kullanım oranları^{arttıkça 1}, muhtemelen Amerika Birleşik Devletleri'nde kannabinoid ürünlerinin artan yasallaştırılmasından etkilenerek, fetal gelişim üzerindeki etkilerini daha iyi anlamak için çalışmalara ihtiyaç vardır. Kannabinoid ürünlerinin psikoaktif bileşeni olan delta-9-tetrahidrokanabinol (THC), plasentayı kolayca geçer ve endojen endokannabinoid sistem ^2,3 ile etkileşime girer. Endojen endokannabinoid sistem, nöral gelişimde kritik bir rol oynar ve gelişimsel değişikliklerin meydana geldiği bir yol olabilir. Hamilelik sırasında kannabinoid kullanımı, doğum ağırlığının^{azalması 4} ve erken doğum riskinin^{artması 5,6} ile ilişkilendirilmiştir. Yaşam boyunca sosyal davranış ve yürütücü işlevlerdeki eksiklikler gibi ek gelişimsel anormallikler de bildirilmiştir ^7,8,9.

Zamanla, genel popülasyonda kannabinoid potensi ve kullanım alışkanlıklarındaki değişiklikler, doğum öncesi maruziyetin fetal gelişim üzerindeki potansiyel etkileri üzerine ayrıntılı çalışmalara duyulan ihtiyacı vurgulamıştır. Hamilelik sırasında kannabinoid ürünlerinin kullanımı artmaktadır, çünkü bu ürünler genellikle depresyon, stres, ağrı, uyku bozuklukları ve mide bulantısı gibi semptomları hafifletmek için algılanmaktadır^10,11. Dickson ve ^ark.12, Colorado'da ilk trimester kullanımına ilişkin 400 kenevir dispanserinin tavsiyelerini araştıran bir çalışma yürüttü ve dispanserlerin yaklaşık yarısının (%50.5) hamile bireylere yenilebilir yiyecekler önerdiğini buldu. Yenilebilir yiyeceklerin sigara içilmesiyle ilişkili zarar ve sağlık risklerinden kaçındığı^sıklıkla algılanır ^13,14, bu da birçok hamile bireyin yenilebilir yiyecekleri tüketmesine neden olur.

Yenilebilir yiyecekler, THC'nin kan dolaşımına emildiği ve ilk geçiş metabolizması için portal ven yoluyla karaciğere taşındığı gastrointestinal sistem yoluyla kanabinoidler sağlar. Karaciğerde enzimler, kan-beyin bariyerini¹⁵ kolayca geçen oldukça güçlü bir psikoaktif metabolit olan 11-hidroksitetrahidrokanabinol (11-OH-THC) üretmek için THC'yi hidroksilatlar. Yenilebilir yiyeceklerin ilk psikoaktif etkisi (30-90 dakika) daha uzun sürse de, ortaya çıkan 'yüksek' daha uzun sürer ve yutulduktan 2-4 saat sonra zirve yapar^16,17. THC'nin farmakokinetik yarılanma ömrü sıçanlarda 1.3-7.3 saattir^18,19.

Hamilelik sırasında artan kullanım ve fetal nörogelişim üzerindeki etkisine ilişkin verilerin yetersizliği göz önüne alındığında, nörogelişimsel sonuçlar üzerindeki etkiyi daha fazla tanımlamak için bildirilen tipik insan kullanımıyla (mide bulantısını hafifletmek için oral tüketim) daha yakından uyumlu olan hamilelik sırasında gönüllü THC alımının klinik öncesi bir modeli geliştirilmiştir.

