Комплексный подход к микробной изоляции из туннелей гнойного гидраденита

Мы демонстрируем метод успешной изоляции привередливых и анаэробных организмов из кожных синусовых ходов (туннелей) в тканях, иссеченных у пациентов с гнойным гидраденитом.

Гнойный гидраденит (ГС) — это изнурительное состояние, характеризующееся болезненными узелками и абсцессами, прогрессирующими в синусовые тракты (туннели) в дермальных слоях кожи, вызывая значительный дискомфорт, неприятные выделения, обезображивание, контрактуры и рубцы, которые серьезно снижают качество жизни. СГ связан с изменениями в микробиоме кожи, влияя на иммунную регуляцию и защиту кожи от вредных бактерий. Несмотря на распространенность, вклад микробиома HS в патологию заболевания и ограниченный ответ на лечение остаются в значительной степени неизвестными. На сегодняшний день в ходе многочисленных исследований секвенирования 16S рРНК в тканях ГС была достигнута только зернистость на уровне рода, выявлено увеличение количества грамотрицательных анаэробов и уменьшение кожных комменсалов. Более глубокое понимание микробного дисбактериоза у людей с СГ имеет важное значение для оптимизации стратегий лечения. Это требует двустороннего подхода к оценке микробиома HS, включая выделение видов бактерий, которые часто недостаточно используются в трансляционных исследованиях, посвященных кожным заболеваниям. Выделение отдельных микроорганизмов из тканей ГС имеет решающее значение для выяснения роли бактерий в патогенезе ГС. В этой статье мы выделяем воспроизводимые методы успешной изоляции анаэробных патогенов из туннельной ткани ГС, обеспечивая первый и наиболее важный шаг в понимании роли бактерий в ГС. Этот метод прокладывает путь к целенаправленным исследованиям микробного вклада в СГ и к разработке более эффективных, персонализированных стратегий лечения, направленных на устранение сложного микробного бремени этого хронического заболевания.

Гнойный гидраденит (ГС) является распространенным дерматологическим заболеванием, характеризующимся узелками и абсцессами, которые прогрессируют в синусовые тракты (туннели), образующиеся в дермальном и подкожном слоях кожи, вызывая значительную боль, вызывая гнойные выделения, обезображивание и изнурительные психосоциальные последствия ^1,2. СГ непропорционально поражает женщин и лиц с цветной кожей, обычно возникающей в позднем подростковом или раннем взрослом возрасте². Тяжелые физические симптомы этого состояния усугубляются его глубокими психосоциальными последствиями, включая депрессию, тревогу и социальную изоляцию, которые могут серьезно снизить качество жизни³. Туннели ГС, сформированные на поздней стадии заболевания, значительно снижают вероятность ответа пациентов на апробированную в настоящее время биологическую терапию, а хирургическое иссечение остается единственным подходом к лечению ^4,5.

Многочисленные исследования охарактеризовали микробиом, связанный с туннелями HS, показав преобладание анаэробных патогенов и снижение численности кожных комменсалов ^6,7,8, при этом недавние исследования выявили Porphyromonas spp. (тип I) и Prevotella spp. (IV) в туннелях, среди других родов⁹. В другом исследовании была обнаружена вариабельность микробиома HS в зависимости от глубины забора образца ткани, что подтверждает уникальность микробного состава в ткани туннеля¹⁰. Кроме того, было показано, что дисбиоз влияет на иммунный ответ при СГ, что еще больше указывает на роль микробов в патогенезе заболевания 11,12,13,14. Несмотря на ^{то, что} длительное системное лечение антибиотиками клиндамицином, рифампицином и тетрациклинами используется и показало снижение количества дренажных туннелей у пациентов^с ГС, данные об устойчивых к антибиотикам анаэробных патогенах при ГС остаются неизвестными. До сих пор не сообщалось об изоляции штаммов бактерий из туннелей HS, что ограничивает исследования новых антимикробных методов лечения и углубленную оценку вклада патогенов в патогенез заболевания HS. Стандартизация методов выделения патогенов не только способствовала бы истинному пониманию роли бактерий в патогенезе СГ, но и позволила бы перейти к более целенаправленным и усовершенствованным вмешательствам.

