从化脓性汗腺炎隧道中分离微生物的综合方法

我们展示了一种从化脓性汗腺炎患者切除的组织中的皮肤窦道（隧道）中成功分离苛养和厌氧生物的方法。

化脓性汗腺炎 （HS） 是一种使人衰弱的疾病，其特征是疼痛的结节和脓肿，进展到皮肤真皮层内的窦道（隧道），引起明显的不适、恶臭的分泌物、毁容、挛缩和疤痕，严重降低生活质量。HS 与皮肤微生物组的改变有关，影响免疫调节和皮肤对有害细菌的防御。尽管 HS 微生物组很普遍，但它对疾病病理学的贡献和对治疗反应的有限反应在很大程度上仍然未知。迄今为止，对 HS 组织的多项 16S rRNA 测序研究仅实现了属水平的粒度，确定了革兰氏阴性厌氧菌的增加和皮肤共生菌的减少。更深入地了解 HS 患者的微生物菌群失调对于优化治疗策略至关重要。这需要一种双管齐下的方法来评估 HS 微生物组，包括分离细菌种类，这些种类在专注于皮肤病的转化研究中往往没有得到充分利用。从 HS 组织中分离出单个微生物对于阐明细菌在 HS 发病机制中的作用至关重要。在这里，我们重点介绍了从 HS 隧道组织中成功分离厌氧病原体的可重复方法，为了解细菌在 HS 中的作用提供了初始和最关键的一步。这种方法为针对性研究微生物对 HS 的贡献以及开发更有效、个性化的治疗策略来解决这种慢性病的复杂微生物负担铺平了道路。

化脓性汗腺炎 （HS） 是一种常见的皮肤病，其特征是结节和脓肿进展到皮肤真皮层和皮下层内形成的窦道（隧道），引起剧烈疼痛，产生脓性分泌物、毁容和使人衰弱的社会心理后遗症 ^1,2。HS 不成比例地影响女性和有色人种皮肤的个体，通常出现在青春期晚期或成年早期²。这种疾病的严重身体症状与其深刻的社会心理影响（包括抑郁、焦虑和社会孤立）相结合，这会严重降低生活质量³。在疾病晚期形成的 HS 隧道显着降低了患者对目前批准的生物疗法的反应几率，手术切除仍然是唯一的治疗方法 ^4,5。

多项研究表征了与 HS 隧道相关的微生物组，显示厌氧病原体的普遍存在和皮肤共生体的丰度降低 ^6,7,8，^最近的研究确定了隧道中的卟啉单胞菌属（I 型）和普雷沃氏菌属 （IV） 等属⁹.另一项研究发现 HS 微生物组随组织采样深度的变化，证实了隧道组织中微生物组成的独特性¹⁰。此外，菌群失调已被证明会影响 HS 的免疫反应，进一步暗示微生物在疾病发病机制中的作用 11,12,13,14。尽管正在使用克林霉素、利福平和四环素类药物进行长期全身抗生素治疗，并且已显示受影响患者的引流隧道数量减少^15,16，^但 HS 中抗生素耐药厌氧病原体的数据仍然未知。到目前为止，尚未报道从 HS 隧道中分离细菌菌株，这限制了对新型抗菌治疗的研究和对病原体对 HS 疾病发病机制贡献的深入评估。病原体分离方法的标准化不仅有助于真正了解细菌在 HS 发病机制中的作用，而且还允许转化为更有针对性和改进的干预措施。

在这里，我们重点介绍了一种从 HS 隧道组织中成功分离微生物的方法。分离单个细菌种类是了解它们在 HS 病理学中的作用的关键初始步骤。这种方法为针对微生物对 HS 的贡献以及开发更有效、个性化的治疗策略来解决这种慢性病中的细菌病原体铺平了道路。

该协议已获得迈阿密大学机构审查委员会 （IRB） 的批准（协议 #20200187）。在事先讨论研究后，从诊断患有 HS 隧道的患者（n = 18，平均年龄±标准差 = 30.9 ± 9.4,12 名女性，6 名男性）和/或其法定监护人获得知情同意，以允许解决任何问题或问题。

