Hidradenitis Suppurativa Tünellerinden Mikrobiyal İzolasyon için Kapsamlı Yaklaşım

Hidradenitis Suppurativa hastalarından eksize edilen dokulardaki kutanöz sinüs yollarından (tüneller) titiz ve anaerobik organizmaları başarılı bir şekilde izole etmek için bir yöntem sergiliyoruz.

Hidradenitis Suppurativa (HS), ağrılı nodüller ve apseler ile kendini gösteren, cildin dermal katmanları içindeki sinüs yollarına (tünellere) ilerleyen, yaşam kalitesini ciddi şekilde azaltan önemli rahatsızlığa, kötü kokulu akıntıya, şekil bozukluğuna, kontraktürlere ve yara izlerine neden olan zayıflatıcı bir durumdur. HS, cilt mikrobiyomundaki değişikliklerle ilişkilidir, bağışıklık düzenlemesini ve cildin zararlı bakterilere karşı savunmasını etkiler. Yaygınlığına rağmen, HS mikrobiyomunun hastalık patolojisine katkısı ve tedaviye sınırlı yanıtı büyük ölçüde bilinmemektedir. Bugüne kadar, HS dokusu üzerinde yapılan çoklu 16S rRNA dizileme çalışmaları, Gram-negatif anaeroblarda bir artış ve cilt kommensallerinde bir azalma tanımlayarak yalnızca cins düzeyinde granülerlik elde etmiştir. HS'li bireylerde mikrobiyal disbiyozun daha derin bir şekilde anlaşılması, tedavi stratejilerini optimize etmek için esastır. Bu, HS mikrobiyomunu değerlendirmek için, cilt bozukluklarına odaklanan translasyonel çalışmalarda genellikle yeterince kullanılmayan bakteri türlerinin izolasyonu da dahil olmak üzere iki yönlü bir yaklaşım gerektirir. HS dokusundan tek tek mikroorganizmaların izole edilmesi, bakterilerin HS patogenezindeki rolünü aydınlatmak için çok önemlidir. Burada, anaerobik patojenleri HS tünel dokusundan başarılı bir şekilde izole etmek için tekrarlanabilir yöntemleri vurguluyor ve HS'deki bakteri rolünü anlamada ilk ve en kritik adımı sağlıyoruz. Bu yöntem, HS'ye mikrobiyal katkılara yönelik hedefli araştırmaların ve bu kronik durumun karmaşık mikrobiyal yükünü ele alan daha etkili, kişiselleştirilmiş tedavi stratejilerinin geliştirilmesinin yolunu açmaktadır.

Hidradenitis Suppurativa (HS), cildin dermal ve deri altı katmanlarında oluşan sinüs yollarına (tüneller) ilerleyen, belirgin ağrıya neden olan, pürülan akıntı, şekil bozukluğu ve zayıflatıcı psikososyal sekellere neden olan nodüller ve apseler ile karakterize yaygın bir dermatolojik durumdur ^1,2. HS, tipik olarak geç ergenlik veya erken yetişkinlik döneminde ortaya çıkan renkli tenli kadınları ve bireyleri orantısız bir şekilde etkiler². Durumun şiddetli fiziksel semptomları, yaşam kalitesini ciddi şekilde azaltabilen depresyon, anksiyete ve sosyal izolasyon dahil olmak üzere derin psikososyal etkisi ile birleşir³. İlerlemiş hastalık evresinde oluşan HS tünelleri, hastaların şu anda onaylanmış biyolojik tedaviye yanıt verme olasılığını önemli ölçüde azaltmaktadır ve cerrahi eksizyon tek tedavi yaklaşımı olmaya devam etmektedir ^4,5.