Burada açıklanan tüm prosedürler New Mexico Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi (UNM HSC) Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Tüm deneyler ARRIVE yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Long-Evans (Mavi Ladin, HsdBlu: LE) sıçanları ticari bir kaynaktan elde edildi. Kullanılan erkekler, varışta 12 haftalık ve üreme protokolünün başlangıcında 15-16 haftalık olan kanıtlanmış yetişkin damızlık sıçanlardı. Dişiler 125-150 g ağırlığındaydı ve varışta yaklaşık 6-7 haftalıktı. Üreme sırasında dişiler yaklaşık 9-10 haftalıktı. Tüm prospektif barajların daha önce hamilelik öyküsü olmadığından emin olmak çok önemlidir. Tesise ve yeni konut ortamlarına alışmaları için en az bir hafta süre tanıyın. Bu protokolün ilk kısmı hamilelik öncesi kannabinoid tüketimini ele alırken, ikinci kısım hamilelik kannabinoid maruziyetine odaklanmaktadır. Kullanılan hayvanların, reaktiflerin ve ekipmanların ayrıntıları Malzeme Tablosunda verilmiştir. Deney tasarımı Şekil 1'de verilmiştir.

1. Hamilelik öncesi kannabinoid maruziyeti

1. Konut ve bakım
   1. Hayvanları standart sıçan statik mikro izolatör kafeslerinde, 22 °C'de yataklı, ters 12 saatlik aydınlık/karanlık programda (ışıklar her gün 21:00 - 09:00 saatleri arasında açık) bireysel olarak barındırın.
   2. Çalışma boyunca ışınlanmış gıdalara ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve musluk suyuna ad libitum'a erişim sağlayın.
2. Malzeme ve kimyasal hazırlama
   1. Gerekli tüm malzemeleri ve kimyasalları edinin (Malzeme Tablosunda belirtildiği gibi).
   2. Araştırma sınıfı THC'yi etanol içinde çözünmüş 10 mg / mL veya 20 mg / mL THC içeren şişelerde saklayın.
      NOT: THC cildi tahriş edici ve aspirasyon tehlikesi oluşturduğundan uygun kişisel koruyucu ekipman (KKD) kullanın. ABD Sağlık ve İnsan Hizmetleri Bakanlığı ve ABD Gıda ve İlaç İdaresi tarafından Çizelge I kontrollü bir madde olarak sınıflandırıldığı için THC'yi çelik bir dolapta sabitleyin.
3. Temel ölçümler
   1. Her dişi sıçan için temel vücut ağırlıklarını elde edin.
   2. Gerekirse deneyi burada 1-2 hafta duraklatın.
4. THC ile aşılanmış kurabiyelerin hazırlanması
   1. Tutarlı besleme sürelerini korumak için kurabiyeleri uygulamadan 30 dakika önce her gün saat 14:00'te hazırlayın.
   2. Mini çikolatalı kurabiyeleri ayırın ve kremaya yaklaşık yarım çay kaşığı fıstık ezmesi ekleyin.
   3. Kurabiyeyi birleştirmeden önce gerekli THC dozunu (ilk 2 gün boyunca 1.5 mg / kg, ardından 7 gün boyunca 3 mg / kg) fıstık ezmesi ile karıştırın.
5. Tüketim değerlendirmesi
   1. Tutarlı bir tüketim elde edilene kadar 2-4 gün boyunca sade fıstık ezmesi/mini çikolatalı kurabiye sağlayın. Kafesteki suyu çıkarın ve tedaviyi her gün saat 14: 00'te forseps kullanarak her sıçana uygulayın.
   2. İşlem tamamen tüketilene kadar gözlemleyin. Gerekirse kalıntıları çıkarın.
      NOT: THC'yi 2 gün boyunca 1.5 mg / kg'lık bir dozda, ardından 7 gün boyunca 3 mg / kg'da uygulayın. Hemen tüketilmeyen fareler için 2 saate kadar kafeste muamele bırakın.
   3. Sadece tutarlı tedavi tüketimi gösteren sıçanlarla devam edin. Tutarsız alımı olanları denemeden çıkarın.
   4. Hamilelik öncesi tüketimi 2 hafta boyunca değerlendirin.
6. PCE sonrası grup ataması
   1. Tutarlı bir şekilde yutulan fareleri rastgele olarak düz (kontrol) veya THC ile aşılanmış (PCE) çerez grubuna atayın.
   2. Sistemlerinden THC temizliğini sağlamak için üremeden önce çerezler olmadan en az 4 gün bekleyin.

