化膿性汗腺炎トンネルからの微生物分離のための包括的アプローチ

私たちは、化膿性汗腺炎患者から切除した組織の皮膚副鼻腔管(トンネル)から潔癖性および嫌気性生物を成功裏に分離する方法を紹介します。

化膿性汗腺炎(HS)は、痛みを伴う結節と膿瘍を特徴とする衰弱性疾患で、皮膚の真皮層内の副鼻腔(トンネル)に進行し、重大な不快感、悪臭を放つ分泌物、外観の変形、拘縮、瘢痕化を引き起こし、生活の質を著しく低下させます。HSは、皮膚のマイクロバイオームの変化と関連しており、免疫調節や有害な細菌に対する皮膚の防御に影響を与えます。HSマイクロバイオームが蔓延しているにもかかわらず、HSマイクロバイオームが疾患の病理学に貢献していることや、治療に対する反応が限られていることは、ほとんどわかっていません。現在までに、HS組織に関する複数の16S rRNAシーケンシング研究は、グラム陰性嫌気性菌の増加と皮膚共生性の低下を特定し、属レベルの粒度しか達成していません。HS患者における微生物叢の異常症をより深く理解することは、治療戦略を最適化するために不可欠です。これには、皮膚疾患に焦点を当てたトランスレーショナル研究では十分に活用されていないことが多い細菌種の分離を含む、HSマイクロバイオームの評価には2つのアプローチが必要です。HS組織から個々の微生物を分離することは、HSの病因における細菌の役割を解明するために重要です。ここでは、HSトンネル組織から嫌気性病原体を成功裏に分離するための再現性のある方法に焦点を当て、HSにおける細菌の役割を理解するための最初の最も重要なステップを提供します。この方法は、HSへの微生物の寄与に関する的を絞った研究と、この慢性疾患の複雑な微生物負荷に対処するより効果的で個別化された治療戦略の開発への道を開きます。

化膿性汗腺炎(HS)は、結節や膿瘍が皮膚の真皮層や皮下層に形成された副鼻腔(トンネル)に進行し、重大な痛みを引き起こし、化膿性分泌物、外観の損傷、および衰弱させる心理社会的後遺症を特徴とする一般的な皮膚疾患です^1,2。HSは、女性や有色人種の肌を持つ個人に不釣り合いに影響を及ぼし、通常は思春期後期または成人期初期に発症します²。この疾患の深刻な身体的症状は、うつ病、不安神経症、社会的孤立などの深刻な心理社会的影響によって悪化し、生活の質を著しく低下させる可能性があります³。進行した疾患段階で形成されるHSトンネルは、現在承認されている生物学的治療に対する患者の反応の確率を大幅に低下させ、外科的切除が依然として唯一の治療アプローチです^4,5。

HSトンネルに関連するマイクロバイオームは、複数の研究で特徴づけられており、嫌気性病原体の蔓延と皮膚共生菌の存在量の減少が示されています^6,7,8、最近の研究では、トンネル内のポルフィロモナス属(I型)とプレボテラ属(IV)が他の属の中でも特に特定されています⁹.別の研究では、組織サンプリングの深さによるHSマイクロバイオームの変動が見られ、トンネル組織¹⁰の微生物組成の特異性が確認されました。さらに、腸内細菌叢の異常はHSの免疫応答に影響を与えることが示されており、疾患の病因における微生物の役割がさらに示唆されています11,12,13,14。クリンダマイシン、リファンピシン、テトラサイクリンによる長期の全身抗生物質治療が使用されており、罹患患者の排液トンネルの数の減少が示されている^15,16、HSの抗生物質耐性嫌気性病原体に関するデータは不明のままです。これまでのところ、HSトンネルからの細菌株の分離は報告されておらず、新しい抗菌治療に関する研究や、HSの疾患病因に対する病原体の寄与の詳細な評価は限られています。病原体分離の方法の標準化は、HSの病因における細菌の役割についての真の洞察を促進するだけでなく、より的を絞った改善された介入への応用も可能にします。

ここでは、HSトンネル組織から微生物をうまく分離する方法に焦点を当てます。個々の細菌種を単離することは、HS病理におけるそれらの役割を理解するための重要な最初のステップです。この方法は、HSへの微生物の寄与に関する標的研究と、この慢性疾患の細菌性病原体に対処するより効果的で個別化された治療戦略の開発への道を開きます。

このプロトコルは、マイアミ大学の治験審査委員会 (IRB) によって承認されました (プロトコル #20200187)。インフォームド コンセントは、HS トンネルと診断された患者 (n = 18、平均年齢 ± 標準偏差 = 30.9 ± 9.4、女性 12 人、男性 6 人) および/またはその法定後見人から得られます。

