Modello preclinico di esposizione prenatale al delta-9-tetraidrocannabinolo per valutarne l'impatto sugli esiti dello sviluppo neurologico

Poiché le restrizioni legislative cambiano, con conseguente aumento dell'accessibilità dei prodotti a base di cannabinoidi, è di fondamentale importanza sviluppare modelli per studiare l'impatto di queste esposizioni, in particolare durante la gravidanza. È stato sviluppato un modello preclinico di esposizione prenatale moderata ai cannabinoidi attraverso l'ingestione volontaria, che consente indagini più approfondite.

L'esposizione prenatale ai cannabinoidi (PCE) sta diventando sempre più frequente poiché sempre più stati negli Stati Uniti legalizzano la marijuana ricreativa (cannabinoidi). Il consumo di prodotti a base di cannabinoidi durante la gravidanza è stato associato a vari esiti anomali, sebbene gli studi storici siano stati condotti durante un periodo in cui la potenza di questi prodotti era inferiore di circa il 300% rispetto a quella dei prodotti attuali. Dato il crescente uso di cannabinoidi, è essenziale comprendere i potenziali impatti che la PCE può avere sullo sviluppo neurologico fetale e sul successivo sviluppo di neonati e bambini. Studi precedenti hanno dimostrato che la PCE influisce negativamente sull'apprendimento e sulla memoria, sulle abilità comportamentali, sul sonno e sull'attenzione nella prole. Lo scopo di questo studio è quello di ricapitolare la PCE attraverso l'ingestione volontaria di delta-9-tetraidrocannabinolo (THC), il componente psicoattivo dei prodotti cannabinoidi, durante la gravidanza in un modello preclinico. Questo articolo delinea la procedura per ottenere una PCE moderata durante la gestazione. In questo modello, il gruppo di controllo consuma semplici biscotti al cioccolato/burro di arachidi, mentre il gruppo PCE consuma THC mescolato al burro di arachidi abbinato a mini-biscotti al cioccolato. Questo approccio consente ulteriori indagini sull'impatto della PCE sugli esiti dello sviluppo.

Con^{l'aumento dei} tassi di consumo prenatale di cannabinoidi, probabilmente influenzati dalla crescente legalizzazione dei prodotti a base di cannabinoidi negli Stati Uniti, sono necessari studi per comprendere meglio il loro impatto sullo sviluppo fetale. Il delta-9-tetraidrocannabinolo (THC), il componente psicoattivo dei prodotti cannabinoidi, attraversa facilmente la placenta e interagisce con il sistema endocannabinoide endogeno ^2,3. Il sistema endocannabinoide endogeno svolge un ruolo fondamentale nello sviluppo neurale e può essere un percorso attraverso il quale si verificano alterazioni dello sviluppo. L'uso di cannabinoidi durante la gravidanza è stato collegato a una riduzione del peso alla nascita⁴ e a un aumento del rischio di parto prematuro ^5,6. Sono^{state riportate anche} ulteriori anomalie dello sviluppo, come deficit nel comportamento sociale e nelle funzioni esecutive per tutta la vita.

Nel corso del tempo, i cambiamenti nella potenza dei cannabinoidi e nei modelli di utilizzo nella popolazione generale hanno evidenziato la necessità di studi dettagliati sui potenziali effetti dell'esposizione prenatale sullo sviluppo fetale. L'uso di prodotti a base di cannabinoidi durante la gravidanza è in aumento, poiché questi prodotti sono spesso percepiti per alleviare sintomi come depressione, stress, dolore, disturbi del sonno e nausea^10,11. Dickson et ^al.12 hanno condotto uno studio che ha esaminato le raccomandazioni di 400 dispensari di cannabis riguardo all'uso nel primo trimestre in Colorado e hanno scoperto che circa la metà dei dispensari (50,5%) raccomandava gli edibili alle persone in gravidanza. Spesso si percepisce che gli edibili evitano i danni e i rischi per la salute associati al fumo^13,14, il che si traduce in molte persone incinte che consumano edibili.