2. Gebelik (doğum öncesi) kannabinoid maruziyeti

1. Üreme ve hamilelik onayı
   1. Dişileri, kanıtlanmış bir erkek yetiştirici ile bir kafese koymadan önce bir başlangıç ağırlığı elde etmek için tartın (erkek THC-naiftir).
   2. Dişi farelerin bu süre zarfında çerez tüketmediğinden emin olun.
   3. Hamileliği, tipik olarak çiftleşmeden 24 saat sonra ortaya çıkan vajinal bir tıkaç varlığıyla onaylayın.
   4. Dişi fareyi tartın ve ev kafesine geri koyun. Bu, Gebelik Günü (GD) 1 olarak tanımlanır.
2. Hamilelik sırasında THC infüzyonu
   1. Hamilelik süresince GD 1'den başlayarak her gün saat 14: 00'te sade veya THC ile aşılanmış (3 mg / kg) bir çerez sağlayın.
   2. Barajın teslimat için yuva yaptığı belirtilene kadar bu rejime devam edin, bu noktada THC maruziyeti durdurulur.
3. Annenin kilo alımının izlenmesi
   1. Maternal kilo alımını değerlendirmek için sıçan barajlarını haftada iki kez tartın.
      NOT: Yeni ağırlıklar, çereze ne kadar THC ekleneceğini hesaplamak için de kullanılır ve dozu barajın ağırlığına göre gerektiği gibi ayarlar.
4. THC maruziyetinin durdurulması ve doğum belgeleri
   1. Baraj beklenen teslimat süresi civarında yuva yaparken THC'ye maruz kalma prosedürlerini durdurun.
   2. Yavrular doğduktan sonra, canlı yavruların sayısını kaydedin.
   3. Doğum gününü doğum sonrası gün (P) 0 olarak belirleyin.
5. Yavruların sütten kesilmesi ve barındırılması
   1. Yavruları doğum sonrası günde sütten kesin (P) 23.
   2. Grup, sütten kesilmiş yavruları cinsiyete göre yavrularla birlikte barındırır.
6. Barajların ötenazisi
   1. Çöp sütten kesildikten sonra, kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek barajları ötenazi yapın.

3. İşlem sonrası adımlar

1. Yavru barındırma ve izleme
   1. Tüm yavruların uygun barınma koşullarında tutulduğundan, uygun sıcaklık, ışık ve havalandırmanın sağlandığından emin olun.
   2. Anormal vücut ağırlığı veya gelişimsel gecikmeler gibi herhangi bir sağlık veya gelişimsel sorun için yavruları düzenli olarak izleyin.
2. Temel değerlendirme
   1. Gerekirse, yavrular üzerinde deneylere başlamadan önce vücut ağırlığı, refleksler veya diğer ilgili gelişimsel parametreler gibi temel ölçümleri değerlendirin.
3. Deney grubu ödevi
   1. Testteki herhangi bir önyargıyı en aza indirmek için yavruları deney gruplarına rastgele atayın.
   2. Potansiyel çöp etkilerini azaltmak için deney başına kullanılan yavru sayısını her çöpten 1-2 yavru ile sınırlayın.

Gönüllü THC tüketimini sağlamak için, hangilerinin sıçanlar için lezzetli olduğunu ve hızlı ve tutarlı bir şekilde tüketileceğini belirlemek için çok sayıda muamele denendi.