Çok sayıda çalışma, HS tünelleri ile ilişkili mikrobiyomu karakterize etmiş, anaerobik patojenlerin prevalansını ve kutanöz kommensallerin bolluğunun azaldığını göstermiştir ^6,7,8, ^son çalışmalar Porphyromonas spp. (tip I) ve Prevotella spp. (IV) diğer cinslerin yanı sıra^{tünellerde 9}. Başka bir çalışma, doku örneklemesinin derinliğine göre HS mikrobiyomunda varyasyon buldu ve tünel dokusundaki mikrobiyal bileşimin benzersizliğini doğruladı¹⁰. Ek olarak, disbiyozun HS'deki bağışıklık tepkisini etkilediği gösterilmiştir^ve bu da hastalık patogenezinde mikropların rolünü daha da etkilemektedir 11,12,13,14. Klindamisin, rifampisin ve tetrasiklinlerle uzun süreli sistemik antibiyotik tedavisi kullanımda olmasına ve etkilenen hastalarda drenaj tünellerinin sayısında bir azalma göstermesine^{rağmen 15,16}, HS'deki antibiyotiğe dirençli anaerobik patojenler hakkındaki veriler bilinmemektedir. Şimdiye kadar, HS tünellerinden bakteri suşlarının izole edilmesi rapor edilmemiştir, bu da yeni antimikrobiyal tedaviler üzerine yapılan çalışmaları ve patojenlerin HS hastalık patogenezine katkısının derinlemesine değerlendirilmesini sınırlamaktadır. Patojenlerin izolasyonu için yöntemlerin standardizasyonu, yalnızca HS'nin patogenezindeki bakteri rolüne ilişkin gerçek içgörüleri kolaylaştırmakla kalmayacak, aynı zamanda daha hedefli ve gelişmiş müdahalelere doğru çeviriye de izin verecektir.

Burada, mikroorganizmaları HS tünel dokusundan başarılı bir şekilde izole etmek için bir yöntemi vurguluyoruz. Tek tek bakteri türlerini izole etmek, HS patolojisindeki rollerini anlamada çok önemli bir ilk adımdır. Bu yöntem, HS'ye mikrobiyal katkılara yönelik hedefli araştırmaların ve bu kronik durumda bakteriyel patojenleri ele alan daha etkili, kişiselleştirilmiş tedavi stratejilerinin geliştirilmesinin yolunu açmaktadır.

Bu protokol, Miami Üniversitesi'ndeki Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) tarafından onaylanmıştır (protokol #20200187). Bilgilendirilmiş onam, HS tüneli teşhisi konan hastalardan (n = 18, ortalama yaş ± standart sapma = 30.9 ± 9.4, 12 kadın, 6 erkek) ve/veya yasal vasi(ler)inden işlem öncesinde herhangi bir endişe veya sorunun ele alınmasına izin vermek için alınır.

1. Hasta numunesi toplama

1. Eksize edilen dokuyu işlemeden önce, kontaminasyon riskini en aza indirmek için sıkı steril önlemler alın. Dokuyu tutan kişi bir laboratuvar önlüğü, yüz maskesi ve cerrahi başlık giymeli ve dokuyu tutmak için steril eldivenler ve steril aletler kullanmalıdır.
2. Sterilite kontrolü için, dokuyu işlemeden önce önceden otoklavlanmış forsepsleri anaerobik taşıma şişesine batırın (Malzeme Tablosu).
3. HS tünelleri teşhisi konan hastaların etkilenen bölgelerinden bir neşter veya CO₂ lazeri ile cerrahi olarak rezeke edilen cilt dokusunu toplayın ve daha sonraki işlemler için steril forseps kullanarak hemen steril bir Petri kabına yerleştirin.
4. Ameliyat merkezinde veya poliklinik ofisindeyken, Şekil 1A'da gösterildiği gibi, önceden otoklavlanmış forsepslerle cildi inceleyerek eksize edilen doku içindeki tünelleri tanımlayın.
5. Doku eksizyonundan hemen sonra tanımlanan tünelin tam kalınlıktaki derisinden 6 mm'lik punch biyopsileri alın ve daha ileri analizler için anaerobik bakteri türlerinin hayatta kalmasını optimize etmek için anaerobik sistem taşıma cam şişelerinde indirgeyici ajanlarla yarı katı tamponlu ortama daldırın.
6. Anaerobik şişelerdeki tünel dokusunu buz üzerindeki laboratuvara taşıyın.
7. Örnek belgeleri aşağıda açıklandığı gibi gerçekleştirin.
   1. İşlem gününde, herhangi bir kişisel tanımlayıcı olmadan demografik özellikler, yaş, kendi bildirdiği etnik köken/ırk ve mevcut ilaçlar dahil olmak üzere hasta bilgilerini toplayın. Rezeke edilen dokunun vücut bölgeleri bir vücut çizelgesine eşlik eder, çünkü HS tünelleri birden fazla vücut bölgesinde oluşabilir. Doku işlemeden önce ve sonra numunenin her iki tarafından eksize edilen dokunun fotoğraflarını çekin ve bir tünelden oluşturulan biyopsinin yerini belgeleyin. Laboratuvara vardıklarında kodlanmış doku örneklerini herhangi bir kişisel tanımlayıcı olmadan elektronik ve güvenli bir veri tabanına kaydeder.