1. 患者样本采集

1. 在处理切除的组织之前，请采取严格的无菌预防措施，以最大限度地降低污染风险。处理组织的个人应穿着实验室外套、口罩和手术帽，并使用无菌手套和无菌器械处理组织。
2. 为了无菌控制，在处理组织之前，将预高压灭菌的镊子浸入厌氧运输瓶中（材料表）。
3. 从诊断为 HS 隧道的患者的受影响区域收集皮肤组织，通过手术刀或 CO₂ 激光手术切除，并立即使用无菌镊子将其放入无菌培养皿中进行进一步处理。
4. 在手术中心或门诊办公室时，通过用预高压灭菌的镊子探查皮肤来识别切除组织内的隧道，如图 1A 所示。
5. 组织切除后立即通过已识别隧道的全层皮肤进行 6 mm 穿刺活检，并浸入厌氧系统中含有还原剂的半固体缓冲培养基中运输玻璃瓶，以优化厌氧细菌物种的存活以进行进一步分析。
6. 将厌氧瓶中的隧道组织运送到冰上实验室。
7. 如下所述执行示例文档。
   1. 在手术当天，收集患者信息，包括人口统计数据、年龄、自我报告的民族/种族和当前药物，不要提供任何个人标识符。切除组织的体位伴随着体图，因为 HS 隧道可能发生在多个体位。在组织处理之前和之后，从样本的两侧拍摄切除的组织照片，记录隧道生成的活检的位置。到达实验室后，将编码的组织样本记录在电子、安全的数据库中，不带任何个人标识符。

