Sıçanlarda Prematüre Posthemorajik Hidrosefalisinin Modellenmesi

Posthemorajik prematüre hidrosefali (PHHP), koryoamniyonit ve intraventriküler kanama kombine edilerek neonatal sıçanlarda modellenebilir. Bu doğum öncesi ve doğum sonrası olayların kombinasyonu, yaşam boyu makrosefali, ventrikülomegali ve yüksek kafa içi basınç dahil olmak üzere PHHP'nin klinik özelliklerini doğru bir şekilde özetler.

Posthemorajik prematüre hidrosefali (PHHP), 32 haftadan küçük çok erken doğmuş bebeklerde ciddi intraventriküler kanamanın (IVH) ciddi bir sekelidir. PHHP, yüksek intrakraniyal basıncın (ICP) klinik semptomları ile ilişkili beyin omurilik sıvısı (BOS) birikimi ile tanımlanır. PHHP'li bebekler ömür boyu şant bağımlılığından muzdariptir, yarısı yaşamın ilk yılında tekrar ameliyat gerektirir ve birçoğu yaşam boyu birden fazla ek ameliyat gerektirir. Prenatal koryoamniyonit, preterm bebekleri şiddetli IVH'ye yatkın hale getirir ve neonatal sepsis ile PHHP eğilimlerinin cerrahi tedavisi ihtiyacını doğurur. Bu klinik özellikler, sistemik inflamasyonun PHHP patofizyolojisinin ayrılmaz bir bileşeni olduğunu düşündürmektedir.

Burada, sıçanlarda PHHP'nin tüm klinik yönlerini ve temel özelliklerini özetleyen bir hayvan modeli tanımlıyoruz. Bu protokolün amacı, utero koryoamniyonit ve doğum sonrası IVH'nin parçalanmış kırmızı kan hücreleri kullanılarak PHHP elde etmek için nasıl birleştirilebileceğini göstermektir. Bu preklinik yaklaşım, manyetik rezonans görüntüleme (MRG) veya mikroskopi ile tespit edilebilen ilerleyici makrosefali ve kubbeli kranyumlar, yüksek intrakraniyal basınç ve ventrikülomegali verir. BOS dinamiklerinde sürekli bozulmaya ek olarak, sıçanlar ayrıca yetişkinliğe kadar bilişsel gecikme ve fonksiyonel sakatlığa sahiptir. Buna göre, bu klinik öncesi platform, moleküler, hücresel, biyokimyasal, histolojik, görüntüleme ve fonksiyonel sonuç ölçümlerini içerebilen PHHP'nin benzersiz ve benzersiz translasyonel çalışmalarını kolaylaştırır. Paralel olarak koroid pleksus, ependimal hareketli kirpikler ve glifatik sistemin titiz analizi için de kullanılabilir. Son olarak, hidrosefali tedavisi için yeni cerrahi müdahale stratejilerinin ve cerrahi olmayan terapötik yaklaşımların araştırılması için paha biçilmez bir klinik öncesi araç olabilir.

Posthemorajik prematüre hidrosefali (PHHP) önemli bir halk sağlığı sorunu olmaya devam etmektedir. İntraventriküler kanamaya (IVH) sekonder yüksek intrakraniyal basınç (ICP) ile birlikte semptomatik beyin omurilik sıvısı (BOS) birikimi ile tanımlanan PHHP, prematüre ensefalopatisinin ciddi bir tezahürüdür ve küresel prematüre ve edinilmiş hidrosefali yüküne önemli bir katkıda bulunur ^1,2. Küresel olarak, her yıl yaklaşık 400.000 bebek hidrosefali ile doğmakta veya yaşam boyu sürecek bir yük edinmektedir³ ve birçoğu tedavi eksikliği nedeniyle ölmektedir³. PHHP, gelişmiş ülkelerde şiddetli IVH'li çok erken doğmuş bebeklerde (<32 haftalık gebelik) yaygındır ve genellikle yaşamı tehdit eden diğer komorbiditelerden muzdarip olan bebeklerin en hastalarını etkiler ^4,5.