2. HS cilt işleme

1. Kurulum ve kaplama
   1. Laboratuvar önlüğü ve eldiven giyin ve kontaminasyonu önlemek için saçları bağlayın. Kanamisin ve Vankomisin (LKV) agarlı Laked Brucella Kan agarı, Triptikaz Soya agar (TSA II) %5 Koyun Kanı (SB) agar, Beyin Kalp İnfüzyonu (BHI) ve Feniletil alkol agar (PEA) dahil olmak üzere önceden ısıtılmış kan agar plakaları% 5 SB agar ile 37 ° C'ye kadar bir inkübatörde 10 dakika. Mendil işlemeden önce biyogüvenlik kabinini %70 etanol ile temizleyin.
   2. Agar plakaları ısıtıldıktan sonra, plakanın tabanını veya yan tarafını kodlanmış numune adı ve tarihi ile etiketleyin. Otoklavlanmış forsepsleri, neşterleri, önceden sterilize edilmiş aşılama halkalarını ve agar plakalarını biyogüvenlik kabinine yerleştirin.
   3. 6 mm'lik punch biyopsisini, forsepsleri ortama batırarak steril forseps ile anaerobik taşıma şişesinden çıkarın. Steril bir neşter kullanarak dokuyu her biri yaklaşık 1 mm² olan küçük parçalar halinde hızlıca doğrayın. Dokuyu 500 μL Güçlendirilmiş Clostridial ortam (RCM) içeren steril bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin ve kısaca girdap yapın.
      NOT: Numuneler uzun süre aerobik ortama maruz kalacağı için homojenizasyon kullanılmamıştır, bu da işlem sırasında ek havalandırmaya ve potansiyel anaerobik bakteri kaybına yol açabilirdi.
   4. Yeni bir steril döngü kullanarak, bakteriyel organizmalar içeren doku süspansiyonunun TSA II %5 SB, LKV, %5 SB ile bezelye ve BHI agar plakaları üzerine tekrarlanan kadran çizgisini gerçekleştirin.
   5. Kalan doğranmış doku süspansiyonunu kullanarak, bir kriyotüpe %20 v/v steril gliserol ve %80 v/v doku süspansiyonu ekleyerek gliserol stokları yapın. Gliserol stoklarını 80 °C'de saklayın. İzole edilen bakterilerin sınırlı canlılığı durumunda, izolasyonu tekrarlamak için doku stokları kullanılabilir.
   6. Tüm plakaları 37 °C'de bir CO₂ paketi ile çevrili anaerobik bir odaya inkübatöre yerleştirin. Plakaları her 2-3 günde bir kontrol edin, kaplamadan 7-14 gün sonra anaerobların büyümesini bekleyin. Plakaları fotoğraflayarak koloni morfolojilerini belgeleyin.
2. Doku bankacılığı
   1. Daha büyük bir doku örneğinin tam tüneli yakalama olasılığı daha yüksek olduğundan, Formalin Sabit Parafin Gömülü (FFPE) örneği ve histolojik değerlendirme için tünelden ve tünelden uzakta ek tam kalınlıkta deri örnekleri toplamak için 8 mm'lik bir punch biyopsisi kullanın.
   2. DNA (snap dondurulmuş), RNA (daha sonra RNA'da) ve protein izolasyonu (snap frozen) için ek 6 mm'lik punch biyopsilerini koruyun.
3. Koloni bakımı
   1. Orijinal plakalarda koloniler gözlemlendikten sonra, plakaları fotoğraflayın ve farklı koloni morfolojisini not edin¹⁷. Genel olarak, 10-15 farklı koloni morfolojisi tahmin edin (bkz. Şekil 1).
   2. %5 SB ve TSA II %5 SB agar plakaları ile önceden ısıtılmış LKV, BHI, PEA hazırlayın (Malzeme Tablosu). Her plaka etiketini numune kimliği, biyopsinin yeri ve tarih ile etiketleyin.
   3. Steril bir pipet ucu kullanarak, tek bir koloniyi alın ve tespit edildiği aynı tip plaka üzerinde zikzak hareketlerle çizin. Ardından, 16s rDNA PCR amplifikasyonu için bir şablon olarak koloni ile aynı pipet ucunu kullanarak aşağıdaki adımları izleyin.
   4. Yeni bir steril pipet ucu ve orijinal plakadan farklı morfolojiye sahip farklı bir tekil koloni ile tüm agar plakalarından seçilen kolonileri kullanarak adım 2.3.3'ü tekrarlayın. Yine, çizgilemeden hemen sonra, PCR amplifikasyonu için bir şablon sağlayacağından, pipet ucunu kalan koloniyle birlikte özel bir PCR plakası kuyusuna daldırmak için kullanın.