2. HS 皮肤加工

1. 设置和电镀
   1. 穿上实验服和手套，并扎好头发以避免污染。预热血琼脂平板，包括含卡那霉素和万古霉素 （LKV） 琼脂的 Laked 布鲁氏菌血琼脂、胰蛋白酶大豆琼脂 （TSA II） 5% 羊血 （SB） 琼脂、脑心输液 （BHI） 和苯乙醇琼脂 （PEA） 含 5% SB 琼脂在 37 °C 培养箱中培养 10 分钟。在处理组织之前，用 70% 乙醇清洁生物安全柜。
   2. 琼脂平板加热后，用编码的样品名称和日期标记平板的底部或侧面。将高压灭菌的镊子、手术刀、预先消毒的接种环和琼脂板放入生物安全柜中。
   3. 将镊子浸入培养基中，用无菌镊子从厌氧运输瓶中取出 6 mm 穿刺活检。使用无菌手术刀将组织快速切成小块，每块约 1 mm² 。将组织放入含有 500 μL 增强型梭菌培养基 （RCM） 的无菌微量离心管中，并短暂涡旋。
      注意：未使用均质化，因为样品会长时间暴露在好氧环境中，这可能导致在此过程中产生额外的曝气和厌氧菌的潜在损失。
   4. 使用新的无菌定量环，将含有细菌生物的组织悬浮液重复象限划线到含有 5% SB 的 TSA II 5% SB、LKV、PEA 和 BHI 琼脂平板上。
   5. 使用剩余的切碎的组织悬浮液，通过在冷冻管中加入 20% v/v 无菌甘油和 80% v/v 组织悬浮液来制备甘油原液。将甘油原液储存在 80 °C。 在分离的细菌活力有限的情况下，可以使用组织原液重复分离。
   6. 将所有板放入 37 °C 的培养箱中，置于封闭有 CO₂ 包的厌氧室中。每 2-3 天检查一次板，预计在铺板后 7-14 天厌氧菌生长。通过拍摄板来记录菌落形态。
2. 组织库
   1. 使用 8 mm 穿刺活检通过隧道和远离隧道采集额外的全层皮肤样本，用于福尔马林固定石蜡包埋 （FFPE） 样本和组织学评估，因为较大的组织样本更有可能捕获整个隧道。
   2. 保留额外的 6 mm 穿刺活检，用于 DNA（快速冷冻）、RNA（稍后在 RNA 中）和蛋白质分离（快速冷冻）。
3. 菌落维护
   1. 在原始平板上观察到菌落后，拍摄板并注意不同的菌落形态¹⁷。通常，预计有 10-15 种不同的菌落形态（见 图 1）。
   2. 准备含有 5% SB 和 TSA II 5% SB 琼脂平板的预热 LKV、BHI、PEA（材料表）。用样本 ID、活检位置和日期标记每个板标签。
   3. 使用无菌移液器吸头，拾取单个菌落，并在检测到它的相同类型的板上以之字形运动划线。然后，使用带有菌落的相同移液器吸头作为 16 秒 rDNA PCR 扩增的模板，按照以下步骤作。
   4. 使用从所有类型的琼脂平板中选择的菌落重复步骤 2.3.3，使用新的无菌移液器吸头和与原始平板不同形态的不同单一菌落。同样，在划线后，立即使用移液器吸头将剩余的菌落浸入专用的 PCR 板孔中，因为这将为 PCR 扩增提供模板。
   5. 对每个不同的菌落重复步骤 2.3.3-2.3.4，直到所有四种类型的琼脂板中具有特定形态的所有菌落都已划线，并且同时接种了相应的 PCR 孔。
   6. 将新铺板的琼脂板储存在 37 °C 的培养箱中，置于封闭有 CO₂ 包的厌氧室中。一旦菌落生长，在保存细菌原液之前确保分离菌落的纯度（见下文）。如果铺板的菌落缺乏均匀性，请重复步骤 2.3.3。根据菌落生长情况，每 4-5 天进行一次重新铺板过程，直到菌落外观均匀。
4. 通过 16s rDNA 集落扩增子测序鉴定细菌种类
   1. 用由 2.5 μL 10 μM 16S rDNA V1-V3 正向 （5' AGAGTTTGATTCCTGGCTCAG-3'） 和反向引物（5' AGAGTTTGATTCCTGGCTCAG-3';10 μM）、12.5 μL 2x Master Mix 聚合酶和 10 μL 不含微生物 DNA 的水组成的预混液制备 PCR 板每孔，每个菌落总体积为 25 μL。
   2. 计算从所有选定菌落、阴性对照（无模板）和阳性对照中扩增所需的 PCR 预混液的体积 - 可以使用任何实验室菌株;我们通常使用 金黄色葡萄球菌 USA300。
   3. 将 PCR 板带到生物安全柜中，盖住孔以避免污染。使用无菌移液器吸头中的单个菌落进行电镀。立即用预填充预混液将菌落重悬至指定孔中，并严格旋转。使用相同的移液器吸头进行 PCR 的传代培养和采样。
   4. 对所有单一 HS 菌落和阳性对照重复步骤 2.4.3。
   5. 使用以下方案运行 PCR：95 °C 5 分钟进行初始变性以裂解所选菌落，然后进行 40 次循环，95 °C 持续 15 秒，54 °C 持续 1 分钟，使用最后的 4 °C 循环是可选的。热循环仪也可以使用相同的程序设置。
   6. 用扩增的 qPCR 产物进行凝胶电泳，以验证扩增子的大小，预计为 311 bp（图 2）。按照制造商的说明，使用 PCR 纯化试剂盒成功扩增 16s rDNA 片段。
   7. 使用 16S rDNA V1-V3 正向和反向引物发送纯化的 PCR 产物进行 16S 核糖体 RNA Sanger 测序。
5. 细菌原液
   注意：挑剔的厌氧菌以其在琼脂平板上的生存能力有限而闻名。
   1. 为了确保在获得测序结果之前保存菌株，从而确认物种身份，从单个菌落生成琼脂平板并确认纯度以生成原液。直接从琼脂平板生成原液，同时优化液体培养基中的生长条件。
   2. 要从步骤 2.3 中生成的板制备原液，请使用 6 mm 无菌接种环拾取尽可能多的均匀菌落。然后，在冻存管中用 20% 无菌甘油在 800 μL RCM 中大力重悬细菌，并将其储存在 -80 °C 以产生细菌原液。
      注意：此步骤可确保在通过测序数据获得表征之前及时保存苛刻的病原体。
   3. 一旦确认菌株的分类，对液体培养物中的生长进行优化，并从单个菌落生成原液。

