Tüp Testi Kullanılarak Fare Modellerinde Sosyal Baskınlığın Değerlendirilmesi

Bu protokol, tüp testini kullanarak kemirgenlerde sosyal baskınlığı değerlendirmek için davranışsal bir testi tanımlar. Sosyal baskınlık zaman içinde sabit kalır ve çeşitli gelişimsel ve nörolojik bozukluk modelleri sağlam sosyal baskınlık anormallikleri sergiler. Bu nedenle, tüp testi, mekanik çalışmalar veya klinik öncesi terapötik tarama için uygun bir sonuç ölçüsü olarak hizmet eder.

Sosyal baskınlık, nörogelişimsel ve nörodejeneratif hastalıklarda değişir ve bu bozuklukların klinik öncesi çalışmalarında yararlı bir sonuç ölçüsü olarak hizmet eder. Tüp testi, pahalı ekipman gerektirmeyen sosyal baskınlığı değerlendirmek için basit bir davranışsal testtir. Bu testte, iki fare şeffaf bir plastik tüpün zıt uçlarına girer ve ortada buluştuktan sonra biri (daha az baskın olan) geri çekilmelidir. Tüp testi hem erkek hem de dişi fareler için kullanılabilir ve araştırmacının ihtiyaçlarına uygun birkaç uyarlanabilir parametre içerir. Fareler, bir sosyal baskınlık endeksi sağlamak için birden fazla benzersiz rakibe karşı test edilebilir. Tüp testindeki sosyal baskınlık, tekrarlanan testlere göre sabit kalır ve diğer sosyal tahlillerdeki performansla ilişkilidir. Ek olarak, test, kafes içi sosyal baskınlık hiyerarşilerini değerlendirmek için kafes arkadaşları arasında gerçekleştirilebilir. Tüp testi, deneysel müdahalelerden önce ve sonra uzunlamasına test yapılmasını sağladığı için klinik öncesi terapötik çalışmalarda özellikle yararlıdır. Bu nedenle, mekanik çalışmalar ve klinik öncesi terapötik tarama için uygun bir sonuç ölçüsü olarak hizmet eder.

Sosyal davranışın bozulması, gelişimsel, psikiyatrik ve nörodejeneratif bozukluklar dahil olmak üzere birçok insan bozukluğunun bir özelliğidir ^1,2. Fare modelleri, bu bozuklukların patogenezi hakkında bilgi edinmek ve terapötiklerin klinik öncesi testleri için bir platform sağlamak için kullanılır. Bununla birlikte, farenin sosyal davranışı için birçok tahlilin gerçekleştirilmesi zaman alıcıdır, analiz etmek için pahalı ekipman ve / veya video izleme yazılımı gerektirir veya öznel puanlama algoritmalarına sahiptir. Buna karşılık, sosyal baskınlık için tüp testinin gerçekleştirilmesi hızlı ve basittir ve özel ekipman veya video izleme gerektirmez. Tahlil, sonuçların yorumlanmasını kolaylaştıran ikili bir kazan/kaybet sonucuna sahiptir.

Sosyal baskınlık için tüp testi, farelerde sosyal baskınlığı değerlendirmek amacıyla Lindzey ve meslektaşları tarafından geliştirilmiştir³. Geliştirilmesinden bu yana, tüp testi, kafes içi sosyal baskınlık hiyerarşilerini değerlendirmenin bir yolu olarak da kurulmuştur⁴. Tüp testi fenotipleri, erkek farelerde berberlik, ödül rekabeti ve idrar yapma gibi diğer sosyal baskınlık ölçütleriyle ilişkilidir⁵. Bununla birlikte, tüp testinin karışık sonuçları ve bunun gıda ve suya erişim ve saldırganlık için rekabet ile ilişkisi vardır ^3,6,7. Daha da önemlisi, tüp testi fenotipleri, üç odacıklı sosyallik ^8,9 gibi diğer sosyal fenotiplerle ilişkilidir.

Tüp testinin bir avantajı, anatomisinin iyi tanımlanmış olmasıdır, bu da onu otizm spektrum bozuklukları ve frontotemporal demans 8,9,10,11,12,13,14,15,16 gibi sosyal eksikliklerle karakterize edilen diğer hastalıklar da dahil olmak üzere çeşitli fare modellerinde özellikle yararlı kılar.. Medial prefrontal korteks (mPFC), fare tüpü test davranışının⁶ önemli bir aracıdır. Wang ve meslektaşları, mPFC'deki aktivitenin farelerde sosyal baskınlığı artırdığını gösterdi⁶ ve daha yeni veriler, prelimbik ve anterior singulat kortekslere mediodorsal talamik girdinin sosyal baskınlığı artırdığını göstererek bu içgörüyü geliştirdi¹⁷. Tüp testi sosyal baskınlığı, dendritik direklerdeki anormallikler, dendritik dikenler, glutamat reseptörleri ve/veya nöronal uyarılabilirlikte mPFC'nin kilit rolü ile tutarlı olarak, mPFC, otizm spektrum bozukluklarının kemirgen modellerinde tüp testi anormallikleri ile ilişkilendirilmiştir^15,18, frontotemporal demans ^8,19, kronik stres 20 ve sosyal izolasyon²¹.