   5. Her bir farklı koloni için 2.3.3-2.3.4 adlarını, dört tip agar plakasının tümünde spesifik morfolojilere sahip tüm koloniler çizilene ve karşılık gelen PCR kuyucukları aynı anda aşılanana kadar tekrarlayın.
   6. Yeni kaplanmış agar plakalarını inkübatörde 37 °C'de bir CO₂ paketi ile çevrili anaerobik bir odada saklayın. Koloniler büyüdükten sonra, bakteri stoklarını korumadan önce izole edilen koloninin saflığından emin olun (aşağıya bakınız). Kaplanmış kolonilerde homojenlik yoksa, adım 2.3.3'ü tekrarlayın. Koloni büyümesine bağlı olarak, koloniler görünüşte homojen olana kadar her 4-5 günde bir yeniden kaplama işlemini gerçekleştirin.
4. 16s rDNA koloni amplikon dizilimi ile bakteri türlerinin tanımlanması
   1. Koloni başına toplam 25 μL hacim için oyuk başına 2,5 μL 10 μM 16S rDNA V1-V3 ileri (5' AGAGTTTGATTCCTGGCTCAG-3') ve ters primerler (5' AGAGTTTGATTCCTGGCTCAG-3'; 10 μM), 12,5 μL 2x Master Mix polimeraz ve 10 μL mikrobiyal DNA içermeyen sudan oluşan bir ana karışıma sahip bir PCR plakası hazırlayın.
   2. Seçilen tüm kolonilerden, negatif kontrolden (şablon yok) ve pozitif kontrolden amplifikasyon için gereken bir PCR ana karışımının hacmini hesaplayın - herhangi bir laboratuvar suşu kullanılabilir; yaygın olarak Staphylococcus aureus USA300 kullanıyoruz.
   3. Kontaminasyonu önlemek için biyogüvenlik kabinine kuyuları kaplayan bir PCR plakası getirin. Kaplama için steril bir pipet ucundan tek bir koloni kullanın. Önceden doldurulmuş ana karışım ile belirlenen kuyucuğa titiz bir şekilde girerek koloniyi hemen yeniden askıya alın. PCR için hem alt kültürleme hem de numune alma için aynı pipet ucunu kullanın.
   4. Tüm tekil HS kolonileri ve pozitif kontrol için adım 2.4.3'ü tekrarlayın.
   5. PCR'yi aşağıdaki protokolle çalıştırın: Seçilen koloniyi parçalamak için gereken ilk denatürasyon için 5 dakika boyunca 95 °C, ardından 15 saniye boyunca 95 °C'lik 40 döngü, 1 dakika boyunca 54 °C, son 4 °C döngünün kullanımı isteğe bağlıdır. Aynı program ayarlarıyla bir termosiklatör de kullanılabilir.
   6. 311 bp olması beklenen amplikonun boyutunu doğrulamak için amplifiye edilmiş qPCR ürünleri ile jel elektroforezi çalıştırın (Şekil 2). Üreticinin talimatlarına göre PCR saflaştırma kiti ile başarılı bir şekilde amplifiye edilmiş 16s rDNA fragmanını saflaştırın.
   7. 16S rDNA V1-V3 ileri ve geri primerleri kullanarak 16S ribozomal RNA Sanger dizilimi için saflaştırılmış PCR ürününü gönderin.
5. Bakteri stokları
   NOT: Titiz anaeroblar, agar plakaları üzerindeki sınırlı canlılıkları ile bilinir.
   1. Tür kimliğini doğrulayacak sıralama sonuçlarını elde etmeden önce suş korumasını sağlamak için, tek bir koloniden agar plakaları oluşturun ve stoklar oluşturmak için saflığı onaylayın. Sıvı ortamdaki büyüme koşullarının optimizasyonuna paralel olarak doğrudan agar plakasından stoklar oluşturun.
   2. Stoku adım 2.3'te oluşturulan plakadan hazırlamak için, mümkün olduğunca çok sayıda homojen koloni almak için 6 mm'lik bir steril aşılama halkası kullanın. Daha sonra, kriyotüplerde %20 steril gliserol ile 800 μL RCM'de bakterileri kuvvetlice yeniden süspanse edin ve bir bakteri stoğu oluşturmak için -80 °C'de saklayın.
      NOT: Bu adım, verileri dizileyerek karakterizasyon elde etmeden önce titiz patojenlerin zamanında korunmasını sağlar.
   3. Suşun sınıflandırması onaylandıktan sonra sıvı kültürdeki büyümenin optimizasyonunu ve tek bir koloniden stok üretimini gerçekleştirin.