Gli edibili forniscono cannabinoidi attraverso il sistema gastrointestinale, dove il THC viene assorbito nel flusso sanguigno e trasportato attraverso la vena porta al fegato per il metabolismo di primo passaggio. Nel fegato, gli enzimi idrossilano il THC per produrre 11-idrossitetraidrocannabinolo (11-OH-THC), un metabolita psicoattivo altamente potente che attraversa facilmente la barriera emato-encefalica¹⁵. Sebbene ci voglia più tempo per l'effetto psicoattivo iniziale degli edibili (30-90 min), lo "sballo" risultante dura più a lungo, con un picco a 2-4 ore dopo l'ingestione^16,17. L'emivita farmacocinetica del THC è di 1,3-7,3 ore nei ratti^18,19.

Dato il crescente utilizzo durante la gravidanza e la scarsità di dati sul suo impatto sullo sviluppo neurologico fetale, è stato sviluppato un modello preclinico di ingestione volontaria di THC durante la gravidanza, allineandosi più strettamente con l'uso umano tipico riportato (consumo orale per alleviare la nausea) per descrivere ulteriormente l'impatto sugli esiti dello sviluppo neurologico.

Tutte le procedure qui descritte sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) dell'Università del New Mexico Health Sciences Center (UNM HSC). Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con le linee guida ARRIVE. I ratti Long-Evans (Blue Spruce, HsdBlu: LE) sono stati ottenuti da una fonte commerciale. I maschi utilizzati erano ratti adulti da riproduzione, di 12 settimane all'arrivo e di 15-16 settimane all'inizio del protocollo di riproduzione. Le femmine pesavano 125-150 g e avevano circa 6-7 settimane di età all'arrivo. Al momento della riproduzione, le femmine avevano circa 9-10 settimane. È fondamentale assicurarsi che tutte le potenziali madri non abbiano precedenti di gravidanza. Prevedere almeno una settimana per l'acclimatamento alla struttura e al nuovo ambiente abitativo. La prima parte di questo protocollo affronta il consumo di cannabinoidi prima della gravidanza, mentre la seconda parte si concentra sull'esposizione ai cannabinoidi in gravidanza. I dettagli degli animali, dei reagenti e delle attrezzature utilizzate sono forniti nella Tabella dei Materiali. Il disegno sperimentale è fornito nella Figura 1.

1. Esposizione ai cannabinoidi prima della gravidanza

1. Alloggio e manutenzione
   1. Alloggiare gli animali individualmente in gabbie standard con lettiera statica per ratti con lettiera a 22 °C con un programma inverso di luce/buio di 12 ore (luci accese tutti i giorni dalle 21:00 alle 09:00).
   2. Fornire l'accesso al cibo irradiato (vedi Tabella dei materiali) e all'acqua del rubinetto ad libitum durante lo studio.
2. Materiale e preparazione chimica
   1. Procurarsi tutti i materiali e i prodotti chimici necessari (come indicato nella Tabella dei materiali).
   2. Conserva il THC per la ricerca in fiale contenenti 10 mg/mL o 20 mg/mL di THC disciolto in etanolo.
      NOTA: Utilizzare dispositivi di protezione individuale (DPI) adeguati, poiché il THC è irritante per la pelle e un pericolo per l'aspirazione. Metti al sicuro il THC in un armadio d'acciaio, poiché è classificato come sostanza controllata dalla Tabella I dal Dipartimento della Salute e dei Servizi Umani degli Stati Uniti e dalla Food and Drug Administration degli Stati Uniti.
3. Misurazioni di base
   1. Ottenere il peso corporeo di base per ogni ratto femmina.
   2. Se necessario, metti in pausa l'esperimento qui per 1-2 settimane.
4. Preparazione di biscotti infusi di THC
   1. Preparare i biscotti 30 minuti prima della somministrazione alle 14:00 tutti i giorni per mantenere orari di alimentazione coerenti.
   2. Separare i mini biscotti al cioccolato e aggiungere circa mezzo cucchiaino di burro di arachidi alla crema.
   3. Mescola la dose richiesta di THC (1,5 mg/kg per i primi 2 giorni, seguita da 3 mg/kg per 7 giorni) con il burro di arachidi prima di assemblare il biscotto.
5. Valutazione dei consumi
   1. Fornire un semplice biscotto al burro di arachidi/mini cioccolato per 2-4 giorni fino a raggiungere un consumo costante. Rimuovi l'acqua dalla gabbia e somministra il bocconcino a ciascun ratto usando il forcipe alle 14:00 ogni giorno.
   2. Osservare fino a quando il bocconcino non è completamente consumato. Rimuovere i resti se necessario.
      NOTA: Somministrare THC alla dose di 1,5 mg/kg per 2 giorni, seguito da 3 mg/kg per 7 giorni. Lasciare i bocconcini nella gabbia per un massimo di 2 ore per i ratti che non li consumano immediatamente.
   3. Continuare solo con i ratti che mostrano un consumo costante di bocconcini. Rimuovere dall'esperimento quelli con ingestione incoerente.
   4. Valutare il consumo pre-gravidanza per 2 settimane.
6. Assegnazione di gruppo post-PCE
   1. Assegna i ratti con ingestione costante in modo casuale al gruppo di biscotti semplici (di controllo) o infusi di THC (PCE).
   2. Consentire un minimo di 4 giorni senza biscotti prima dell'allevamento per garantire l'eliminazione del THC dai loro sistemi.