Tüp testinin bir diğer önemli avantajı, tüp testindeki fare sosyal baskınlığı zaman içinde stabil olduğundan, deneysel bir müdahaleden önce ve sonra tekrarlanan testlere izin verdiğinden, terapötik müdahaleden önce ve sonra sosyal baskınlığı test etme yeteneğidir 6,8,22,23. Bunun bir örneği, bir haplo yetmezliği hastalığı olan progranulin (GRN) mutasyonlarının neden olduğu frontotemporal demansın progranulin heterozigot (Grn ^+/-) fare modellerinden gelir. Progranulin heterozigot farelerin sosyal baskınlık açığı^{vardır 8}. Bu tüp testi eksikliği, progranulini AAV-progranulin gen tedavisi²² ile geri yükleyerek veya progranulin bozunmasını azaltmak için tasarlanmış anti-sortilin antikorlarının²³ uygulanmasıyla tersine çevrilebilir. Bu örnekler, demansla ilgili araştırmalar için klinik öncesi çalışmaların tasarlanmasında tüp testinin kullanışlılığını göstermektedir.

Bu protokol, deney grupları arasındaki farkları değerlendirmek için kagemat olmayanlar arasında ve kafes içi sosyal baskınlık hiyerarşilerini değerlendirmek için cagematlar arasında tüp testini çalıştırmak için temel yöntemler sağlar.

Tüm deneysel prosedürler, Birmingham'daki Alabama Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı ve Laboratuvar Hayvanları Bakımı Değerlendirme ve Akreditasyon Derneği'ne (AAALAC) uygun olarak gerçekleştirildi. Progranulin heterozigot fareler üretildi ve daha önce tarif edildiği gibi bir C57BL / 6J arka planına çaprazlandı⁹. Bu çalışma için kullanılan fareler, en az 12 nesil boyunca C57BL / 6J arka planına geri çaprazlanmıştı. Örnek verilerde 9-16 aylık fareler kullanıldı. Bu çalışmada hem erkekler hem de kadınlar kullanıldı. Fareler, saat 06:00'da ışıklar açıkken 12:12 saat aydınlık/karanlık döngüsünde tutuldu ve tüm testler ışık fazında yapıldı. Farelere, tüm deneyler boyunca yiyecek ve suya ad libitum erişim verildi. Reaktiflerin ve kullanılan ekipmanın ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Tüp testi maç tasarımı

1. Testten önce tüp test eşleşmelerini planlayın. Deneyciyi gruplara karşı kör tutmak için genotip notu olmadığından emin olun (Ek Tablo 1'e bakınız).
   NOT: Fareleri tipik olarak karşıt deney grubunun ^8,9,22,23 3 benzersiz rakibine karşı test ederiz, ancak bazı çalışmalar daha fazla rakibe karşı test yapıldığını ^{bildirmektedir 10,11,13}.
2. Yan önyargının olası kafa karıştırıcı etkilerinden kaçınmak için deneysel farelerin tüpün sol ve sağ taraflarına atanmasını dengeleyin.
3. Kafes olmayanları test ederken, fareleri gereğinden fazla strese sokmamak için kafeslerin hareketini en aza indirin. Kafes hareketini en aza indirmek için, aynı iki kafes arasındaki eşleşmeleri mümkün olduğunca üst üste getirin.
4. Kafes arkadaşlarını test ederken, her bir fareyi bir kafesten diğer tüm farelere karşı hepsini bir kez deneme tarzında test edin. Test birkaç gün boyunca tekrarlanıyorsa, farenin girmek üzere atandığı tüpün tarafı (yani sol veya sağ) günden güne değiştirilmelidir.

2. Tüp seçimi

NOT: Tipik olarak, tüp testi, PVC'den yapılmış, piyasada bulunan şeffaf plastik boru ile gerçekleştirilir (bkz. Malzeme Tablosu). Bu protokolün fareler için optimize edildiğini, ancak sıçanlar, tarla fareleri ve hamsterlar gibi diğer kemirgen modellerine uygulanabileceğini unutmamak önemlidir².