1.患者サンプルの収集

1. 切除した組織を取り扱う前に、汚染のリスクを最小限に抑えるために、厳格な滅菌予防措置を講じてください。組織を取り扱う個人は、白衣、フェイスマスク、サージカルキャップを着用し、滅菌手袋と滅菌器具を使用して組織を取り扱う必要があります。
2. 無菌性制御のために、組織を処理する前に、オートクレーブ滅菌済みの鉗子を嫌気性輸送バイアルに浸します(材料の表)。
3. HSトンネルと診断された患者の患部から、メスまたは_CO2 レーザーで外科的に切除した皮膚組織を採取し、直ちに滅菌鉗子を使用して滅菌ペトリ皿に入れ、さらなる処理を行います。
4. 手術センターまたは外来診療所にいる間、 図1Aに示すように、オートクレーブ前の鉗子で皮膚をプローブすることにより、切除された組織内のトンネルを特定します。
5. 組織切除の直後に、同定されたトンネルの全層皮膚から6mmパンチ生検を行い、嫌気性システム内の還元剤を含む半固体緩衝媒体に浸し、ガラスバイアルを輸送して、嫌気性細菌種の生存を最適化し、さらなる分析を行います。
6. 嫌気性バイアル内のトンネル組織を氷上の実験室に輸送します。
7. 以下で説明するように、サンプルドキュメントを実行します。
   1. 施術当日は、人口統計、年齢、自己申告による民族/人種、現在の薬などの患者情報を、個人を特定せずに収集します。切除された組織の体部位は、HSトンネルが複数の体部位で発生する可能性があるため、ボディチャートに付随します。組織処理の前後にサンプルの両側から切除された組織の写真を撮り、トンネルから生成された生検の位置を文書化します。ラボに到着したら、個人を特定せずにコード化された組織サンプルを電子的で安全なデータベースに記録します。