在这项研究中，我们描述了一种从 HS 隧道中分离和表征厌氧菌的方案。该方案新颖且值得注意的是，它创造了使用 体外、 离体和 体内 皮肤感染模型测试这些细菌的功能和毒力的潜力，以增加我们对微生物对 HS 发病机制的贡献的理解。首先，我们通过用无菌镊子探查隧道来从切除的皮肤中识别隧道（图 1A）。我们将隧道与结节和脓肿区分开来，因为后者不连接在皮肤表面下。通过隧道取 6 mm 全层穿刺活检，并在厌氧条件下保存它们，以便使用 LKV 琼脂进行细菌培养，主要选择革兰氏阴性菌，例如 卟啉单 胞菌属和 普雷沃菌 属。TSA II 5% SB 琼脂平板允许革兰氏阴性和革兰氏阳性菌的生长，包括 嗜肽 菌属和 链球菌 sp.所得菌落在形态上是不同的，包括不同的颜色（例如，黑色、黄色、白色等）、大小和透明度，有或没有溶血区（图 1B）。在 3 天内生长的菌落不太可能代表兼性厌氧菌，通常包括 葡萄球菌 和 棒状杆菌 属。厌氧菌可在生长 7-14 天后出现，通常表现为非常小的菌落，有色或半透明。因此，可以表征和保留初始铺板后 2-4 天内早期出现的菌落，但这些通常是不代表隧道特异性微生物组的物种，并且经常从与隧道不同的浅表皮肤和结节中分离出来。使用扩增子测序分离和分类的代表性强制性和兼性厌氧菌种包括 Prevotella sp、Peptoniphilus sp、Porphyromonas sp、Streptococcus anginosus、 Staphylococcus lugdunensis、 Parvimonas micra、 Proteus mirabillis 和 Actinotignum schaalii。从不涉及隧道结构（远离隧道）的 HS 皮肤中分离细菌也很重要，因为它可以查明两个组织来源的差异并促进隧道特异性细菌的选择。重要的是，该程序的无菌控制是必不可少的，并且应该不会产生生长。

组织学还用作临床鉴定隧道的验证，因为 HS 形态复杂且即使在单个样本中也高度可变¹⁸。隧道组织学显示管腔中可变的上皮化，当存在时，类似于上覆的表面上皮，与先前描述的文献一致¹² （图 3）。在管腔中还发现了富含角蛋白的物质，这可能作为细菌附着的表面，以及密集的炎症浸润，反映了强烈的炎症，这是 HS 隧道的标志¹²。在一些样本中，隧道上皮也清晰可见，表现为沿管腔的增厚组织斑块。收集多个 8 mm 全层冲头是可行的，并且提供了具有代表性的组织学评估，因为它可以捕获整个隧道和周围结构（图 3）。

图 1：从 HS 隧道中分离微生物菌株。 （A） 通过用无菌镊子探测，在皮肤样本中鉴定出隧道。（B） 显示了代表性的血琼脂平板，从厌氧运输瓶中运输的隧道组织中划线。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2：代表性的 16S rDNA 扩增子凝胶电泳。 样品 1-6 代表通过凝胶电泳分析的不同细菌菌落的 16S rDNA PCR 产物，每个泳道对应一个独特的菌落。阴性对照不含 DNA，证实了 PCR 反应的特异性。特异性 16S rDNA 条带的存在表明细菌菌落成功扩增。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 3：显示上皮化隧道的代表性组织学。 黑色虚线勾勒出隧道管腔;白色虚线勾勒出隧道上皮;蓝线表示浅表皮肤表皮和真皮之间的基底膜。比例尺 = 500 μm。 请点击此处查看此图的较大版本。