1. PVC boruyu 30,5 cm uzunluğunda kesin. PVC boru biraz esnektir ve genellikle rulolar halinde saklanır, bu nedenle kullanımdan önce düzeltilmesi gerekebilir. Hafif ısıtma, kavisli tüplerin düzeltilmesine yardımcı olacaktır.
2. Tüpün iç çapı, testin başarısı için kritik öneme sahiptir. Tüpün farelerin hareket etmesi için yeterince büyük olduğundan, ancak farelerin birbirinin üzerinden geçmesine izin verecek kadar büyük olmadığından emin olun.
   NOT: Tüp, farelerin bir sosyal baskınlık yarışmasına girmeden birbirlerini geçebilecekleri kadar büyükse test işe yaramayacaktır. Aşağıdakiler, C57BL / 6J farelerde uygun tüp boyutları için yaklaşık yönergelerdir: (1) <6 aylık erkek fareler, <9 aylık dişi fareler için 1 inç / 2,5 cm iç çap (ID); (2) 6-9 aylık erkek fareler, >9 aylık dişi fareler için 1,25 inç / 3,2 cm iç çap; ve (3) >9 aylık erkek fareler için 1,5 inç / 3,5 cm iç çap.
3. Mümkünse, bir fare grubundaki tüm testler için aynı boyutta bir tüp kullanın. Fareler ilk birkaç eşleşme sırasında çaprazlanırsa, sonraki tüm eşleşmeleri bir sonraki en küçük tüple çalıştırın.

3. Test yeri

1. Tüp testini ortam aydınlatması altında herhangi bir düz, sabit yüzey veya filtreli başlık üzerinde gerçekleştirin.
   NOT: Test genellikle gün içinde sabah 8 ile akşam 5 arasında yapılır. Farelerin birden fazla gün boyunca test edildiği durumlar için, her fare her test için günün aynı saatinde test edilmelidir (örneğin, sabah 11 ile öğleden sonra 3 arasında). Bildiğimiz kadarıyla, günün saati etkileri daha önce incelenmemiştir.
2. Tüp testini minimum dış uyaranla sessiz bir yerde gerçekleştirin. İdeal olarak, araştırmacı odadaki tek kişi olmalıdır.

4. Alışkanlık

1. Alışkanlık, farelerin test ortamına aşina olmalarını sağlayan ve daha tutarlı ve güvenilir sonuçlara yol açabilen davranışsal tahlillerde önemli bir uygulamadır²⁴. Tüp testi için, testten önce fareleri test odasına alıştırın. Test, hayvanların barınma odasında yapılmazsa, testten önce farelerin yeni odaya alışması için en az 1 saat bekleyin.
2. (İsteğe bağlı) İstenirse, fareler testten önce tüpe alıştırılabilir. Tüpe alışmak için, fareyi bir rakip olmadan tüpe yerleştirin ve testten 2-3 gün önce tüpten 2-3 kez geçmesine izin verin. Bu bizim standart uygulamamız değil.

5. Standart tüp testi

NOT: (İsteğe bağlı) Tüp testinde yeni olan araştırmacılar, deneysel olmayan ayrı bir fare grubu kullanarak fareleri tüpe yerleştirme alıştırması yapmak isteyebilirler. Araştırmacıların genellikle fareleri tüpe yerleştirme alıştırması yapmaları gerekir. Deneyimli bir araştırmacı, teste tabi tutulan farelerde daha az strese neden olacaktır. Farelerin tüpe yerleştirilmesi hakkında daha fazla bilgi adım 5.3'te verilmiştir.