В этой статье мы расскажем о методе успешной изоляции микроорганизмов из туннельной ткани HS. Выделение отдельных видов бактерий является решающим, начальным шагом в понимании их роли в патологии СГ. Этот метод прокладывает путь к целенаправленным исследованиям микробного вклада в СГ и к разработке более эффективных, персонализированных стратегий лечения, направленных на борьбу с бактериальными патогенами при этом хроническом состоянии.

Этот протокол был одобрен Институциональным наблюдательным советом (IRB) при Университете Майами (протокол #20200187). Информированное согласие получают от пациентов (n = 18, средний возраст ± стандартное отклонение = 30,9 ± 9,4, 12 женщин, 6 мужчин) с диагнозом HS-туннели и/или их законных опекунов до начала процедуры после предварительного обсуждения исследований, чтобы можно было решить любые опасения или вопросы.

1. Забор образцов у пациента

1. Перед обработкой иссеченной ткани соблюдайте строгие стерильные меры предосторожности, чтобы свести к минимуму риск заражения. Человек, работающий с тканью, должен быть одет в лабораторный халат, маску для лица и хирургическую шапочку, а также использовать стерильные перчатки и стерильные инструменты для работы с тканью.
2. Для контроля стерильности перед обработкой ткани погрузите предварительно автоклавированные щипцы в анаэробный транспортный флакон (Таблица материалов).
3. Соберите кожную ткань, хирургически резецированную с помощью скальпеля или лазера CO₂ , из пораженных участков пациентов с диагнозом HS-туннели и немедленно поместите ее в стерильную чашку Петри с помощью стерильных щипцов для дальнейшей обработки.
4. Находясь в хирургическом центре или амбулаторном кабинете клиники, определите туннели в иссеченных тканях, прощупывая кожу предварительно автоклавированными щипцами, как показано на рисунке 1A.
5. Сразу после иссечения тканей проведите 6-миллиметровую пункционную биопсию через полнотолщину кожи идентифицированного туннеля и погрузите в полутвердую буферную среду с восстановителями в анаэробной системе транспортных стеклянных флаконов для оптимизации выживаемости анаэробных видов бактерий для дальнейшего анализа.
6. Транспортировка туннельной ткани в анаэробных флаконах в лабораторию на льду.
7. Выполните разработку образца документации, как описано ниже.
   1. В день процедуры соберите информацию о пациенте, включая демографические данные, возраст, этническую принадлежность/расу и принимаемые лекарства, без каких-либо личных идентификаторов. Участки тела резецированной ткани сопровождают карту тела, поскольку туннели HS могут возникать на нескольких участках тела. Сделайте фотографии иссеченной ткани с обеих сторон образца до и после обработки ткани, документируя местоположение биопсии, полученной из туннеля. По прибытии в лабораторию занесите закодированные образцы тканей без каких-либо персональных идентификаторов в электронную защищенную базу данных.