Başlangıçta, hem THC'li hem de THC'siz şekersiz çilek aromalı jelatin küpler (1 kübik mL boyutunda) denendi. Çilek şurubu aromasının miktarı arttırıldı ve THC üç farklı konsantrasyonda (2 mg / kg / doz, 3 mg / kg / doz ve 5 mg / kg / doz) denendi. Sıçanlar küpleri tutarlı bir şekilde tüketmediler ve daha yüksek THC konsantrasyonlarında tüketimi hızla bıraktıkları kaydedildi. Sıçanların acı veya asidik bir tada sahip yiyecekleri reddedebildiği bilinmektedir, bu da bu modelin gönüllü tüketim için uygun olmayabileceğine dair endişeleri artırmıştır.

Kurumsal veterinerle görüştükten sonra, tümü Amazon'dan elde edilen fıstık ezmeli veya peynirli krakerler, fıstık ezmeli mini çikolatalı kurabiyeler, fıstık ezmeli peynirli krakerler ve peynirli balık şeklindeki krakerler dahil olmak üzere çeşitli başka ikramlar denendi. Dişi fareler, fıstık ezmeli mini çikolatalı kurabiyeleri sürekli olarak tükettiler, genellikle muamele edildikten sonraki 10-30 dakika içinde. THC daha sonra fıstık ezmeli mini çikolatalı kurabiyelere eklendi ve günlük muameleyi tüketen barajların yüzdesi kontrol ve THC'ye maruz kalan gruplar arasında benzerdi (sırasıyla% 67'ye karşı% 62; p = 0.14).

Barajlar daha sonra protokolde tarif edildiği gibi, hamilelik öncesi ve doğum öncesi kanabinoid maruziyeti ile THC'ye maruz bırakıldı. Barajlar, üremeden önce kontrol grubuna veya PCE grubuna (3 mg / kg / dozda THC maruziyeti) randomize edildi. Altlık büyüklüğü ve maternal kilo alımı gruplar arasında benzerdi. Mortalite oranı (doğumdan P2'ye kadar ölüm yüzdesi) ve doğum ağırlığı, kontroller ve PCE arasında anlamlılığa yaklaşıyordu (sırasıyla% 0'a karşı. % 0.04, p = 0.06 ve 6.25 g'ye karşı 5.96 g, p = 0.07). Mortalite oranı PCE grubunda daha yüksek eğilim göstermiş ve yavru doğum ağırlığı PCE grubunda daha düşük eğilim göstermiştir (Tablo 1 ve Şekil 2), bu da insan literatürü ile tutarlıdır²⁰.

Şekil 1: Deney tasarımı. Barajlar, tutarlı alımı sağlamak için üremeden önce günlük olarak THC ile aşılanmış kurabiyeleri gönüllü olarak yuttu. Kurabiyeleri tüketmeyen barajlar deneyden çıkarıldı. Kalan barajlar, hamilelik sırasında sade veya THC ile aşılanmış (3 mg / kg) bir kurabiye tüketmek için randomize edildi. Doğum normal olarak gerçekleşti ve yavrular doğum sonrası (P) 23. günde sütten kesildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: PCE modeli için baraj ve yavru özelliklerinin grafiksel gösterimi. Bu şekil, PCE modelindeki baraj ve yavru özelliklerinin grafiksel bir temsilini sağlar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: PCE modeli için baraj ve yavru özellikleri. Gebelik günü (GD) 22'ye kadar maternal kilo alımı, gram cinsinden vücut ağırlığındaki artış olarak ölçüldü ve gruplar arasında anlamlı olarak farklı değildi (p = 0.48). Tablo ayrıca ortalama çöp boyutunu, ölüm oranını (doğumdan P2'ye kadar olan ölümlerin yüzdesi), yavruların çöp başına doğum ağırlığını ve P21'deki ağırlığı da içerir. Tüm veriler, ortalamanın (SEM) standart hatası ± ortalama değer olarak gösterilir; *p değerleri Student t-testi kullanılarak hesaplanmıştır.