1. Test edilecek aynı cinsiyetten fareler içeren tüm kafesleri bir arabaya yerleştirin. Kafesleri test alanına taşıyın. Tüpleri ve test alanını %2 klorheksidin ve ardından %70 etanol ile temizleyin. Tüpler, tüpün içinden bir kağıt havlu iterek 50 mL'lik bir serolojik pipet kullanılarak kolayca temizlenir.
2. İlk eşleşme için iki kafesi test yüzeyine yerleştirin. Kapakları çıkarın ve her kafesin yanına yerleştirin.
3. Test edilecek iki fareyi bulun. Her iki elinizde, tüpün atanmış tarafına karşılık gelen bir fare tutun. İlk fareyi bulduktan sonra, kuyruğunu nazikçe tutun ve ikincisini ararken kafeste tutun.
   NOT: Farenin kuyruğunu uzunluğunun merkezine yakın tutmak, araştırmacının fareyi çok sıkı bir şekilde kısıtlamadan nazikçe kontrol etmesini sağlar. Fareyi gereksiz yere zorlamamak için fareyi dört pençesi de kafes yatağının üzerinde kalacak şekilde tutun.
4. Her iki fareyi de aynı anda her kafesten çıkarın ve kafaları tüpün girişine gelecek şekilde nazikçe yerleştirin.
   NOT: Fareler alışmışsa veya daha önce test deneyimine sahipse, tipik olarak birkaç saniye içinde tüpe girerler. Fareler tüpe karşı safsa, ilk denemeye girmekte tereddüt edebilirler. Gerekirse, tüp girişini teşvik etmek için fareler bir sonraki en büyük tüpe geçirilebilir.
5. Farelerin erken temas etmesini önlemek için her farenin kuyruğunu tutun. Farelerin tüpe zorlanmadığından emin olun. Bununla birlikte, tüpe girmeye başladıklarında, tüpe tam girişi teşvik etmek için hafifçe dürtülebilirler.
6. Her iki fare de tüpe girdiğinde, kuyrukları serbest bırakın ve tüpten uzaklaşın (Şekil 1A). Her iki fare de tüpün içine ilerlemeli ve merkeze yakın bir yerde buluşmalıdır (Şekil 1B).
   1. Maçı gözlemleyin ve kazananı ve kaybedeni kaydedin. Bir farenin pençelerinden ikisi tüpten çıkıp test yüzeyine temas ettiğinde eşleşmeyi kaybettiği kabul edilir (Şekil 1C).
      NOT: Bir fare tipik olarak diğerini tüpten iter, ancak bazı fareler rakip fareyle temas ettikten sonra zorlamasız bir geri çekilme gerçekleştirir. Bazen, her iki fare de aynı anda geri çekilir veya bir fare, rakip fareye temas etmeden tüpe girdikten hemen sonra geri çekilir. Bu olaylardan herhangi biri meydana gelirse, her iki fareyi de tüpe geri yerleştirin ve eşleşmeyi yeniden başlatın. Fareler tipik olarak ikinci denemede daha standart bir eşleşme gerçekleştirir. Her iki fare de 2 dakika içinde geri çekilmezse, maçı durdurun ve oturumun sonunda tekrar çalıştırın.
7. Maç bittikten sonra fareleri ev kafeslerine geri koyun. Tüpü ve test yüzeyini %70 etanol ile temizleyin.
8. 1. adımda açıklanan tasarımı kullanarak eşleşmeleri çalıştırmaya devam edin. Her tur, bir önceki turdan hemen sonra başlar. Bir cinsiyetten tüm eşleşmeler yapıldığında, kafesleri rafa/arabaya geri koyun ve aynı prosedürü kullanarak karşı cinsten fareleri test edin.
   1. Çalışan dişi ve erkek fareler arasındaki test yüzeyini ve tüpleri iyice temizleyin. Test tamamlandıktan sonra, hem tüpleri hem de test alanını% 2 klorheksidin ile temizleyin.
9. İstatistiksel analiz için, her grup için galibiyet sayısını sayın ve gözlemlenen ve beklenen dağılımı karşılaştırmak için binom testini kullanarak analiz edin, beklenen dağılım her grup için %50 kazanç olarak ayarlanmıştır.
   1. Galibiyet sayısını maç sayısına bölerek her fare için kazanma yüzdesini hesaplayın (eksik fare veya başka sorunlar nedeniyle bir maç iptal edilmedikçe genellikle üç maç). Mann-Whitney testini kullanarak her grup için kazanma yüzdesini karşılaştırın.
      NOT: Tekrarlanırsa, bu eşleşmeler ek deneysel manipülasyonların yokluğunda benzer sonuçlar verir. Örneğin, daha önce yapılan bir araştırma, 47 maçın 40'ının, birbirini izleyen⁸. günlerde oynandığında aynı sonucu verdiğini gözlemledi.

6. Sosyal baskınlık hiyerarşilerini değerlendirmek için kafes içi tüp testi

NOT: Fareler, bir kafes içindeki tüm farelerin round-robin tüp testi ile ortaya çıkarılabilen kararlı sosyal baskınlık hiyerarşileri oluşturur ^4,6. Hem erkek hem de dişi fareler bu hiyerarşileri oluşturur⁸. Sosyal baskınlık hiyerarşileri en iyi şekilde en az 5 fare içeren kafeslerde değerlendirilir.

1. 1. adımda açıklandığı gibi karşı dengeleme ile maçları önceden planlayın.
2. Tüp testi eşleşmelerini 5. adımda açıklandığı gibi çalıştırın. Her seferinde bir kafesi test edin ve tüm fareleri round-robin tarzında test edin. Tüpü ve test alanını her eşleşme arasında %70 etanol ile temizleyin.
3. Her farenin sabit sıralama sıralarını belirlemek için her kafesi en az 5 gün boyunca günde bir kez test edin.
4. İstatistiksel analiz için, fare başına kazanma sayısını değerlendirin. Her fareyi galibiyet sayısına göre sıralayın.