2. Обработка кожи HS

1. Настройка и нанесение покрытия
   1. Наденьте лабораторный халат и перчатки, а также завяжите волосы, чтобы избежать загрязнения. Предварительно подогреть кровяные агаровые тарелки, в том числе агар Laked Brucella с агаром Канамицин и Ванкомицин (LKV), Триптиказ Соевый агар (TSA II) 5% Овечья кровь (SB), Brain Heart Infusion (BHI) и Фенилэтиловый спиртовой агар (PEA) с 5% SB агаром до 37 °C в инкубаторе в течение 10 минут. Перед обработкой салфетки очистите шкаф биобезопасности с 70% этанолом.
   2. После того, как агаровые пластины нагреются, наклейте на основание или боковую сторону пластины закодированное название образца и дату. Поместите в шкаф биобезопасности автоклавные щипцы, скальпели, предварительно стерилизованные петли для инокуляции и агаровые пластины.
   3. Извлеките 6-миллиметровый пунш-биопсию из анаэробного транспортного флакона с помощью стерильных щипцов, погрузив щипцы в среду. Быстро измельчите ткань на небольшие кусочки, примерно по 1 мм² каждая, с помощью стерильного скальпеля. Поместите ткань в стерильную микроцентрифужную пробирку, содержащую 500 μл армированной клостридиальной среды (RCM), и кратковременно сделайте вихрь.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Гомогенизация не использовалась, потому что образцы подвергались воздействию аэробной среды в течение длительного периода времени, что могло привести к дополнительной аэрации во время процесса и потенциальной потере анаэробных бактерий.
   4. Используя новую стерильную петлю, выполните повторное полосирование квадрантной суспензии, содержащей бактериальные организмы, на агаровые планшеты TSA II 5% SB, LKV, PEA с 5% SB и BHI.
   5. Используя оставшуюся измельченную тканевую суспензию, сделать запасы глицерина, добавив в криопробирку 20% v/v стерильного глицерина и 80% v/v тканевой суспензии. Запасы глицерина хранятся при температуре 80 °C. В случае ограниченной жизнеспособности выделенных бактерий для повторения выделения можно использовать запасы тканей.
   6. Поместите все планшеты в инкубатор при температуре 37 °C в анаэробную камеру, закрытую пакетом CO₂ . Проверяйте пластины каждые 2-3 дня, ожидая роста анаэробов через 7-14 дней после нанесения покрытия. Документируйте морфологию колоний с помощью фотографирования пластин.
2. Хранение тканей
   1. Используйте 8-миллиметровую пункционную биопсию для сбора дополнительных образцов кожи на всю толщину через туннель и от него для образца с фиксированным парафином формалина (FFPE) и гистологической оценки, так как больший образец ткани с большей вероятностью захватит весь туннель.
   2. Сохраните дополнительные биопсии с точностью до 6 мм для ДНК (мгновенной заморозки), РНК (в РНК позже) и выделения белков (мгновенной заморозке).
3. Содержание колонии
   1. После того, как колонии будут замечены на оригинальных пластинах, сфотографируйте пластины и обратите внимание на четкую морфологию колоний¹⁷. В целом, можно предположить 10-15 различных морфологий колоний (см. рис. 1).
   2. Приготовьте предварительно подогретые пластины LKV, BHI, PEA с 5% SB и 5% SB агаровыми пластинами TSA II (Таблица материалов). Пометьте каждую табличку с указанием идентификатора образца, места проведения биопсии и даты.
   3. С помощью стерильного наконечника для пипетки возьмите одну колонию и проведите ею зигзагообразным движением по пластине того же типа, на которой она была обнаружена. Затем, используя один и тот же наконечник пипетки с колонией в качестве матрицы для ПЦР-амплификации 16s рДНК, выполните следующие действия.
   4. Повторите шаг 2.3.3, используя колонии, выбранные из всех типов агаровых планшетов, с новым стерильным наконечником пипетки и другой отдельной колонией, морфологией которой отличается от исходной пластины. Опять же, сразу после нанесения полос, используйте наконечник пипетки с оставшейся колонией, чтобы погрузить его в специальную лунку для ПЦР-планшета, так как это обеспечит шаблон для амплификации ПЦР.
   5. Повторяйте шаги 2.3.3-2.3.4 для каждой отдельной колонии до тех пор, пока все колонии со специфической морфологией во всех четырех типах агаровых пластин не будут проточены полосами и соответствующие лунки ПЦР не будут одновременно инокулированы.
   6. Храните только что покрытые агаровые пластины в инкубаторе при температуре 37 °C в анаэробной камере, закрытой пакетом CO₂ . Как только колонии вырастут, обеспечьте чистоту изолированной колонии, прежде чем сохранять бактериальные запасы (см. ниже). Если пластинчатые колонии не имеют однородности, повторите шаг 2.3.3. Выполняйте процесс повторного покрытия каждые 4-5 дней, в зависимости от роста колонии, пока колонии не станут однородными по внешнему виду.
4. Идентификация видов бактерий с помощью секвенирования колонии 16s рДНК с помощью ампликона
   1. Приготовьте ПЦР-планшет с мастер-смесью, состоящей из 2,5 мкл 10 мкМ 16S рДНК V1-V3 прямого (5' AGAGTTTGATTCCTGGCTCAG-3') и обратного праймеров (5' AGAGTTTGATTCCTGGCTCAG-3'; 10 μM), 12,5 мкл 2x полимеразы Master Mix и 10 мкл воды без микробной ДНК на лунку общим объемом 25 мкл на колонию.
   2. Рассчитать необходимый для амплификации объем мастер-смеси ПЦР из всех выбранных колоний, отрицательный контроль (без шаблона) и положительный контроль - можно использовать любой лабораторный штамм; мы обычно используем Staphylococcus aureus USA300.
   3. Поднесите ПЦР-планшет в шкаф биобезопасности, накрыв лунки во избежание загрязнения. Для нанесения покрытия используйте одну колонию из стерильного наконечника для дозатора. Немедленно восстановите суспендию колонии с помощью тщательного закручивания в предназначенную лунку с предварительно заполненной мастер-смесью. Используйте один и тот же наконечник для пипетки как для субкультивирования, так и для отбора проб для ПЦР.
   4. Повторите шаг 2.4.3 для всех единичных колоний HS и положительного контроля.
   5. Провести ПЦР по следующему протоколу: 95 °C в течение 5 мин для начальной денатурации, необходимой для лизирования выбранной колонии, затем 40 циклов 95 °C в течение 15 с, 54 °C в течение 1 мин, использование заключительного цикла 4 °C не является обязательным. Термоамплификатор также можно использовать с теми же настройками программы.
   6. Запустите гель-электрофорез с амплифицированными продуктами количественной ПЦР для проверки размера ампликона, который, как ожидается, составит 311.о. (Рисунок 2). Компания Purify успешно амплифицировала фрагмент 16s рДНК с помощью набора для очистки ПЦР в соответствии с инструкциями производителя.
   7. Отправьте очищенный продукт ПЦР на секвенирование 16S рибосомальной РНК по Сэнгеру с использованием прямых и обратных праймеров 16S рДНК V1-V3.
5. Бактериальные запасы
   ПРИМЕЧАНИЕ: Привередливые анаэробы известны своей ограниченной жизнеспособностью на агаровых пластинах.
   1. Чтобы обеспечить сохранность штамма до получения результатов секвенирования, которые подтвердят видовую идентичность, получить агаровые пластины из одной колонии и подтвердить чистоту для получения запасов. Создание заготовок непосредственно из агаровой пластины параллельно с оптимизацией условий роста в жидких средах.
   2. Чтобы приготовить подвой из планшета, созданного на шаге 2.3, используйте стерильную петлю для инокуляции диаметром 6 мм, чтобы собрать как можно больше однородных колоний. Затем энергично ресуспендируйте бактерии в 800 мкл RCM с 20% стерильным глицерином в криопробирках и храните их при температуре -80 °C для создания бактериального запаса.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг обеспечивает своевременное сохранение привередливых патогенов до получения характеристик с помощью данных секвенирования.
   3. Проведите оптимизацию роста ликвидной культуры и генерирование подвоев из одной колонии после подтверждения классификации штамма.