Burada özetlenen PCE paradigması, hamile sıçan barajları tarafından gönüllü THC tüketimini içerir. Bu, klinik öncesi bir modelde gönüllü yutma yoluyla hamile sıçan barajlarına THC uygulamasını araştıran ilk çalışmadır. Her iki sıçan barajı grubu da aynı sıçan yemeği diyetini tüketerek gruplar arasındaki beslenme ve kalori alımındaki potansiyel değişkenliği en aza indirdi. Hayvan modelleri, çalışma amaçları için PCE'nin zamanlamasını ve dozajını kontrol etme avantajını sunar.

Hamilelik öncesi tüketim, tüketim protokolünün sonraki aşamaları için istenen seviyelerde THC tüketen sıçanları belirlemek için değerlendirilir. Bu yaklaşım, tüm dişi sıçanların hamilelikten önce THC alımı ile ilgili önceden deneyime sahip olmasını sağlar ve bireylerin hamilelikten önce sıklıkla THC kullandığı insan davranışını⁵ daha doğru bir şekilde yansıtır. Bu modelde, PCE, kabaca insan gebeliğinin ilk iki trimesterine karşılık gelen gebelik gelişimi boyunca ortaya çıkar. Kanıtlar, kanabinoid kullanımının ilk trimesterde en yaygın olduğunu, ikincisinde azaldığını ve üçüncü trimesterde daha fazla azaldığını göstermektedir¹.

Endokannabinoid reseptörleri fetüste 5-6 gebelik haftasına kadar^{eksprese edilmez 21}. Bu dönemden önce maruz kalma, fetal beyin gelişimini doğrudan etkilemeyebilir, ancak plasentadaki endokannabinoid reseptör ekspresyonu yoluyla dolaylı etkiler hala mümkündür²². Sonuç olarak, nörogelişimsel sonuçlara odaklanan araştırmacıların, ilgilenilen belirli sonuçlarla ilgili olarak maruz kalma zamanlamasını hesaba katmaları gerekecektir.

Protokoldeki kritik bir adım, tüketimin hedef serum seviyelerine ulaşmasını sağlamak için THC seviyelerini sık sık ölçme yeteneğidir. Devam eden deneyler, hamilelik sırasında meydana gelen metabolik değişikliklere rağmen stabil bir seviyenin korunabilmesini sağlamak için hamilelik boyunca serum seviyelerini ölçmektedir.

Oral gavaj gibi diğer oral uygulama tekniklerini düşündük. Bununla birlikte, bu modelin amacı, mümkün olduğunca klinik olarak alakalı kalmaktır. Gavaj uygulaması, sıçanlarda önemli strese neden olabilir, bu da kan basıncının artmasına, plazma kortikosteron seviyelerinin yükselmesine ve diğer olumsuz etkilere neden olabilir^23,24. Bu nedenle, istenmeyen yan etkileri en aza indirmek için gönüllü yutmayı seçtik.

Bu çalışmanın sınırlamaları, hazırlama sırasında THC dozajındaki yanlışlıklar sonuçları etkileyebileceğinden, tutarlı tüketimin sağlanmasını ve ikramları hazırlarken dikkatli olunması ihtiyacını içerir. Bireysel sıçanlar metabolizmada farklılık gösterebilse de, bu aynı zamanda klinik korelasyon arzusu göz önüne alındığında bir güçtür.

Genel olarak, orta derecede THC maruziyeti üretmek için klinik öncesi bir gönüllü alım modeli mümkündür. Bu model geliştirme, nörogelişimsel sonuçların yanı sıra diğer ilgi alanlarına ilişkin daha derinlemesine araştırmalara izin verecektir. Gelecekteki çalışmalar, PCE'nin fetal gelişim üzerindeki etkisi ile ilgili artan literatüre katkıda bulunacaktır.

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Cömert THC tedariki için Ulusal Uyuşturucu Bağımlılığı Enstitüsü (NIDA) İlaç Tedarik Programına teşekkür ederiz. New Mexico Üniversitesi Pediatri Bölümü Araştırma Tahsis Komitesi hibesi ve Neonatoloji Anabilim Dalı tarafından desteklenmektedir.