7. Klinik öncesi terapötik tarama için tüp testinin kullanılması

NOT: Birçok fare modelinde sosyal baskınlık fenotiplerinin sağlamlığı ve kararlılığının yanı sıra tüp testinin gerçekleştirilmesinin kolaylığı, tüp testini terapötik stratejilerin klinik öncesi testleri için yararlı bir paradigma haline getirmektedir. Bunun için tüp testi, test seri olarak yapılabildiği için hayvan içi bir tasarım kullanılarak yapılabilir. İlaçla çapraz tasarım yapmak, daha sonra kontrol etmek veya tam tersi de mümkündür. Tüp testi daha önce Grn ^+/- farelerde^22,23 progranulin artırıcı tedavileri değerlendirmek için kullanılmıştır, bu da bu fare modelinde sosyal baskınlık fenotiplerinin geri dönüşümlü olduğunu göstermiştir. Aşağıdaki tartışmanın netliği için, fareler "kontrol" (vahşi tip, transgenik olmayan, vb.) veya "model" (nakavt, transgenik, vb.) olarak tanımlanacak ve deneysel müdahaleler "araç" veya "tedavi edilmiş" (terapötik müdahale) olarak tanımlanacaktır. Fareler aşağıda "kontrol" ve "model" olarak adlandırılırken, bu grupların her biri için littermat kullanmak idealdir.

1. Deneysel bir müdahaleden önce, test için kullanılacak model farelerde beklenen sosyal baskınlık fenotipinin varlığını doğrulamak için bir ön test yapın. Tüm kontrol havuzunu ve model fareleri birbirine karşı test edin ve bu verileri, grupların başlangıçta dengeli olduğundan emin olmak için fareleri tedavi gruplarına atamak için kullanın.
2. Terapötik tedaviye bağlı olarak farklı tedavi sürelerine ihtiyaç duyulabilir. Örneğin, ilaç bir AAV ise, farelerin ameliyattan sonra iyileşmesine izin verin ve ilacın etkili olması için zamana sahip olun. İlaç küçük bir molekül ise, tüp testinden önce tedavi paradigmalarını belirleyin²².
3. Fareleri, her genotipteki araç ve tedavi edilen farelerin benzer derecede temel sosyal baskınlık fenotiplerine sahip olacak şekilde deney gruplarına atayın. Fareler birkaç rakibe karşı birden çok kez test edilirse, her farenin kazanma yüzdesi (adım 5.9'da açıklanmıştır) benzer fenotiplere sahip iki grup oluşturmak için kullanılabilir.
   1. Farelerin ARRIVE yönergelerine dayalı olarak gruplara gerçekten rastgele bir dağılımı için, her farenin kazanma yüzdesine dayalı bir blok randomizasyon protokolü kullanın⁸.
4. Gruplar atandıktan sonra, fareleri tedavi sırasında birden fazla zaman noktasında test edin. Tipik olarak gerçekleştirilen karşılaştırmalarla ilgili ayrıntılar için aşağıdaki NOT'a bakın:
   NOT: (1) Araç kontrol fareleri vs. araç modeli fareler (bu, araç tedavisinin fare modelinin fenotipini gizlemediğini göstermek için yapılan bir kontrol karşılaştırmasıdır); (2) Araç kontrol fareleri vs. tedavi edilmiş model fareler (bu, tedavi edilen model farelerin normal kontrollerden farklı olduğu hipotezini test eder); (3) araç modeli fareler vs. tedavi edilen model fareler (bu, tedavinin fare modelinin fenotipini değiştirdiği hipotezini test eder); (4) Araç kontrol fareleri vs. tedavi edilen kontrol fareleri (bu, sosyal baskınlık fenotipi olmayan farelerde tedavinin etkilerini belirlemek için bir kontrol karşılaştırmasıdır).
5. Tipik olarak, test iki gün boyunca, günde yaklaşık 6 eşleşme ile gerçekleştirilecek ve adım 7.4'te belirtilen karşılaştırmalar (1-4) yapılacaktır. Aşırı testten kaçınmak için, 1. günde (1) ve (2) karşılaştırmalarını ve 2. günde (3) ve (4) karşılaştırmalarını çalıştırın. Araç kontrol fareleri 1. günde her iki model grubuna karşı test edildiğinden, her karşılaştırmanın eşleşmeleri serpiştirilmelidir.
6. Test bittikten sonra fareleri ev kafeslerine geri koyun. Tüpü ve test yüzeyini %70 etanol ile temizleyin.

Tüp testi, progranulin mutasyonlarına bağlı frontotemporal demans fare modelinde yaygın olarak kullanılmıştır, Grn ^+/-  fareler 8,9,22,23,25. Bu fareler 9 aylıkken düşük sosyal baskınlık sergiler (Şekil 2A-D)⁸. Daha yaşlı Grn^+/- farelerin düşük sosyal baskınlık fenotipi, tekrarlanan testlerle stabildir (Şekil 2A)⁸, bu da onu sağlam bir deneysel sonuç ölçüsü^22,25 yapar.