В этом исследовании мы описываем протокол выделения и характеристики анаэробных бактерий из туннелей HS. Этот протокол является новым и примечательным тем, что создает потенциал для проверки функции и вирулентности этих бактерий с использованием моделей кожных инфекций in vitro, ex vivo и in vivo для улучшения нашего понимания микробного вклада в патогенез СГ. Во-первых, мы идентифицировали туннели из резецированной кожи, прощупав их стерильными щипцами (рис. 1A). Мы отличали тоннели от узелков и абсцессов, так как последние не соединяются под поверхностью кожи. Проведите пункционную биопсию толщиной 6 мм через туннели и сохраните ее в анаэробных условиях для бактериальных культур с использованием агара LKV для преимущественно отбора грамотрицательных бактерий, таких как Porphyromonas sp. и Prevotella sp. Агаровые пластины TSA II 5% SB позволяют выращивать как грамотрицательные, так и грамположительные бактерии, включая Peptoniphilus sp. и Streptococcus сп. Полученные колонии различаются по морфологии, включая различные цвета (например, черный, желтый, белый и т. д.), размеры и прозрачность, с зоной гемолиза или без нее (рис. 1B). Колонии, которые вырастают в течение 3 дней, с меньшей вероятностью представляют собой факультативные анаэробы и обычно включают виды Staphylococcus и Corynebacterium . Анаэробы могут появиться через 7-14 дней роста, обычно в виде очень маленьких колоний, пигментированных или полупрозрачных. Таким образом, колонии, появляющиеся вскоре после первоначального закладки в течение 2-4 дней, могут быть охарактеризованы и сохранены, но обычно это виды, не представляющие специфического для туннеля микробиома, и часто выделяются из поверхностной кожи и узелков, отличных от туннеля. Репрезентативные обязательные и факультативные анаэробные виды, выделенные и классифицированные с помощью ампликонного секвенирования, включали Prevotella sp, Peptoniphilus sp, Porphyromonas sp, Streptococcus anginosus, Staphylococcus lugdunensis, Parvimonas micra, Proteus mirabillis и Actinotignum schaalii. Выделение бактерий из кожи HS без вовлечения туннельных структур (вдали от туннеля) также имеет важное значение, поскольку это может выявить различия в обоих источниках тканей и облегчить отбор специфических для туннельных бактерий. Важно отметить, что контроль стерильности процедуры имеет важное значение и не должен приводить к росту.