Hidrosefali için mevcut tek tedavi cerrahi^6'dır. Beyin omurilik sıvısını (BOS) yönlendirmek için ventriküloperitoneal (VP) şantı, endoskopik üçüncü ventrikülostomi (ETV) veya koroid pleksus pıhtılaşması (ETV-CPC) ile ETV için olsun, bebekler ilk kalıcı müdahale sırasında 6 aydan büyük olduğunda cerrahi prosedürler daha uzun ^{ömürlüdür7}. En yaygın seçenek olan VP şantları genellikle bir yıl içinde başarısız olur ve çocukları ömür boyu komplikasyonlara, tekrarlayan ameliyatlara ve hastaneye yatışlara yatkın hale getirir ve bu da çocuğa, aileye ve topluma muazzam bir maliyetle sonuçlanır. ⁸ Özellikle, herhangi bir zamanda potansiyel olarak başarısız olabilecek bir şantın kaygısı aileler için külfetlidir⁹. Sık ameliyatlar da dahil olmak üzere semptomatik hidrosefali olan çocukların bakımı, pediatrik sağlık harcamalarının önde gelen bir nedenidir 10,11,12,13,14. Çocuklarda şant ile ilgili harcamaların yıllık tahmini maliyeti 2003 yılında 2 milyar dolardı:¹⁵. Şantlı çocuklar hastaneye başvuruların sadece %0,6'sını oluştururken, pediatrik hastane masraflarının %3,1'ini oluşturmaktadır¹⁵. Bu nedenle, PHHP tedavisi için güvenli, cerrahi olmayan tedavilerin keşfi çok önemlidir.

Bebeklerde PHHP, beyin kanamasının ilk tanımlanmasından sonra haftalar ila aylar süren klinik bir zaman seyri boyunca IVH'den sonra gelişir. Hidrosefali Klinik Araştırma Ağı (HCRN) tarafından yapılan bir araştırma, VP şantlarının PHHP^16'lı yenidoğanlar için en iyi cerrahi seçenek olmaya devam ettiğini doğruladı. Nitelikli pediatrik nöroşirürji bakımına erişimi olan yüksek gelirli ülkelerde PHHP'li çocuklar için bile, sonuçlar optimal olmaktan uzaktır ve PHHP'li bebeklere yerleştirilen şantların %>50'si ilk 2 yıl içinde cerrahi revizyon gerektirir⁸. PHHP için daha güvenli ve daha etkili tedavileri belirleme ihtiyacına rağmen, araştırmalar engellerle karşı karşıya kalmıştır. PHHP ile ilgili klinik öncesi literatür genellikle hidrosefali ex vacuo 17,18'in neden olduğu ventrikülomegaliyi makrosefali^19,20 ile semptomatik hidrosefaliden uygun şekilde ayırt edemediği için ilerleme kısmen engellenmiştir. Gerçekten de, hidrosefalinin gelişimsel modelleri, ilerleyici makrosefali ve/veya yüksek ICP¹ ölçümlerini içermelidir.

Klinik ve klinik öncesi içgörülerin birleştirilmesi, çalışma tasarımını geliştirdi ve PHHP² anlayışımızı ilerletti. Dünya çapında çeşitli merkezlerde yapılan çalışmalar, IVH'nin en sık koryoamniyonitine sekonder çok preterm yenidoğanlarda görüldüğünü göstermiştir 21,22,23,24,25,26,27,28. Plasenta enfeksiyonu ve inflamasyonuna ek olarak, neonatal sepsis ek bir önemli risk faktörüdür ve IVH'den ventrikülomegali'ye, semptomatik PHHP'ye ve ardından cerrahi müdahaleye ilerlemede merkezi bir rol oynayabilir²⁹. Klinik öncesi ve klinik veriler, kan yoluyla bulaşan inflamasyonun hidrosefali^20'ye neden olabileceğini ve sistemik inflamasyonun koroid pleksus³⁰ tarafından BOS salgılanmasını artırdığını desteklemektedir. Ayrıca, subaraknoid kanama ve IVH'si olan ve aynı zamanda sepsisten muzdarip yetişkinlerin şant gerektirme olasılığı çok daha yüksektir³¹. Daha yeni literatür, inflamasyonun BOS ^19,20,32'nin ependimal motil kirpik itme gücünü ve glifatik sistem 33,34,35,36 tarafından BOS yeniden emilimini azalttığını doğrulamıştır. Genel olarak, sistemik inflamasyon PHHP^1'de önemli bir patofizyolojik ve klinik itici güçtür.

Bu bulguları göz önünde bulundurarak, yaşa uygun bir preklinik PHHP modeli oluşturduk. Bu model, doğum sonrası hemen ve erken dönemde İVH'yi, erken doğumun başlıca nedeni olan koryoamniyonit ile birleştirir¹⁹. Bu deneysel yaklaşım uteroda plasenta yetmezliği, plasenta iltihabı ve koryoamniyoniti tanımlayan intraamniyotik inflamasyon^{ile başlar} 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 ^,20,21,22,
23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40^,41,42,
43,44,45. Spesifik olarak, embriyonik gün 18'de (E18) ^gebe sıçan barajlarında abdominal laparotomi yoluyla preterm dönemde bir fetal inflamatuar yanıt sendromu, plasental nötrofili ve proinflamatuar CNS mikroçevresini özetliyoruz37,38,39,40,41,42,43,44,45 . Rahim içi yaralanma, geçici sistemik hipoksi-iskemiye (TSHI) yol açan geçici bilateral uterin arter tıkanıklığı ve ardından intraamniyotik lipopolisakkarit (LPS) enjeksiyonu ile indüklenir37,38,39,40,41,42,43,44,45 . Daha sonra, BOS dinamiklerini bozmak ve canlı doğan yavrularda hidrosefali gelişimini katalize etmek için, doğum sonrası 1. günde IVH indüklenir. Bu, lateral ventriküllere 19,37,44 littermat parçalanmış kırmızı kan hücrelerinin (RBC'ler) bilateral intraserebroventriküler enjeksiyonu (ICV) ile gerçekleştirilir. Yavrular daha sonra hidrosefali geliştikçe ve yaşamları boyunca incelenir.

