نموذج قبل السريري للتعرض للدلتا-9-رباعي هيدروكانابينول قبل الولادة لتقييم تأثيره على نتائج النمو العصبي

مع تغير القيود التشريعية ، مما يؤدي إلى زيادة إمكانية الوصول إلى منتجات القنب ، من المهم للغاية تطوير نماذج لدراسة تأثير هذه التعرض ، خاصة أثناء الحمل. تم تطوير نموذج قبل السريري للتعرض المعتدل للقنب قبل الولادة من خلال الابتلاع الطوعي ، مما يتيح إجراء المزيد من التحقيقات المتعمقة.

أصبح التعرض للقنب قبل الولادة (PCE) متكررا بشكل متزايد حيث تقوم المزيد من الولايات في جميع أنحاء الولايات المتحدة بإضفاء الشرعية على الماريجوانا الترفيهية (القنب). ارتبط استهلاك منتجات القنب أثناء الحمل بنتائج غير طبيعية مختلفة ، على الرغم من إجراء دراسات تاريخية خلال وقت كانت فيه فاعلية هذه المنتجات أقل بنسبة 300٪ تقريبا من تلك الموجودة في المنتجات الحالية. بالنظر إلى الاستخدام المتزايد للقنب ، من الضروري فهم الآثار المحتملة التي قد تحدثها PCE على النمو العصبي للجنين ونمو الرضع والطفل اللاحق. أظهرت الدراسات السابقة أن PCE يؤثر سلبا على التعلم والذاكرة والمهارات السلوكية والنوم والانتباه عند النسل. الهدف من هذه الدراسة هو تلخيص PCE من خلال الابتلاع الطوعي ل delta-9-tetrahydrocannabinol (THC) ، المكون ذو التأثير النفساني لمنتجات القنب ، أثناء الحمل في نموذج قبل السريري. توضح هذه المقالة إجراءات تحقيق PCE معتدل طوال فترة الحمل. في هذا النموذج ، تستهلك المجموعة الضابطة ملفات تعريف الارتباط البسيطة من الشوكولاتة الصغيرة / زبدة الفول السوداني ، بينما تستهلك مجموعة PCE THC الممزوج بزبدة الفول السوداني المقترنة بملفات تعريف الارتباط بالشوكولاتة الصغيرة. يتيح هذا النهج مزيدا من التحقيق في تأثير نفقات الاستهلاك الشخصي على النتائج التنموية.

مع زيادة معدلات استخدام منتجات القنب قبل^{الولادة 1} ، من المحتمل أن تتأثر بالتقنين المتزايد لمنتجات القنب في جميع أنحاء الولايات المتحدة ، هناك حاجة إلى دراسات لفهم تأثيرها على نمو الجنين بشكل أفضل. دلتا 9-رباعي هيدروكانابينول (THC) ، المكون ذو التأثير النفساني لمنتجات القنب ، يعبر المشيمة بسهولة ويتفاعل مع نظام endocannabinoid الداخلي^2،3. يلعب نظام endocannabinoid الداخلي دورا مهما في التطور العصبي وقد يكون مسارا تحدث من خلاله تغيرات في النمو. تم ربط استخدام القنب أثناء الحمل بانخفاض الوزن عند^{الولادة 4} وزيادة خطر الولادة المبكرة^5،6. كما تم الإبلاغ عن تشوهات تنموية إضافية ، مثل العجز في السلوك الاجتماعي والوظائف التنفيذية طوال الحياة ،^7،8،9.

بمرور الوقت ، أبرزت التغييرات في فاعلية القنب وأنماط استخدامه في عامة السكان الحاجة إلى دراسات مفصلة حول الآثار المحتملة للتعرض قبل الولادة على نمو الجنين. يتزايد استخدام منتجات القنب أثناء الحمل ، حيث غالبا ما ينظر إلى هذه المنتجات على أنها تخفف من أعراض مثل الاكتئاب والتوتر والألم واضطرابات النوم والغثيان^10،11. أجرى ديكسون وآخرون ¹² دراسة تبحث في توصيات من 400 مستوصف للقنب فيما يتعلق باستخدام الثلث الأول من الحمل في كولورادو ووجدوا أن ما يقرب من نصف المستوصفات (50.5٪) أوصت بالأطعمة للحوامل. غالبا ما ينظر إلى أن المواد الغذائية تتجنب الضرر والمخاطر الصحية المرتبطة بالتدخين^13،14 ، مما يؤدي إلى تناول العديد من الحوامل للأطعمة.