Гистология также послужила верификацией клинически идентифицированных туннелей, поскольку морфология HS сложна и сильно вариабельна даже в пределах отдельных образцов¹⁸. Туннельная гистология показала вариабельную эпителизацию в просвете, которая при наличии напоминала вышележащий поверхностный эпителий, что согласуется с ранее описанной литературой¹² (рис. 3). В просвете также был обнаружен богатый кератином материал, который может служить поверхностью для прикрепления бактерий, наряду с плотным воспалительным инфильтратом, отражающим сильное воспаление, что является отличительной чертой туннелей HS¹². В некоторых образцах туннельный эпителий также был грубо визуализирован, проявляясь в виде участков утолщенной ткани вдоль просвета. Сбор нескольких пуансонов толщиной 8 мм был возможен и обеспечил репрезентативную гистологическую оценку, поскольку позволил захватить весь туннель и окружающие структуры (Рисунок 3).

Рисунок 1: Выделение штаммов микроорганизмов из туннелей HS. (A) Туннель был идентифицирован в образце кожи путем зондирования стерильными щипцами. (B) Показаны репрезентативные кровяные агаровые пластины, взятые из туннельной ткани, транспортируемой в анаэробной транспортной пробирке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Репрезентативный электрофорез в ампликоновом геле 16S рДНК. Образцы 1-6 представляют собой продукты ПЦР 16S рДНК из различных бактериальных колоний, проанализированных с помощью гель-электрофореза, причем каждая полоса соответствует уникальной колонии. Отрицательный контроль не содержит ДНК, что подтверждает специфичность ПЦР-реакции. Наличие специфических полос 16S рДНК указывает на успешную амплификацию из бактериальных колоний. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Репрезентативная гистология с эпителизированным туннелем. Черная пунктирная линия очерчивает просвет туннеля; белой пунктирной линией обозначен туннельный эпителий; Синей линией обозначена базальная мембрана между поверхностным эпидермисом кожи и дермой. Масштабная линейка = 500 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