2.HSスキンプロセッシング

1. セットアップとメッキ
   1. 白衣と手袋を着用し、汚染を避けるために髪を結びます。カナマイシンおよびバンコマイシン(LKV)寒天、トリプチカーゼ大豆寒天(TSA II)5%羊血液(SB)寒天、ブレインハートインフュージョン(BHI)、およびフェニルエチルアルコール寒天(PEA)と5%SB寒天培地を含むLaked Brucella血液寒天培地(LKV)を含む温血寒天培地プレートをインキュベーターで37°Cに10分間。組織の処理前に、バイオセーフティキャビネットを70%エタノールで洗浄してください。
   2. 寒天プレートが温まったら、プレートのベースまたは側面にコード化されたサンプル名と日付のラベルを付けます。オートクレーブ滅菌した鉗子、メス、滅菌済みの接種ループ、寒天プレートをバイオセーフティキャビネットに入れます。
   3. 滅菌鉗子を使用して、嫌気性輸送バイアルから6 mmパンチ生検を無菌鉗子で取り出します。滅菌メスを使用して、組織をそれぞれ約^1mm2 の小片にすばやく切り刻みます。500 μLの強化クロストリジウム培地(RCM)を含む滅菌マイクロ遠心チューブに組織を入れ、短時間ボルテックスします。
      注:ホモジナイゼーションは、サンプルが好気性環境に長時間さらされ、プロセス中に追加の曝気が発生し、嫌気性細菌が失われる可能性があるため、利用されませんでした。
   4. 新しい滅菌ループを使用して、細菌生物を含む組織懸濁液をTSA II 5% SB、LKV、PEAと5% SBおよびBHI寒天プレートに繰り返し象限ストリーキングします。
   5. 残りのみじん切り組織懸濁液を使用して、クライオチューブに20% v/v滅菌グリセロールと80%v/v組織懸濁液を添加して、グリセロールストックを作製します。グリセロールストックは80°Cで保存してください。 単離された細菌の生存率が限られている場合、組織ストックを使用して単離を繰り返すことができます。
   6. インキュベーター内のすべてのプレートを37°Cの_CO2 パックで密閉された嫌気性チャンバーに入れます。めっき後7〜14日で嫌気性菌の成長を期待して、2〜3日ごとにプレートを確認してください。プレートを撮影することにより、コロニーの形態を文書化します。
2. ティッシュバンキング
   1. ホルマリン固定パラフィン埋め込み型(FFPE)サンプルおよび組織学的評価のために、8mmパンチ生検を使用して、トンネルを通ってトンネルから離れた追加の全層皮膚サンプルを収集します。
   2. DNA(スナップ凍結)、RNA(後でRNA内)、およびタンパク質の分離(スナップ凍結)のために、追加の6 mmパンチ生検を保存します。
3. コロニーのメンテナンス
   1. コロニーが元のプレートで観察されたら、写真プレートを作成し、明確なコロニー形態に注意してください¹⁷。一般に、10〜15の異なるコロニー形態を予想します( 図1を参照)。
   2. 予熱したLKV、BHI、PEA を 5% SB および TSA II 5% SB 寒天プレートで調製します (材料表)。各プレートラベルに、サンプルID、生検の場所、および日付をラベル付けします。
   3. 滅菌ピペットチップを使用して、単一のコロニーをピックアップし、検出されたのと同じタイプのプレート上でジグザグに縞模様にします。次に、コロニーと同じピペットチップを16s rDNA PCR増幅のテンプレートとして使用し、以下の手順に従います。
   4. すべてのタイプの寒天プレートから選択したコロニーを使用し、新しい滅菌ピペットチップと元のプレートとは異なる形態の異なる特異コロニーを使用して、ステップ2.3.3を繰り返します。繰り返しになりますが、ストリーキングの直後に、残りのコロニーが入ったピペットチップを使用して、PCR増幅のテンプレートとなるため、専用のPCRプレートウェルに沈めます。
   5. 4種類の寒天プレートすべてに特定の形態を持つすべてのコロニーにストリークが付けられ、対応するPCRウェルが同時に接種されるまで、各異なるコロニーについてステップ2.3.3〜2.3.4を繰り返します。
   6. 新しくメッキした寒天プレートを、_CO2 パックで密閉された嫌気性チャンバー内の37°Cのインキュベーターに保管します。コロニーが成長したら、細菌ストックを保存する前に、単離されたコロニーの純度を確認してください(下記参照)。めっきコロニーの均一性が欠ける場合は、手順2.3.3を繰り返します。コロニーの成長に応じて、コロニーの外観が均一になるまで、4〜5日ごとに再メッキプロセスを実行します。
4. 16s rDNAコロニーアンプリコンシーケンシングによる細菌種の同定
   1. 2.5 μL の 10 μM 16S rDNA V1-V3 フォワード (5' AGAGTTTGATTCCTGGCTCAG-3') およびリバースプライマー (5' AGAGTTTGATTCCTGGCTCAG-3'; 10 μM)、12.5 μL の 2x Master Mix ポリメラーゼ、およびウェルあたり 10 μL の微生物 DNA フリー水で構成されたマスターミックスを PCR プレートで調製し、1 ウェルあたり総容量 25 μL にします。
   2. 選択したすべてのコロニーからの増幅に必要なPCRマスターミックスの量、ネガティブコントロール(テンプレートなし)、およびポジティブコントロールを計算します-任意の実験室株を使用できます。私たちは一般的に 黄色ブドウ球菌 USA300を使用します。
   3. PCRプレートをバイオセーフティキャビネットに持参し、汚染を避けるためにウェルを覆います。滅菌ピペットチップからの単一のコロニーをめっきに使用します。すぐにコロニーを厳密に渦巻いて、事前に充填されたマスターミックスを使用して指定されたウェルに再懸濁します。継代培養とPCRのサンプリングの両方に同じピペットチップを使用してください。
   4. すべての特異HSコロニーとポジティブコントロールについて、ステップ2.4.3を繰り返します。
   5. 選択したコロニーの溶解に必要な初期変性のために95°Cで5分間PCRを実行し、続いて95°Cで15秒間、54°Cで1分間の40サイクルを行い、最後の4°Cサイクルの使用はオプションです。サーモサイクラーは、同じプログラム設定で使用することもできます。
   6. 増幅されたqPCR産物を用いてゲル電気泳動を行い、アンプリコンのサイズ(311 bpと予想)を確認します(図2)。メーカーの指示に従って、PCR精製キットを使用して16s rDNA断片を正常に増幅します。
   7. 精製したPCR産物を、16S rDNA V1-V3フォワードプライマーおよびリバースプライマーを使用した16S ribosomal RNA Sangerシーケンシングにお送りください。
5. バクテリアストック
   注:気難しい嫌気性菌は、寒天プレート上での生存能力が限られていることで知られています。
   1. 種の同一性を確認するシーケンシング結果を得る前に菌株の保存を保証するために、単一のコロニーから寒天プレートを生成し、純度を確認してストックを生成します。寒天プレートから直接ストックを生成し、液体培地の成長条件の最適化と並行して行います。
   2. ステップ2.3で生成したプレートからストックを調製するには、6 mmの滅菌接種ループを使用して、できるだけ多くの均一なコロニーをピックアップします。次に、20% 滅菌グリセロールをクライオチューブに入れた 800 μL の RCM に細菌を激しく再懸濁し、-80 °C で保存して細菌ストックを作成します。
      注:このステップにより、シーケンシングデータによる特性評価を取得する前に、気難しい病原体のタイムリーな保存が保証されます。
   3. 菌株の分類が確認されたら、液体培養の増殖と単一コロニーからのストックの生成の最適化を行います。