2. Esposizione ai cannabinoidi in gravidanza (prenatale)

1. Allevamento e conferma della gravidanza
   1. Pesa le femmine per ottenere un peso iniziale prima di metterle in una gabbia con un riproduttore maschio provato (il maschio è naïve al THC).
   2. Assicurati che le femmine di ratto non consumino un biscotto durante questo periodo.
   3. Confermare la gravidanza con la presenza di un tappo vaginale, che in genere si verifica 24 ore dopo l'accoppiamento.
   4. Pesa la femmina di ratto e rimettila nella gabbia di casa. Questo è definito come Giorno gestazionale (GD) 1.
2. Infusione di THC durante la gravidanza
   1. Fornire un biscotto semplice o infuso di THC (3 mg/kg) alle 14:00 ogni giorno a partire da GD 1 per tutta la durata della gravidanza.
   2. Continuate questo regime fino a quando non si nota che la madre sta nidificando per il parto, a quel punto l'esposizione al THC viene interrotta.
3. Monitoraggio dell'aumento di peso materno
   1. Pesare le dighe dei ratti due volte a settimana per valutare l'aumento di peso materno.
      NOTA: I nuovi pesi vengono utilizzati anche per calcolare la quantità di THC da includere nel biscotto, regolando la dose secondo necessità in base al peso della madre.
4. Cessazione dell'esposizione al THC e documentazione del parto
   1. Interrompere le procedure di esposizione al THC quando la diga nidifica intorno all'orario previsto per il parto.
   2. Una volta nata la prole, registra il numero di cuccioli vivi.
   3. Designare il giorno di nascita come giorno postnatale (P) 0.
5. Svezzamento e stabulazione della prole
   1. Svezzare la prole nel giorno postnatale (P) 23.
   2. Il gruppo ospita la prole svezzata con compagni di cucciolata in base al sesso.
6. Eutanasia delle dighe
   1. Una volta che la cucciolata è stata svezzata, sopprimere le madri seguendo protocolli istituzionalmente approvati.