تقوم المواد الغذائية بتوصيل القنب من خلال الجهاز الهضمي ، حيث يتم امتصاص THC في مجرى الدم ونقله عبر الوريد البابي إلى الكبد لعملية التمثيل الغذائي للتمريرة الأولى. في الكبد ، تقوم الإنزيمات بهيدروكسيلات THC لإنتاج 11-هيدروكسي تتراهيدروكانابينول (11-OH-THC) ، وهو مستقلب ذو تأثير قوي للغاية يعبر بسهولة الحاجز الدموي^{الدماغي 15}. على الرغم من أن التأثير النفساني الأولي للأكل يستغرق وقتا أطول (30-90 دقيقة) ، إلا أن "النشوة" الناتجة تستمر لفترة أطول ، مع ذروة في 2-4 ساعات بعد الابتلاع^16،17. عمر النصف الدوائي ل THC هو 1.3-7.3 ساعة في الفئران^18،19.

نظرا للاستخدام المتزايد أثناء الحمل وندرة البيانات حول تأثيره على النمو العصبي للجنين ، تم تطوير نموذج قبل السريري للابتلاع الطوعي ل THC أثناء الحمل ، يتماشى بشكل أوثق مع الاستخدام البشري النموذجي المبلغ عنه (الاستهلاك عن طريق الفم لتخفيف الغثيان) لوصف التأثير على نتائج النمو العصبي.

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الموضحة هنا من قبل لجنة رعاية واستخدام المؤسسي (IACUC) التابعة لمركز العلوم الصحية بجامعة نيو مكسيكو (UNM HSC). أجريت جميع التجارب وفقا لإرشادات ARRIVE. تم الحصول على فئران Long-Evans (Blue Spruce ، HsdBlu: LE) من مصدر تجاري. ثبت أن الذكور المستخدمة من الفئران المربية البالغة ، يبلغ عمرها 12 أسبوعا عند الوصول وتتراوح أعمارها بين 15 و 16 أسبوعا في بداية بروتوكول التربية. كان وزن الإناث 125-150 جراما وكان عمرهن حوالي 6-7 أسابيع عند الوصول. في وقت التكاثر ، كانت الإناث تتراوح أعمارهن بين 9-10 أسابيع تقريبا. ومن الأهمية بمكان التأكد من أن جميع السدود المحتملة ليس لها تاريخ سابق من الحمل. اترك أسبوعا واحدا على الأقل للتأقلم مع المنشأة وبيئتها السكنية الجديدة. يتناول الجزء الأول من هذا البروتوكول استهلاك القنب قبل الحمل ، بينما يركز الجزء الثاني على التعرض للقنب أثناء الحمل. يتم توفير تفاصيل والكواشف والمعدات المستخدمة في جدول المواد. يتم توفير التصميم التجريبي في الشكل 1.

1. التعرض للقنب قبل الحمل

1. الإسكان والصيانة
   1. منزلية بشكل فردي في أقفاص معزولة دقيقة ثابتة قياسية للفئران مع فراش عند 22 درجة مئوية في جدول عكسي لمدة 12 ساعة للضوء / الظلام (تضيء الأضواء من الساعة 21:00 إلى الساعة 09:00 يوميا).
   2. توفير الوصول إلى الأغذية المشعة (انظر جدول المواد) ومياه الصنبور بشكل آزاد طوال الدراسة.
2. تحضير المواد والمواد الكيميائية
   1. الحصول على جميع المواد والمواد الكيميائية المطلوبة (كما هو موضح في جدول المواد).
   2. احتفظ ب THC من الدرجة البحثية في قوارير تحتوي على 10 مجم / مل أو 20 مجم / مل من THC مذاب في الإيثانول.
      ملاحظة: استخدم معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE) ، لأن THC مهيج للجلد وخطر الشفط. قم بتأمين THC في خزانة فولاذية ، حيث يتم تصنيفها على أنها مادة خاضعة للرقابة من قبل وزارة الصحة والخدمات الإنسانية الأمريكية وإدارة الغذاء والدواء الأمريكية.
3. قياسات خط الأساس
   1. الحصول على أوزان الجسم الأساسية لكل أنثى فأر.
   2. أوقف التجربة مؤقتا هنا لمدة 1-2 أسابيع إذا لزم الأمر.
4. تحضير ملفات تعريف الارتباط المليئة ب THC
   1. قم بإعداد ملفات تعريف الارتباط قبل 30 دقيقة من تناولها في الساعة 14:00 يوميا للحفاظ على أوقات تغذية ثابتة.
   2. افصل ملفات تعريف الارتباط الصغيرة بالشوكولاتة وأضف ما يقرب من نصف ملعقة صغيرة من زبدة الفول السوداني إلى الكريمة.
   3. اخلطي الجرعة المطلوبة من THC (1.5 مجم / كجم لأول يومين ، متبوعة ب 3 مجم / كجم لمدة 7 أيام) مع زبدة الفول السوداني قبل تجميع البسكويت.
5. تقييم الاستهلاك
   1. قدمي زبدة الفول السوداني / بسكويت الشوكولاتة الصغيرة لمدة 2-4 أيام حتى يتم تحقيق الاستهلاك المتسق. قم بإزالة الماء من القفص وقم بإعطاء العلاج لكل فأر باستخدام الملقط في الساعة 14:00 يوميا.
   2. راقب حتى يتم استهلاك العلاج بالكامل. قم بإزالة البقايا إذا لزم الأمر.
      ملاحظة: يعطى THC بجرعة 1.5 ملغم/كغ لمدة يومين، متبوعا ب 3 ملغم/كغ لمدة 7 أيام. اترك المكافآت في القفص لمدة تصل إلى ساعتين للفئران التي لا تستهلك على الفور.
   3. استمر فقط مع الفئران التي تظهر استهلاكا ثابتا للعلاج. قم بإزالة تلك التي تحتوي على ابتلاع غير متسق من التجربة.
   4. تقييم استهلاك ما قبل الحمل لمدة أسبوعين.
6. تعيين مجموعة ما بعد PCE
   1. قم بتعيين الفئران ذات الابتلاع المتسق بشكل عشوائي إما لمجموعة ملفات تعريف الارتباط العادية (التحكم) أو المملوءة ب THC (PCE).
   2. اترك ما لا يقل عن 4 أيام بدون ملفات تعريف الارتباط قبل التكاثر لضمان إزالة THC من أنظمتها.