この研究では、HSトンネルからの嫌気性細菌の分離と特性評価のためのプロトコルについて説明します。このプロトコルは、in vitro、ex vivo、および in vivo の皮膚感染モデルを使用してこれらの細菌の機能と病原性をテストする可能性を生み出し、HS の病因に対する微生物の寄与についての理解を深める可能性を生み出したことで注目に値します。まず、切除した皮膚を滅菌鉗子で探すことにより、トンネルを特定しました(図1A)。トンネルは結節と膿瘍と区別されましたが、後者は皮膚表面の下で接続されていません。トンネルを通して6mmの全層パンチ生検を行い、Porphyromonas sp.やPrevotella sp.などのグラム陰性菌を主に選択するためにLKV寒天を使用した細菌培養のための嫌気性条件下でそれらを保存してください。 TSA II 5%SB寒天プレートは、Peptoniphilus sp.やStreptococcusなどのグラム陰性菌とグラム陽性菌の両方の増殖を可能にしますsp.結果として得られるコロニーは、溶血ゾーンの有無にかかわらず、異なる色(例えば、黒、黄、白など)、サイズ、および透明度を含む形態において異なる(図1B)。3日以内に成長するコロニーは、通性嫌気性菌を表す可能性が低く、通常、ブドウ球菌とコリネバクテリウム種が含まれます。嫌気性菌は、成長の7〜14日後に現れることがあり、通常は色素沈着または半透明の非常に小さなコロニーを示します。したがって、初期プレーティング後2〜4日以内に早期に出現するコロニーを特徴付けて保存することができますが、これらは通常、トンネル特異的なマイクロバイオームを代表しない種であり、トンネルとは異なる表在性の皮膚や結節から分離されることがよくあります。アンプリコンシーケンシングを用いて単離および分類された代表的な必須および通性嫌気性種には、Prevotella sp、Peptoniphilus sp、Porphyromonas sp、Streptococcus anginosus、Staphylococcus lugdunensis、Parvimonas micra、Proteus mirabillis、およびActinotignum schaaliiが含まれていた。トンネル構造を含まない(トンネルから離れた場所)HS皮膚から細菌を分離することも、両方の組織源の違いを特定し、トンネル特異的な細菌の選択を容易にするため、重要です。重要なことは、手順の無菌管理が不可欠であり、成長をもたらさないようにすることです。

組織学は、HSの形態が複雑で、個々のサンプル内でも非常に変動するため、臨床的に同定されたトンネルの検証としても役立った¹⁸。トンネル組織学は、内腔に可変的な上皮化を示し、それが存在する場合、その上に横たわる表面上皮に類似しており、これは前述の文献¹² (図3)と一致しています。ケラチンに富む物質は、HSトンネル¹²の特徴である強力な炎症を反映した密集した炎症性浸潤とともに、細菌の付着の表面として機能する可能性のある内腔にも見出されました。一部のサンプルでは、トンネル上皮も肉眼的に視覚化され、内腔に沿って肥厚した組織のパッチとして現れました。8 mmの全厚パンチを複数集めることは可能であり、トンネル全体と周囲の構造物を捕捉することができたため、代表的な組織学的評価を提供しました(図3)。

図1:HSトンネルからの微生物株の単離 (A)滅菌鉗子でプローブすることにより、皮膚サンプル中のトンネルを同定した。(B)代表的な血液寒天プレートが示されており、嫌気性輸送バイアルで輸送されたトンネル組織から縞模様になっています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:代表的な16S rDNAアンプリコンゲル電気泳動。 サンプル1〜6は、ゲル電気泳動によって分析された異なる細菌コロニーからの16S rDNA PCR産物を表しており、各レーンは固有のコロニーに対応しています。ネガティブコントロールにはDNAが含まれておらず、PCR反応の特異性が確認されています。特定の16S rDNAバンドの存在は、細菌コロニーからの増幅が成功したことを示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:上皮化トンネルを示す代表的な組織型。 黒い破線はトンネルの内腔の輪郭を描きます。白い破線はトンネル上皮の輪郭を描いています。青い線は、表在性皮膚表皮と真皮の間の基底膜を示しています。スケールバー = 500 μm. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