В этом исследовании мы представляем новый метод выделения и поддержания бактерий, колонизирующих туннели HS. Этот воспроизводимый метод позволит не только глубоко охарактеризовать штаммы, присутствующие в этих патологических структурах, но и провести последующие функциональные исследования, изучающие роль специфических микробов в патогенезе ГС. Важнейшие этапы протокола включают сбор и транспортировку тканей в анаэробных средах, что способствует сохранению жизнеспособных привередливых микроорганизмов из туннелей HS. Как и в любом исследовании, остаются ограничения, в том числе связанные с хирургическими процедурами, такими как использование дезинфицирующих средств для кожи и местная анестезия, которые могут влиять на микробиом тканей, а также различные воздействия окружающей среды, гигиенические практики, лекарства, тяжесть заболевания и сопутствующие заболевания¹⁹. Кроме того, признавая, что тепло, выделяемое во время лазерной процедуры, может повлиять на жизнеспособность микроорганизмов, бактерии были выделены из ткани HS вдали от места иссечения, что позволило избежать потенциального влияния на состав микробиома. Пациенты с СГ также часто лечатся местными и/или системными антибиотиками, а также иммунодепрессантами, которые могут влиять на колонизацию кожи²⁰. Эти факторы делают стандартизацию при сборе и обработке образцов¹⁸ еще более важной. Мы также признаем, что определенный процент бактерий не поддается культивированию. Тем не менее, протоколы оптимизированы для выделения наиболее репрезентативных видов, идентифицированных в исследованиях микробиома HS. Наши результаты согласуются с предыдущими исследованиями микробиома в туннелях^{HS 6,7,8}, поскольку бактерии из туннелей HS, выделенные в этом исследовании, включали Prevotella sp, Peptoniphilus sp, Porphyromonas sp, Staphylococcus lugdunensis, Streptococcus anginosus, Parvimonas micra, Proteus mirabillis и Actinotignum schaalii. Кроме того, ткань, сохраненная для выделения ДНК, может быть использована для валидации в исследованиях микробиома, либо с помощью метагеномного подхода, либо с помощью ампликонного секвенирования. С помощью этого стандартизированного подхода мы также надеемся улучшить сбор тканей и воспроизводимость будущих исследований микробиома при СГ.

Описанный метод закладывает основу для дальнейшего понимания вклада патогена HS в различные аспекты патогенеза заболевания, включая исследования взаимодействия хозяина и патогена. Недавние исследования охарактеризовали реакцию кератиноцитов человека на коммерчески доступные штаммы ATCC от преобладающих видов, идентифицированных в HS ^12,13. Тем не менее, используемые штаммы ATCC были выделены из мокроты, шейно-лицевых поражений и эмпием, а не из ткани HS, что подчеркивает потребность в более надежных моделях HS, имитирующих состояние человека, особенно тех, которые представляют туннели HS²¹. Этот метод также делает возможным банкирование бактериальных штаммов, выделенных из туннелей HS, что может способствовать более масштабному функциональному тестированию и выяснению роли патогенов в развитии и прогрессировании туннелей HS. Важно отметить, что выделение туннельных патогенов также позволяет дополнительно оценить чувствительность к противомикробным препаратам и распространенность устойчивости к антибиотикам, что известно в контексте частого использования местных и системных антибиотиков, таких как доксициклин и клиндамицин, для лечения вспышек заболевания²². Туннельные патогены также могут способствовать вариабельному ответу пациента на биологическую терапию¹⁴. Таким образом, существует большой трансляционный потенциал для исследований с использованием туннельных патогенов HS, включая оптимизацию выбора терапии и разработку специфических для патогенов методов лечения для сужения использования антибиотиков, тем самым снижая риск устойчивости к антибиотикам. Кроме того, анализ состава микробиома при СГ может позволить улучшить диагностические и прогностические инструменты для оценки прогрессирования заболевания и риска рецидива. Таким образом, мы представили практический и воспроизводимый метод выделения и поддержания бактерий из туннелей HS для дальнейшей характеризации и функциональных исследований.

Авторы не сообщают о конфликте интересов.

Эта работа была поддержана R01AR083385 (IP, MTC, HLT), P50MD017347 (TG, IP, HLT) и исследовательским грантом (TG) HS Foundation Danby. Эта работа была дополнительно поддержана грантом NIH 1S1OD023579-01 для сканера слайдов VS120 в Центре аналитической визуализации Медицинской школы Миллера Университета Майами.