2. التعرض للقنب أثناء الحمل (قبل الولادة)

1. تأكيد التكاثر والحمل
   1. قم بوزن الإناث للحصول على وزن أولي قبل وضعها في قفص مع مربي ذكر مثبت (الذكر ساذج THC).
   2. تأكد من أن إناث الفئران لا تستهلك ملف تعريف الارتباط خلال هذا الوقت.
   3. تأكد من الحمل بوجود سدادة مهبلية ، والتي تحدث عادة بعد 24 ساعة من التزاوج.
   4. قم بوزن أنثى الفئران وإعادتها إلى قفص المنزل. يعرف هذا بأنه يوم الحمل (GD) 1.
2. تسريب THC أثناء الحمل
   1. قدمي ملف تعريف ارتباط عادي أو مملوء ب THC (3 مجم / كجم) في الساعة 14:00 يوميا بدءا من GD 1 طوال مدة الحمل.
   2. استمر في هذا النظام حتى يلاحظ أن السد يعشش للتسليم ، وعند هذه النقطة يتوقف التعرض ل THC.
3. رصد زيادة وزن الأمهات
   1. قم بوزن سدود الفئران مرتين في الأسبوع لتقييم زيادة وزن الأم.
      ملاحظة: تستخدم الأوزان الجديدة أيضا لحساب مقدار THC الذي يجب تضمينه في ملف تعريف الارتباط ، وضبط الجرعة حسب الضرورة بناء على وزن السد.
4. التوقف عن التعرض ل THC وتوثيق الولادة
   1. أوقف إجراءات التعرض ل THC عندما يكون السد متداخلا في الوقت المتوقع للتسليم.
   2. بمجرد ولادة النسل ، سجل عدد الجراء الحية.
   3. حدد يوم الميلاد كيوم ما بعد الولادة (P) 0.
5. الفطام وإسكان النسل
   1. فطام النسل في يوم ما بعد الولادة (P) 23.
   2. منزل جماعي للنسل المفطوم مع زملائه على أساس الجنس.
6. القتل الرحيم للسدود
   1. بمجرد فطام القمامة ، قم بالقتل الرحيم للسدود باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا.

3. الخطوات اللاحقة للإجراءات

1. إسكان النسل والمراقبة
   1. تأكد من الاحتفاظ بجميع النسل في ظروف سكنية مناسبة ، مما يضمن درجة الحرارة المناسبة والضوء والتهوية.
   2. راقب الجراء بانتظام بحثا عن أي مشاكل صحية أو تنموية ، مثل وزن الجسم غير الطبيعي أو تأخر النمو.
2. تقييم خط الأساس
   1. إذا لزم الأمر ، قم بتقييم مقاييس خط الأساس مثل وزن الجسم أو ردود الفعل أو غيرها من المعلمات التنموية ذات الصلة قبل بدء التجارب على النسل.
3. تعيين المجموعة التجريبية
   1. قم بتعيين الجراء للمجموعات التجريبية بشكل عشوائي لتقليل أي تحيزات في الاختبار.
   2. حدد عدد الجراء المستخدمة في كل تجربة إلى 1-2 صغار من كل فضلات لتقليل تأثيرات القمامة المحتملة.