3. Fasi post-procedurali

1. Stabulazione e monitoraggio della prole
   1. Assicurarsi che tutta la prole sia tenuta in condizioni di stabulazione adeguate, garantendo temperatura, luce e ventilazione adeguate.
   2. Monitora regolarmente i cuccioli per eventuali problemi di salute o di sviluppo, come peso corporeo anormale o ritardi nello sviluppo.
2. Valutazione di base
   1. Se necessario, valutare le misure di base come il peso corporeo, i riflessi o altri parametri di sviluppo rilevanti prima di iniziare gli esperimenti sulla prole.
3. Assegnazione di gruppo sperimentale
   1. Assegna i cuccioli ai gruppi sperimentali in modo casuale per ridurre al minimo eventuali distorsioni nei test.
   2. Limita il numero di cuccioli utilizzati per esperimento a 1-2 cuccioli per ogni cucciolata per ridurre i potenziali effetti della cucciolata.

Per stabilire il consumo volontario di THC, sono stati sperimentati numerosi bocconcini per determinare quali fossero appetibili per i ratti e sarebbero stati consumati rapidamente e costantemente.

Inizialmente, sono stati sperimentati cubetti di gelatina al gusto di fragola senza zucchero (1 ml cubo), sia con che senza THC. La quantità di aroma di sciroppo di fragole è stata aumentata e il THC è stato testato a tre diverse concentrazioni (2 mg/kg/dose, 3 mg/kg/dose e 5 mg/kg/dose). I ratti non hanno consumato costantemente i cubetti e si è notato che interrompono rapidamente il consumo alle concentrazioni di THC più elevate. È noto che i ratti possono rifiutare il cibo con un sapore amaro o acido, il che ha sollevato preoccupazioni sul fatto che questo modello potrebbe non essere praticabile per il consumo volontario.

Dopo aver consultato il veterinario istituzionale, sono state provate varie altre prelibatezze, tra cui cracker con burro di arachidi o formaggio, mini biscotti al cioccolato con burro di arachidi, cracker al formaggio con burro di arachidi e cracker a forma di pesce con formaggio, tutti ottenuti da Amazon. Le femmine di ratto consumavano costantemente i mini biscotti al cioccolato con burro di arachidi, spesso entro 10-30 minuti dall'offerta del bocconcino. Il THC è stato poi aggiunto ai mini biscotti al cioccolato con burro di arachidi, e la percentuale di madri che hanno consumato il trattamento quotidiano era simile tra i gruppi di controllo e quelli esposti al THC (67% contro 62%, rispettivamente; p = 0,14).

Le madri sono state quindi esposte al THC come descritto nel protocollo, con esposizione ai cannabinoidi prima della gravidanza e prenatale. Le madri sono state randomizzate nel gruppo di controllo o nel gruppo PCE (esposizione al THC a 3 mg/kg/dose) prima della riproduzione. Le dimensioni della cucciolata e l'aumento di peso materno erano simili tra i gruppi. Il tasso di mortalità (percentuale di morte dalla nascita a P2) e il peso alla nascita si avvicinavano alla significatività tra i controlli e la PCE (0% vs. 0,04%, p = 0,06 e 6,25 g vs. 5,96 g, p = 0,07, rispettivamente). Il tasso di mortalità è aumentato nel gruppo PCE e il peso alla nascita della prole è diminuito nel gruppo PCE (Tabella 1 e Figura 2), il che è coerente con la letteratura umana²⁰.

Figura 1: Disegno sperimentale. Le madri ingeriscono volontariamente biscotti infusi di THC ogni giorno prima della riproduzione per garantire un'assunzione costante. Le dighe che non consumavano i biscotti sono state escluse dall'esperimento. Le madri rimanenti sono state randomizzate a consumare un biscotto semplice o infuso di THC (3 mg/kg) durante la gravidanza. Il parto è avvenuto normalmente e i cuccioli sono stati svezzati il giorno postnatale (P) 23. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Rappresentazione grafica delle caratteristiche della madre e della progenie per il modello PCE. Questa figura fornisce una rappresentazione grafica delle caratteristiche della madre e della progenie nel modello PCE. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Caratteristiche della madre e della progenie per il modello PCE. L'aumento di peso materno durante il giorno gestazionale (GD) 22 è stato misurato come l'aumento del peso corporeo in grammi e non è stato significativamente diverso tra i gruppi (p = 0,48). La tabella include anche la dimensione media della cucciolata, il tasso di mortalità (percentuale di decessi dalla nascita a P2), il peso alla nascita della prole per figliata e il peso a P21. Tutti i dati sono mostrati come valore medio ± errore standard della media (SEM); *I valori p sono stati calcolati utilizzando un test t di Student.