Kagematlar arasındaki sosyal baskınlık hiyerarşilerini araştırmak için Grn ^+/- farelerde kafes içi test de yapılmıştır (Şekil 3A-D)⁸. Daha da önemlisi, hem erkek (Şekil 3A,B) hem de dişi (Şekil 3C,D) fareler bu hiyerarşileri oluşturur ve Grn^+/- fareler de kagematları arasında düşük sosyal baskınlık sergiler (Şekil 3E). İlginç bir şekilde, Grn^−/− farelerde bu anormallik yoktu (Şekil 3E).

Daha yaşlı Grn ^+/-  fareler tarafından sergilenen düşük sosyal baskınlık fenotipi (Şekil 2), onu progranulin artırıcı terapötik müdahaleler için çekici bir sonuç ölçüsü haline getirir. AAV enjeksiyonu öncesi, Grn ^+/-  fareler düşük bir sosyal baskınlık fenotipi sergiler (Şekil 4A). Bir kontrol virüsü enjekte edilen Grn ^+/-  fareler hala düşük baskınlık fenotipi göstermektedir (Şekil 4B). Progranulin seviyelerini artırmak için bir virüs enjekte edilen Grn ^+/-  fareler artık düşük sosyal baskınlık fenotipine sahip değildir (Şekil 4C). Kontrol AAV ile enjekte edilen Grn ^{+// *}  fareleri ile progranulin artırıcı AAV enjekte edilen Grn ^{+// -}  fareler karşılaştırıldığında, kontrol AAV enjekte edilen Grn ^+/-  fareler düşük sosyal baskınlık sergiler (Şekil 4D).

Şekil 1: Tüp testinin şeması. (A) Deneyciler, fareleri dört pençesiyle birlikte tüpe girdikten sonra serbest bırakırlar. Tüp, bir farenin dönemeyeceği veya başka bir farenin üzerine tırmanamayacağı kadar küçük olmalıdır. (B) Her iki fare de daha sonra tüpün ortasına doğru hareket eder ve burada buluşurlar. (C) Daha baskın fare tüpte kalırken, daha az baskın olan fare geri çekilecektir. Fare, iki pençe tüpten çıktığında kaybeden olarak sayılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Bir sosyal baskınlık fenotipini tanımlamak için tüp testini kullanan temsili sonuçlar. Bu çalışma, frontotemporal demansın Grn ^{+// −} fare modelinde yapıldı. Fareler, 1. adımda açıklandığı gibi 3 yeni rakibe karşı 3 tur test edildi. Verileri sunmanın farklı yolları gösterilir. (A) 9 aylıktan büyük Grn ^+/-  fareler, tekrarlanan testlerde stabil olan düşük bir sosyal baskınlık fenotipine sahiptir (* = binom testi, p < 0.05; veri noktaları her genotipin kazanma yüzdesini temsil eder). (B) Genotip başına toplam kazanç yüzdesini çizen üç test turundan elde edilen toplu veriler (*** = binom testi, p = 0.0004). (C) Her farenin 3 maçının tamamında kazandığı galibiyet sayısını çizin. Grn^+/−fareler  daha düşük sayıda galibiyete sahipti (**** = Mann-Whitney testi, p < 0.0001). Her nokta bir faredir. (D) Belirli bir kazanma yüzdesine sahip her bir genotipteki farelerin yüzdesinin grafiği. Grn ^+/-  farelerin düşük kazanma yüzdesine sahip olma olasılığı daha yüksekti. (**** = Mann-Whitney testi, p < 0.0001). 9-16 aylık fareler, n = grup başına 58 fare. Veriler, Arrant ve ^ark.8'in izniyle uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Kafes içi sosyal baskınlık hiyerarşisini belirlemek için tüp testi kullanılarak elde edilen temsili sonuçlar. Erkek veya dişi farelerin kafesleri (her biri 4-5 fareden oluşan cinsiyet başına n = 4 kafes), sosyal baskınlık hiyerarşisinin test edilmesine izin vermek için 5 gün boyunca round-robin tarzında test edildi.  (A,B) Erkek ve dişi fareler için sosyal baskınlık puanları, her kafeste 5'i en baskın fare ve 1'i en az baskın fare olmak üzere galibiyet sayısına göre belirlendi. 5. günde, hem erkek (A) hem de dişi (B) fareler ortalama olarak başlangıç puanlarının bir sırası içinde kaldılar. Renk kodlaması 1. gün sıralamasına göredir. (C, D) 5. gündeki sıralama, her iki cinsiyet için de 1. gündeki sıralama ile oldukça anlamlı bir korelasyona sahipti. (E) Grn^+/+, Grn^+/- ve Grn^−/− − farelerin birlikte grup halinde barındırıldığı kafesleri değerlendirmek için bu kafes içi paradigmayı kullanarak, Grn^+/- fareler de düşük sosyal baskınlık sergiledi (Kruskal-Wallis testi, p = 0.0063, * = p < Dunn'ın post-hoc testi ile 0.05). İlginç bir şekilde, Grn^{−/− farelerde}  düşük sosyal baskınlık gözlenmedi. Veriler, Arrant ve ark., 2016^8'in izniyle uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Klinik öncesi terapötik etkinliği değerlendirmek için tüp testini kullanan temsili sonuçlar. (A) AAV enjeksiyonundan önceki temel testte, Grn ^+/- farelerin sosyal baskınlığı düşüktü (* = Mann-Whitney testi, p = 0.0157; veya * = binom testi, p = 0.0281). Blok randomizasyonu kullanılarak, fareler daha sonra progranulin protein seviyelerini (AAV-Grn) artırmak için bir AAV veya bir kontrol AAV (AAV-GFP) olan tedavi gruplarına atandı. (B) Kontrol AAV-GFP enjekte edilen Grn ^+/- farelerin sosyal baskınlığı düşüktü (* = Mann-Whitney testi, p = 0.0196; veya * = binom testi, p = 0.0330). (C) AAV-Grn enjekte edilen Grn ^+/- fareler artık düşük sosyal baskınlığa sahip değildi. (D) AAV-GFP ile enjekte edilen Grn ^+/- fareleri ile AAV-Grn karşılaştırıldığında, AAV-Grn enjekte edilen fareler, kontrol AAV-GFP enjekte edilen farelere kıyasla daha yüksek sosyal baskınlığa sahipti (** = Mann-Whitney, p = 0.0034; veya ** = binom, p = 0.0062). n = grup başına 19-36 fare. Veriler, Arrant ve ^ark.22'nin izniyle uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 1 ve 2: Deney tasarımı. Örnek bir tüp testi eşleşme tasarım sayfası. Her deney grubunun tüpün sol ve sağ tarafları arasındaki dağılımına ve kafeslerin test alanına giren ve çıkan hareketini en aza indirme çabasına dikkat edin. Bu dağılımı görselleştirmek için A Grubu siyahtır ve B Grubu kırmızı renkle listelenmiştir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Sosyal baskınlık için tüp testi, araştırmacıların fare modellerinde birincil sonuç ölçüsü veya bir dizi davranışsal testin bir parçası olarak yararlı bulabilecekleri, kolayca benimsenen ve hızlı bir şekilde gerçekleştirilen bir test sağlar. Bu makale, yabancılar arasında veya kafes arkadaşları arasında tüp testinin gerçekleştirilmesi için temel protokolleri sağlar.