Bu çalışmada, HS tünellerinden anaerobik bakterilerin izolasyonu ve karakterizasyonu için bir protokol tanımlanmıştır. Bu protokol, HS'nin patogenezine mikrobiyal katkıyı anlamamızı artırmak için in vitro, ex vivo ve in vivo cilt enfeksiyonu modellerini kullanarak bu bakterilerin işlevini ve virülansını test etme potansiyeli yaratması açısından yeni ve dikkate değerdir. İlk olarak, rezeke edilmiş deriden tüneller steril forseps ile incelenerek tanımlanmıştır (Şekil 1A). Tünelleri nodüllerden ve apselerden ayırt ettik, çünkü ikincisi cilt yüzeyinin altına bağlanmaz. Tünellerden 6 mm tam kalınlıkta punch biyopsileri alın ve bunları ağırlıklı olarak Porphyromonas sp. ve Prevotella sp. gibi Gram-negatif bakterileri seçmek için LKV agar kullanan bakteri kültürleri için anaerobik koşullar altında koruyun. TSA II %5 SB agar plakaları, Peptoniphilus sp. ve Streptococcus dahil olmak üzere hem Gram-negatif hem de Gram-pozitif bakterilerin büyümesine izin verir Sp. Elde edilen koloniler, hemoliz bölgesi olan veya olmayan farklı renkler (örneğin siyah, sarı, beyaz vb.), boyutlar ve şeffaflık dahil olmak üzere morfolojilerde farklıdır (Şekil 1B). 3 gün içinde büyüyen kolonilerin fakültatif anaerobları temsil etme olasılığı daha düşüktür ve genellikle Staphylococcus ve Corynebacterium türlerini içerir. Anaeroblar, 7-14 günlük büyümeden sonra ortaya çıkabilir ve genellikle pigmentli veya yarı saydam çok küçük kolonilerle ortaya çıkabilir. Bu nedenle, ilk kaplamadan sonra 2-4 gün içinde erken ortaya çıkan koloniler karakterize edilebilir ve korunabilir, ancak bunlar genellikle tünele özgü mikrobiyomu temsil etmeyen türlerdir ve sıklıkla yüzeysel deriden ve tünelden farklı nodüllerden izole edilir. Amplikon dizilimi kullanılarak izole edilen ve sınıflandırılan temsili zorunlu ve fakültatif anaerobik türler arasında Prevotella sp, Peptoniphilus sp, Porphyromonas sp, Streptococcus anginosus, Staphylococcus lugdunensis, Parvimonas micra, Proteus mirabillis ve Actinotignum schaalii bulunur. Tünel yapılarını içermeyen (tünelden uzakta) HS derisinden bakteri izolasyonu da her iki doku kaynağındaki farklılıkları tam olarak belirleyebileceği ve tünele özgü bakterilerin seçimini kolaylaştırabileceği için önemlidir. Daha da önemlisi, prosedürün sterilite kontrolü esastır ve büyüme sağlamamalıdır.