لتحديد الاستهلاك الطوعي ل THC ، تم تجربة العديد من الأطعمة لتحديد أيها مستساغ للفئران وسيتم استهلاكه بسرعة ومتسقة.

في البداية ، تمت تجربة مكعبات الجيلاتين الخالية من السكر بنكهة الفراولة (حجم 1 مل مكعب) ، مع أو بدون THC. تمت زيادة كمية نكهة شراب الفراولة ، وتم تجربة THC بثلاثة تركيزات مختلفة (2 مجم / كجم / جرعة ، و 3 مجم / كجم / جرعة ، و 5 مجم / كجم / جرعة). لم تستهلك الفئران المكعبات باستمرار ولوحظ أنها تتوقف عن الاستهلاك بسرعة بتركيزات أعلى من THC. من المعروف أن الفئران يمكن أن ترفض الطعام ذو المذاق المر أو الحمضي ، مما أثار مخاوف من أن هذا النموذج قد لا يكون قابلا للتطبيق للاستهلاك الطوعي.

بعد التشاور مع الطبيب البيطري المؤسسي ، تمت تجربة العديد من الأطعمة الأخرى ، بما في ذلك البسكويت مع زبدة الفول السوداني أو الجبن ، وكعك الشوكولاتة الصغير مع زبدة الفول السوداني ، ومقرمشات الجبن مع زبدة الفول السوداني ، والبسكويت على شكل سمكة مع الجبن ، وكلها تم الحصول عليها من أمازون. استهلكت إناث الفئران باستمرار ملفات تعريف الارتباط الصغيرة بالشوكولاتة مع زبدة الفول السوداني ، غالبا في غضون 10-30 دقيقة من تقديم المكافأة. ثم تمت إضافة THC إلى ملفات تعريف الارتباط الصغيرة بالشوكولاتة مع زبدة الفول السوداني ، وكانت النسبة المئوية للسدود التي استهلكت العلاج اليومي متشابهة بين المجموعات الضابطة والمعرضة ل THC (67٪ مقابل 62٪ ، على التوالي ؛ ص = 0.14).

ثم تعرضت السدود ل THC كما هو موضح في البروتوكول ، مع التعرض للقنب قبل الحمل وقبل الولادة. تم تقسيم السدود بشكل عشوائي إلى المجموعة الضابطة أو مجموعة PCE (التعرض ل THC عند 3 مجم / كجم / جرعة) قبل التكاثر. كان حجم القمامة وزيادة وزن الأمهات متشابهين بين المجموعات. كان معدل الوفيات (النسبة المئوية للوفيات من الولادة إلى P2) والوزن عند الولادة يقتربان من الأهمية بين الضوابط وPCE (0٪ مقابل 0.04٪ ، p = 0.06 و 6.25 g مقابل 5.96 g ، p = 0.07 ، على التوالي). اتجه معدل الوفيات إلى الارتفاع في مجموعة PCE ، واتجه وزن النسل عند الولادة إلى الانخفاض في مجموعة PCE (الجدول 1 والشكل 2) ، وهو ما يتوافق مع الأدبيات البشرية²⁰.

الشكل 1: التصميم التجريبي. تبتلع السدود طواعية ملفات تعريف الارتباط المملوءة ب THC يوميا قبل التكاثر لضمان تناول متسق. تم استبعاد السدود التي لا تستهلك ملفات تعريف الارتباط من التجربة. تم توزيع السدود المتبقية بشكل عشوائي لاستهلاك ملف تعريف ارتباط عادي أو مملوء ب THC (3 مجم / كجم) أثناء الحمل. حدثت الولادة بشكل طبيعي ، وتم فطام الجراء في يوم ما بعد الولادة (P) 23. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: التمثيل الرسومي لخصائص السد والنسل لنموذج PCE. يوفر هذا الشكل تمثيلا بيانيا لخصائص السد والنسل في نموذج PCE. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: خصائص السد والنسل لنموذج PCE. تم قياس زيادة وزن الأم خلال يوم الحمل (GD) 22 على أنها زيادة في وزن الجسم بالجرام ولم تكن مختلفة بشكل كبير بين المجموعات (p = 0.48). يتضمن الجدول أيضا متوسط حجم القمامة ، ومعدل الوفيات (النسبة المئوية للوفيات من الولادة إلى P2) ، والوزن عند الولادة لكل القمامة ، والوزن عند P21. تظهر جميع البيانات كقيمة متوسطة ± خطأ معياري للمتوسط (SEM). *تم حساب قيم p باستخدام اختبار t للطالب.