Araştırmacılar, tüp testi davranışını etkileyebilecek çeşitli parametrelerin farkında olmalıdır. Tüm bu parametreler için, belirli bir fare modeli üzerindeki etkilerini belirlemek için pilot çalışmalar tavsiye edilir. Hem erkek hem de dişi fareler tüp testini yapabilir, ancak bazı fare modelleri sosyal baskınlık fenotipi^26'da cinsiyet farklılıkları gösterirken, diğerleri göstermediği için her cinsiyetten fareler ayrı ayrı analiz edilmelidir 8,15,27,28. Tüp testi, aynı hayvanda, hem bir test oturumu içinde (her fare için bir kazanma yüzdesinin hesaplanmasına izin verir) hem de birkaç oturum arasında (yaş veya müdahale etkilerini değerlendirmek için uzunlamasına teste izin verir) birden çok kez tekrarlanabilir. Bununla birlikte, testin tekrarlanması bazı fare modellerinde sosyal baskınlık fenotiplerini etkileyebilir ^8,11,26. Son olarak, arka plan gerilmesi, ilk tüp testi yayını^3'te belirtildiği gibi, tüp testi davranışı üzerinde bir etkiye sahiptir. Burada tarif edilen tüm çalışmalar C57BL / 6J arka planındaki farelerde gerçekleştirildi ve tüp testi ile ilgili son ufuk açıcı makaleler de C57BL / 6 veya C57BL / 6J farelerinde 4,6,17,29 gerçekleştirildi. Diğer türlerde çalışan araştırmacılar, yeni deneylere devam etmeden önce sosyal baskınlık davranışının istikrarını ve tekrarlanabilirliğini doğrulamak isteyebilirler.

Tüp testinin birincil sonuç ölçüsü kazanma/kayıptır. Bununla birlikte, diğer gruplar her maçın uzunluğunu ve hatta her maçtaki alt davranışları kaydetti. Bu nedenle araştırmacılar, her testten elde edilen verilerin zenginliğini artırmak için bu tür bilgileri toplamak isteyebilirler. Wang ve meslektaşları, kafes içi hiyerarşilerde büyük farklılıklara sahip fareleri eşleştirirken, eşleşmelerin, yakın sıradaki fareleri eşleştirirken olduğundan daha kısa olduğunu ve en baskın farelerin maçları hızlı bir şekilde kazandığını gösterdiğini bildirdi⁶. Zhou ve meslektaşları tüp testinde birkaç alt davranış puanladılar: "itme başlatılan", "geri itme", "direnç" ve "geri çekilme" ve kazanan farelerin daha fazla itme ve dirençle meşgul olduklarını, ancak kaybeden farelerden daha az geri çekildiklerini buldular¹⁷. Maçların video kaydı gerekli olmasa da, sosyal baskınlık davranışının bu daha ayrıntılı analizleriyle ilgilenen araştırmacılar her maçı kaydetmek isteyebilirler.