Histoloji aynı zamanda klinik olarak tanımlanmış tünellerin doğrulanması olarak da hizmet etti, çünkü HS morfolojisi bireysel numuneler içinde bile karmaşık ve oldukça değişkendir¹⁸. Tünel histolojisi, daha önce tarif edilen literatür¹² ile tutarlı olarak, mevcut olduğunda, üstteki yüzey epiteline benzeyen lümende değişken epitelizasyon gösterdi (Şekil 3). Lümende, HS tünellerinin¹² ayırt edici özelliği olan sağlam iltihabı yansıtan yoğun enflamatuar infiltrasyon ile birlikte bakteri bağlanması için bir yüzey görevi görebilen keratin açısından zengin malzeme de bulundu. Bazı örneklerde, tünel epiteli de lümen boyunca kalınlaşmış doku yamaları olarak görünen büyük ölçüde görüntülendi. Birden fazla 8 mm tam kalınlıkta zımbaların toplanması mümkündü ve tüm tünelin ve çevresindeki yapıların yakalanmasına izin verdiği için temsili histolojik değerlendirme sağladı (Şekil 3).

Şekil 1: HS tünellerinden mikrobiyal suşların izolasyonu. (A) Steril forseps ile sondalama yoluyla deri örneğinde bir tünel tanımlandı. (B) Anaerobik bir taşıma şişesinde taşınan tünel dokusundan çizgili temsili kan agar plakaları gösterilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Temsili 16S rDNA amplikon jel elektroforezi. Numune 1-6, jel elektroforezi ile analiz edilen farklı bakteri kolonilerinden elde edilen 16S rDNA PCR ürünlerini temsil eder ve her şerit benzersiz bir koloniye karşılık gelir. Negatif kontrol, PCR reaksiyonunun özgüllüğünü doğrulayan DNA içermez. Spesifik 16S rDNA bantlarının varlığı, bakteri kolonilerinden başarılı bir amplifikasyonu gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Epitelize tüneli gösteren temsili histoloji. Siyah kesikli çizgi, tünel lümenini özetler; beyaz kesikli çizgi, tünel epitelini ana hatlarıyla belirtir; Mavi çizgi, yüzeysel cilt, epidermis ve dermis arasındaki bazal zarı gösterir. Ölçek çubuğu = 500 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bu çalışmada, HS tünellerinde bakteri kolonize eden bakterilerin izole edilmesi ve bakımı için yeni bir yöntem sunulmaktadır. Bu tekrarlanabilir yöntem, sadece bu patolojik yapılarda bulunan suşların derinlemesine karakterizasyonuna izin vermekle kalmayacak, aynı zamanda HS patogenezinde spesifik mikropların rolünü araştıran sonraki fonksiyonel çalışmaları da mümkün kılacaktır. Protokolün kritik adımları, HS tünellerinden canlı titiz mikroorganizmaların korunmasını kolaylaştıran anaerobik ortamda doku toplama ve taşımayı içerir. Herhangi bir çalışmada olduğu gibi, hastaların çeşitli çevresel maruziyetleri, hijyenik uygulamalar, ilaçlar, hastalığın şiddeti ve komorbiditeleri gibi dokunun mikrobiyomunu etkileyebilecek cilt dezenfektanları ve lokal anestezi kullanımı gibi cerrahi prosedürlerle ilişkili olanlar da dahil olmak üzere sınırlamalar devam etmektedir¹⁹. Ek olarak, lazer prosedürü sırasında üretilen ısının mikrobiyal canlılığı etkileyebileceğini kabul ederek, bakteriler HS dokusundan eksizyon bölgesinden uzakta izole edildi ve mikrobiyom bileşimi üzerindeki potansiyel etkiden kaçınıldı. HS'li hastalar ayrıca sıklıkla topikal ve/veya sistemik antibiyotiklerin yanı sıra cilt kolonizasyonunu etkileyebilecek immünosupresan ilaçlarla tedavi edilir²⁰. Bu faktörler, numune toplama ve işlemede^{standardizasyonu 18} daha da önemli hale getirmektedir. Ayrıca bakterilerin belirli bir yüzdesinin kültürlenemez olduğunu da biliyoruz. Bununla birlikte, protokoller, HS mikrobiyom çalışmalarında tanımlanan en temsili türleri izole etmek için optimize edilmiştir. Bulgularımız, bu çalışmada izole edilen HS tünellerinden gelen bakteriler Prevotella sp, Peptoniphilus sp, Porphyromonas sp, Staphylococcus lugdunensis, Streptococcus anginosus, Parvimonas micra, Proteus mirabillis ve Actinotignum schaalii içerdiğinden, HS tünelleri ^6,7,8 üzerindeki önceki mikrobiyom çalışmaları ile uyumludur. Ek olarak, DNA izolasyonu için korunan doku, metagenomik veya amplikon dizileme yaklaşımı ile mikrobiyom çalışmaları ile doğrulama için kullanılabilir. Bu standartlaştırılmış yaklaşımla, HS'de gelecekteki mikrobiyom çalışmalarının doku koleksiyonunu ve tekrarlanabilirliğini de iyileştirmeyi umuyoruz.