يتضمن نموذج PCE الموضح هنا الاستهلاك الطوعي ل THC من قبل سدود الفئران الحامل. هذه هي الدراسة الأولى التي تستكشف إعطاء THC لسدود الفئران الحامل عن طريق الابتلاع الطوعي في نموذج قبل السريري. استهلكت كلتا المجموعتين من سدود الفئران نفس النظام الغذائي لتناول الفئران ، مما قلل من التباين المحتمل في التغذية وتناول السعرات الحرارية بين المجموعات. توفر النماذج الحيوانية ميزة التحكم في توقيت وجرعة PCE لأغراض الدراسة.

يتم تقييم استهلاك ما قبل الحمل لتحديد الفئران التي تستهلك THC بالمستويات المرغوبة للمراحل اللاحقة من بروتوكول الاستهلاك. يضمن هذا النهج أن جميع إناث الفئران لديها خبرة سابقة في تناول THC قبل الحمل ، مما يعكس بشكل أكثر دقة السلوك البشري⁵ ، حيث يستخدم الأفراد غالبا THC قبل الحمل. في هذا النموذج ، يحدث PCE طوال فترة نمو الحمل ، وهو ما يتوافق تقريبا مع الثلث الأولين من الحمل البشري. تشير الدلائل إلى أن استخدام القنب هو الأكثر شيوعا خلال الأشهر الثلاثة الأولى من الحمل ، وينخفض في الثلث الثاني ، وينخفض في الثلث^{الثالث 1}.

لا يتم التعبير عن مستقبلات endocannabinoid في الجنين حتى 5-6 أسابيع من الحمل²¹. قد لا يؤثر التعرض قبل هذه الفترة بشكل مباشر على نمو دماغ الجنين ، على الرغم من أن التأثيرات غير المباشرة من خلال التعبير عن مستقبلات endocannabinoid في المشيمة لا تزال ممكنة²². وبالتالي ، سيحتاج الباحثون الذين يركزون على نتائج النمو العصبي إلى مراعاة توقيت التعرض فيما يتعلق بالنتائج المحددة ذات الأهمية.

تتمثل إحدى الخطوات الحاسمة في البروتوكول في القدرة على قياس مستويات THC بشكل متكرر لضمان أن الاستهلاك يحقق مستويات المصل المستهدفة. تقوم التجارب الجارية بقياس مستويات المصل طوال فترة الحمل لضمان إمكانية الحفاظ على مستوى مستقر على الرغم من التغيرات الأيضية التي تحدث أثناء الحمل.

نظرنا في تقنيات الإعطاء الفموي الأخرى، مثل التزقيم الفموي. ومع ذلك ، فإن الهدف من هذا النموذج هو أن يظل ذا صلة سريريا قدر الإمكان. يمكن أن يؤدي إعطاء التزقيم إلى إجهاد كبير في الفئران ، مما يؤدي إلى زيادة ضغط الدم ، وارتفاع مستويات الكورتيكوستيرون في البلازما ، وآثار ضارة أخرى^23،24. وبالتالي ، اخترنا الابتلاع الطوعي لتقليل أي آثار جانبية غير مقصودة.

تشمل قيود هذه الدراسة ضمان الاستهلاك المستمر والحاجة إلى توخي الحذر عند تحضير المكافآت ، حيث يمكن أن تؤثر عدم الدقة في جرعة THC أثناء التحضير على النتائج. في حين أن الفئران الفردية قد تختلف في عملية التمثيل الغذائي ، إلا أن هذه أيضا قوة نظرا للرغبة في الارتباط السريري.

بشكل عام ، من الممكن وضع نموذج قبل سريري للابتلاع الطوعي لإنتاج التعرض المعتدل ل THC. سيسمح تطوير هذا النموذج بإجراء مزيد من التحقيقات المتعمقة في نتائج النمو العصبي ، بالإضافة إلى مجالات الاهتمام الأخرى. ستساهم الدراسات المستقبلية في الأدبيات المتزايدة المتعلقة بتأثير PCE على نمو الجنين.

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

شكرا لبرنامج توريد المخدرات التابع للمعهد الوطني لتعاطي المخدرات (NIDA) على الإمداد السخي من THC. بدعم من منحة لجنة تخصيص أبحاث قسم طب الأطفال بجامعة نيو مكسيكو وقسم طب حديثي الولادة.