Birçok davranışsal tahlilde olduğu gibi, tüp testi de sosyal davranışla ilgisi olmayan diğer eksikliklerle karıştırılabilir. Motor bozukluğunun tüp test performansını etkilemesi muhtemeldir, bu nedenle araştırmacılar rota-çubuk, açık alan, kutup testi vb. testlerle motor fenotipler için temel bir tarama yapmak isteyebilirler. Koku alma ipuçları, fare sosyal davranışının önemli bir yönüdür^30,31, bu nedenle araştırmacılar, tüp testi davranışını etkileyebilecek koku alma eksikliklerini de taramalıdır. Bunu yapmanın basit bir yolu, farelerin yabancı bir fareden gelen idrarı araştırmak için harcadıkları zamanı suya karşı^{ölçmektir 9}.

Yeni fare modellerinde sosyal davranışı karakterize eden araştırmacılar, tüp testini bir dizi sosyal testin bir parçası olarak kullanmayı düşünmelidir. Tüp testi anormallikleri olan fare modelleri, üç odacıklı sosyallik testi, sakin-davetsiz misafir testi ve sosyal etkileşimin nitel puanlaması gibi diğer tahlillerde sıklıkla anormal sosyal davranış sergiler 9,10,11,12,13,14,15,20,27,32,33,34 ^,35. Tüp testindeki sosyal baskınlık, berberlik, idrar işaretleme ve kafeste sıcak bir yer için rekabet gibi diğer görevlerdeki sosyal baskınlık ile ilişkilidir 17,36,37. Bununla birlikte, yiyecek, su veya dişi farelere erişim için rekabet gibi diğer görevlerdeki sosyal baskınlık, tüp testi sosyal baskınlığı ile daha az ilişkilidir ^7,38. Araştırmacılar, bir dizi test kullanarak, fare modellerinde sosyal baskınlık, saldırganlık, sosyal araştırma ve sosyal tanınma ölçümleri elde edebilirler.

Tüp testi, sosyal baskınlık fenotiplerinin zaman içindeki stabilitesi ve fareleri tekrar tekrar test etme yeteneği nedeniyle Grn ^+/- fare modelinde klinik öncesi terapötik yaklaşımlar 22,23,25'in test edilmesinde birincil sonuç ölçüsü olarak kullanılmıştır. Müdahaleleri taramak için tüp testini kullanmakla ilgilenen araştırmacılar, öncelikle fare modellerinde tekrarlanan testler boyunca sosyal baskınlık fenotiplerinin stabilitesini belirlemelidir. Bunu yapmak için önce fareleri test edin, ardından aynı eşleşmeleri bir gün, bir hafta veya bir aylık aralıklarla tekrar tekrar test edin. Daha uzun deneysel zaman çizelgelerine ihtiyaç duyulursa, bu tekrarlar daha da uzun aralıklarla gerçekleştirilebilir. Bu eşleşmeler arasındaki uyum, testler arasındaki kappa değeri hesaplanarak istatistiksel olarak belirlenebilir. Tüp testi, fare modelinde uygun stabiliteye ulaşırsa, basitliği ve hızı nedeniyle ideal bir tarama testi yapar.

Erik D. Roberson, AGTC ve Lilly için danışman olarak görev yaptı ve Genentech'ten telif ücreti aldı.

Fare yetiştiriciliği ve koloni bakımı konusunda yardımları için James Black ve Miriam Roberson'a, tüp testi pilot tahlillerinde yardım için Anthony Filiano ve Alicia Hall'a ve progranulin nakavt fareleri sağladıkları için Robert Farese, Jr.'a teşekkür ederiz. Bu çalışma, FTD Araştırma Konsorsiyumu ve FTD'yi Tedavi Etmek için Bluefield Projesi, Ulusal Nörolojik Bozukluklar ve İnme Enstitüsü (R01NS075487, P30NS047466 ve F32NS090678) ve Ulusal Yaşlanma Enstitüsü (P30AG086401, R00AG056597 ve K00AG068428) tarafından desteklenmiştir. Davranış deneyleri, Birmingham'daki Alabama Üniversitesi'ndeki Hayvan Davranışı Değerlendirme Çekirdek Tesisinde gerçekleştirildi.