Il paradigma PCE qui delineato prevede il consumo volontario di THC da parte di madri di ratti gravide. Questo è il primo studio ad esplorare la somministrazione di THC a madri di ratti gravide tramite ingestione volontaria in un modello preclinico. Entrambi i gruppi di madri di ratti hanno consumato la stessa dieta a base di cibo per ratti, riducendo al minimo la potenziale variabilità nella nutrizione e nell'apporto calorico tra i gruppi. I modelli animali offrono il vantaggio di controllare i tempi e il dosaggio della PCE a scopo di studio.

Il consumo pre-gravidanza viene valutato per identificare i ratti che consumano THC ai livelli desiderati per le fasi successive del protocollo di consumo. Questo approccio garantisce che tutte le femmine di ratto abbiano una precedente esperienza con l'ingestione di THC prima della gravidanza, riflettendo più accuratamente il comportamento umano⁵, in cui gli individui usano spesso il THC prima della gravidanza. In questo modello, la PCE si verifica durante lo sviluppo gestazionale, corrispondente all'incirca ai primi due trimestri di gestazione umana. Le prove suggeriscono che l'uso di cannabinoidi è più comune durante il primo trimestre, diminuisce nel secondo e diminuisce ulteriormente nel terzo¹.

I recettori endocannabinoidi non sono espressi nel feto fino a 5-6 settimane di gestazione²¹. L'esposizione prima di questo periodo potrebbe non influenzare direttamente lo sviluppo del cervello fetale, sebbene siano ancora possibili effetti indiretti attraverso l'espressione del recettore degli endocannabinoidi nella placenta²². Di conseguenza, i ricercatori focalizzati sugli esiti dello sviluppo neurologico dovranno tenere conto dei tempi di esposizione in relazione agli esiti specifici di interesse.

Un passaggio fondamentale del protocollo è la capacità di misurare frequentemente i livelli di THC per garantire che il consumo raggiunga i livelli sierici target. Gli esperimenti in corso stanno misurando i livelli sierici durante la gravidanza per garantire che un livello stabile possa essere mantenuto nonostante i cambiamenti metabolici che si verificano durante la gravidanza.

Abbiamo preso in considerazione altre tecniche di somministrazione orale, come il gavagage orale. Tuttavia, l'obiettivo di questo modello è quello di rimanere il più clinicamente rilevante possibile. La somministrazione di sonda gastrica può indurre uno stress significativo nei ratti, con conseguente aumento della pressione sanguigna, aumento dei livelli plasmatici di corticosterone e altri effetti avversi^23,24. Pertanto, abbiamo scelto l'ingestione volontaria per ridurre al minimo eventuali effetti collaterali indesiderati.

I limiti di questo studio includono la garanzia di un consumo costante e la necessità di cautela durante la preparazione dei dolcetti, poiché le imprecisioni nel dosaggio del THC durante la preparazione potrebbero influire sui risultati. Mentre i singoli ratti possono differire nel metabolismo, questo è anche un punto di forza dato il desiderio di correlazione clinica.

Nel complesso, è possibile un modello preclinico di ingestione volontaria per produrre un'esposizione moderata al THC. Lo sviluppo di questo modello consentirà ulteriori indagini approfondite sui risultati dello sviluppo neurologico, nonché su altre aree di interesse. Studi futuri contribuiranno alla crescente letteratura riguardante l'impatto della PCE sullo sviluppo fetale.

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Grazie al National Institute on Drug Abuse (NIDA) Drug Supply Program per la generosa fornitura di THC. Supportato dalla sovvenzione del Comitato di assegnazione della ricerca del Dipartimento di Pediatria dell'Università del New Mexico e dalla Divisione di Neonatologia.