在这项研究中，我们提出了一种分离和维持定植 HS 隧道的细菌的新方法。这种可重复的方法不仅可以深入表征这些病理结构中存在的菌株，而且还将使后续的功能研究能够探索特定微生物在 HS 发病机制中的作用。该方案的关键步骤包括组织收集和在厌氧培养基中的运输，这有助于从 HS 隧道中保存活的顽固微生物。与任何研究一样，局限性仍然存在，包括与外科手术相关的局限性，例如使用皮肤消毒剂和局部麻醉，这可能会影响组织的微生物组，患者的各种环境暴露、卫生习惯、药物、疾病严重程度和合并症也是如此¹⁹。此外，认识到激光手术过程中产生的热量会影响微生物活力，因此从远离切除部位的 HS 组织中分离出细菌，避免了对微生物组组成的潜在影响。HS 患者也经常接受局部和/或全身抗生素以及可能影响皮肤定植的免疫抑制药物治疗²⁰。这些因素使样本采集和处理的标准化¹⁸ 变得更加重要。我们还认识到，一定比例的细菌是不可培养的。然而，这些方案经过优化，可以分离出在 HS 微生物组研究中鉴定出的最具代表性的物种。我们的研究结果与之前对 HS 隧道 ^6,7,8 的微生物组研究一致，因为本研究中分离出的 HS 隧道中的细菌包括普雷沃菌属、嗜肽菌属、卟啉单胞菌属、路邓葡萄球菌、心绞痛链球菌、米氏细小单胞菌、奇异变形杆菌和沙利放线菌.此外，保存用于 DNA 分离的组织可用于微生物组研究的验证，通过宏基因组学或扩增子测序方法。通过这种标准化方法，我们还希望改善 HS 中未来微生物组研究的组织收集和可重复性。

所描述的方法为我们进一步了解 HS 病原体对疾病发病机制各个方面的贡献奠定了基础，包括宿主-病原体相互作用研究。最近的研究表征了人角质形成细胞对 HS 中鉴定的主要物种的市售 ATCC 菌株的反应^12,13。然而，使用的 ATCC 菌株是从痰液、宫颈面部病变和脓胸中分离的，而不是从 HS 组织中分离出来的，这突出表明需要更可靠的模拟人类状况的 HS 模型，特别是那些代表 HS 隧道的模型²¹。该方法还使得从 HS 隧道中分离的细菌菌株的储存成为可能，这有可能促进更大规模的功能测试并阐明病原体在 HS 隧道发展和发展中的作用。重要的是，分离隧道病原体还可以进一步评估抗菌药物敏感性和抗生素耐药性患病率，这在频繁使用局部和全身抗生素（如多西环素和克林霉素）治疗疾病发作的情况下是已知的²²。隧道病原体也可能导致患者对生物治疗的反应不同¹⁴。因此，使用 HS 隧道病原体的研究具有巨大的转化潜力，包括优化疗法选择和开发病原体特异性治疗方法以缩小抗生素使用范围，从而降低抗生素耐药性的风险。此外，分析 HS 中微生物组的组成可能有助于改进诊断和预后工具，以评估疾病进展和复发风险。总之，我们提出了一种实用且可重复的方法，用于从 HS 隧道中分离和维持细菌，以进行进一步的表征和功能研究。

作者报告没有利益冲突。

这项工作得到了 R01AR083385 （IP， MTC， HLT）、P50MD017347 （TG， IP， HLT） 和 HS 基金会丹比研究资助 （TG） 的支持。这项工作还得到了 NIH 拨款 1S1OD023579-01 的支持，用于迈阿密大学米勒医学院分析成像核心设施的 VS120 幻灯片扫描仪屋。