Açıklanan yöntem, konakçı-patojen etkileşim çalışmaları da dahil olmak üzere, HS patojeninin hastalık patogenezinin çeşitli yönlerine katkılarını daha iyi anlamamız için zemin hazırlar. Son çalışmalar, insan keratinositlerinin HS ^12,13'te tanımlanan baskın türlerden ticari olarak temin edilebilen ATCC suşlarına tepkisini karakterize etmiştir. Bununla birlikte, kullanılan ATCC suşları, HS dokusundan ziyade balgam, serviko-fasiyal lezyonlar ve ampiyemlerden izole edildi ve insan durumunu, özellikle HS tünellerini temsil edenleri taklit eden daha güvenilir HS modellerine olan ihtiyacı vurguladı²¹. Bu yöntem aynı zamanda HS tünellerinden izole edilen bakteri suşlarının bankalanmasını mümkün kılar, bu da daha büyük ölçekli fonksiyonel testleri kolaylaştırma ve HS tünellerinin gelişimi ve ilerlemesinde patojenlerin rollerini aydınlatma potansiyeline sahiptir. Daha da önemlisi, tünel patojenlerinin izolasyonu, hastalık alevlenmelerini tedavi etmek için doksisiklin ve klindamisin gibi topikal ve sistemik antibiyotiklerin sık kullanımı bağlamında bilinen antimikrobiyal duyarlılığın ve antibiyotik direncinin prevalansının daha fazla değerlendirilmesini de sağlar²². Tünel patojenleri ayrıca biyolojik tedaviye değişken hasta yanıtına da katkıda bulunabilir¹⁴. Bu nedenle, antibiyotik kullanımını daraltmak için tedavi seçimini optimize etmek ve patojene özgü tedavilerin geliştirilmesi de dahil olmak üzere, HS tünel patojenlerini kullanan çalışmalar için büyük bir translasyon potansiyeli vardır, böylece antibiyotik direnci riskini azaltır. Ayrıca, mikrobiyomun HS'deki bileşimini analiz etmek, hastalığın ilerlemesini ve nüks risklerini değerlendirmek için tanısal ve prognostik araçlarda iyileştirmelere izin verebilir. Özetle, daha ileri karakterizasyon ve fonksiyonel çalışmalar için HS tünellerinden bakterileri izole etmek ve korumak için pratik ve tekrarlanabilir bir yöntem sunduk.

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması bildirmemektedir.

Bu çalışma R01AR083385 (IP, MTC, HLT), P50MD017347 (TG, IP, HLT) ve HS Foundation Danby araştırma bursu (TG) tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma ayrıca Miami Üniversitesi Miller Tıp Fakültesi Analitik Görüntüleme Çekirdek Tesisi'ndeki VS120 Slayt Tarayıcı evi için NIH hibesi 1S1OD023579-01 ile desteklenmiştir.