本研究では、HSトンネルにコロニーを形成する細菌を分離し維持するための新しい方法を提示する。この再現性の高い方法は、これらの病理学的構造に存在する株の詳細な特性評価を可能にするだけでなく、HSの病因における特定の微生物の役割を調査するその後の機能研究も可能にします。このプロトコルの重要なステップには、嫌気性培地での組織の収集と輸送が含まれ、HSトンネルからの生存可能な気難しい微生物の保存が容易になります。他の研究と同様に、皮膚消毒剤の使用や局所麻酔などの外科的処置に関連するものを含め、患者のさまざまな環境曝露、衛生慣行、投薬、疾患の重症度、併存疾患と同様に、組織のマイクロバイオームに影響を与える可能性のある制限が残っています¹⁹。さらに、レーザー手術中に発生する熱が微生物の生存率に影響を与える可能性があることを認識し、細菌を切除部位から離れたHS組織から分離し、マイクロバイオーム組成への潜在的な影響を回避しました。HSの患者はまた、局所および/または全身の抗生物質、および皮膚のコロニー形成に影響を与える可能性のある免疫抑制薬で頻繁に治療されます²⁰。これらの要因により、サンプルの収集と処理の標準化がますます重要になります¹⁸。また、バクテリアの一定の割合が培養不可能であることも認識しています。しかし、これらのプロトコルは、HSマイクロバイオーム研究で同定された最も代表的な種を分離するように最適化されています。この研究で分離されたHSトンネルからの細菌には、Prevotella sp、Peptoniphilus sp、Porphyromonas sp、Staphylococcus lugdunensis、Streptococcus anginosus、Parvimonas micra、Proteus mirabillis、およびActinotignum schaaliiが含まれていたため、私たちの調査結果は^HSトンネル⁶、^7、8に関する以前のマイクロバイオーム研究と一致しています.さらに、DNA単離のために保存された組織は、メタゲノムまたはアンプリコンシーケンシングアプローチのいずれかによるマイクロバイオーム研究による検証に使用できます。この標準化されたアプローチにより、HSにおける将来のマイクロバイオーム研究の組織収集と再現性も向上させたいと考えています。

ここで説明した方法は、宿主と病原体の相互作用研究など、疾患の病因のさまざまな側面に対するHS病原体の寄与についての理解を深めるための舞台となります。最近の研究では、HS^12,13で同定された優勢な種からの市販のATCC株に対するヒトケラチノサイトの応答が特徴付けられています。しかし、使用されたATCC株は、HS組織ではなく、喀痰、頸顔面病変、および蓄膿から単離されており、人間の状態を模倣したより信頼性の高いHSモデル、特にHSトンネルを表すモデルの必要性が浮き彫りになりました²¹。また、この方法により、HSトンネルから分離された細菌株のバンク化が可能となり、より大規模な機能試験が容易になり、HSトンネルの発生と進行における病原体の役割を解明できる可能性があります。重要なことに、トンネル病原体の分離は、抗菌薬の感受性と抗生物質耐性の有病率のさらなる評価も可能にします。これは、ドキシサイクリンやクリンダマイシンなどの局所および全身の抗生物質が病気の再燃を治療するための頻繁な使用の文脈で知られています²²。トンネル病原体も、生物学的療法に対する患者の反応の変動に寄与する可能性がある¹⁴。したがって、HSトンネル病原体を用いた研究には、治療法の選択の最適化や、抗生物質の使用を狭めるための病原体特異的治療法の開発など、大きなトランスレーショナルな可能性があります。さらに、HSにおけるマイクロバイオームの組成を解析することで、疾患の進行リスクと再発リスクを評価するための診断ツールや予後ツールを改善できる可能性があります。要約すると、HSトンネルから細菌を分離および維持するための実用的で再現性のある方法を提示し、さらなる特性評価と機能研究を行いました。

著者らは、利益相反を報告していない。

この研究は、R01AR083385(IP、MTC、HLT)、P50MD017347(TG、IP、HLT)、およびHS財団のDanby研究助成金(TG)の支援を受けました。この研究は、マイアミ大学ミラー医学部分析イメージングコア施設のVS120スライドスキャナーハウスに対するNIH助成金1S1OD023579-01によってさらに支援されました。