Johns Hopkins Üniversitesi'ndeki Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (ACUC), burada açıklanan tüm deneysel prosedürleri onayladı. Bu protokol, hamile Sprague-Dawley sıçan barajlarını ve her iki cinsiyetten yavruları kullanır.

1. E18'de koryoamniyonit indüksiyonu

NOT: Bu protokolün rahim içi hakaret kısmı daha önce ayrıntılı olarak yayınlanmış, yukarıda özetlenmiştir ve ayrı bir JOVE protokolünün ve videosunun konusudur 19,37,38,39,40,41,42,43,44,46. Kısaca, gebe dişi Sprague-Dawley sıçanları, TSHI ve intraamniyotik LPS uygulamasını içeren koryoamniyoniti indüklemek için embriyonik 18. günde (E18) abdominal laparotomi işlemine tabi tutulur.

1. Anestezi
   1. % 2-4 izofluran ile E18 hamile sıçan barajında anestezi indükleyin.
   2. Hamile barajını indüksiyon odasından çıkarın ve fareyi 37 ° C'ye ayarlanmış örtülü bir cerrahi sirkülasyon su battaniyesi üzerine sırtüstü pozisyonda yerleştirin.
   3. Kornea kurumasını önlemek için oftalmik merhem sürün. Ayak parmağı kıstırma refleksinin olmadığını doğrulamak için bir pençeyi hafifçe sıkın. Her 15-20 dakikada bir anestezik derinliği izleyin ve pozitif bir ayak parmağı sıkışması yanıtı durumunda izofluranı artırın.
   4. Boynun ensesinde buprenorfin uzatılmış salımını (0.1 mg / kg SC) uygulayın.
2. Cerrahi hazırlık ve kese
   1. Standart steril tekniği kullanarak karın bölgesini tıraş edin.
   2. Karnı 3x alternatif betadin ve% 70 etanol ile ovalayın.
   3. Hayvanı steril cerrahi örtüler kullanarak örtün.
3. Abdominal laparotomi
   1. Hazırlanan karın cildine neşter ile 3 cm'lik orta hat kesisi yapın.
   2. Abdominal fasyal tabakayı tutmak için forseps ve cerrahi makas kullanın ve periton boşluğuna erişmek için kas tabakasının avasküler linea alba'sında bir kesi yapın.
   3. Uterusu dışsallaştırın.
   4. Uterin arterleri anevrizma klipsleri ile 60 dakika boyunca izole edin ve klempleyin. Sıcaklığı koruyun ve karın içi içeriği steril tuzlu su ile nemli tutun.
   5. Klipsleri çıkarın ve her fetüsün her amniyotik kesesine 100 μL LPS (4 μg/sac LPS solüsyonu) enjekte edin. Fetüsü veya plasentayı rahatsız etmeyin.
   6. Rahim boynuzlarını sulayın ve steril tuzlu su ile cömertçe 3 kez tarla yapın.
4. Laparotominin kapatılması
   1. Periton boşluğundaki uterus boynuzlarını değiştirin.
   2. Kas-fasiyal tabaka kenarlarını yeniden yaklaştırın ve çalışan bir 3-0 sütür kullanarak kapatın.
   3. Cilt tabakasını yeniden yaklaştırın ve çalışan bir 3-0 sütür kullanarak cildi kapatın.
   4. Yara kenarlarının etrafına deri altına %0.125 bupivakain enjekte etmek için 26 G'lik bir iğne kullanın.
   5. Sahte kontroller için, anestezi süresini kontrol etmek için laparotomiyi aynı süre boyunca gerçekleştirin. Arterleri klemplemeyin ve herhangi bir intraamniyotik enjeksiyon uygulamayın. İşlemin bitiminde laparotomiyi 3-0 dikiş kullanılarak iki tabaka halinde (karın kası fasyası ve cilt) kapatın. Her durumda, yavrular zamanında (E21/22) doğar ve baraj tarafından bakılır.

2. P1 üzerinde parçalanmış kırmızı kan hücrelerinin hazırlanması

1. Kan toplanması
   1. E18'de koryoamniyonit yaşayan bir çöpten doğum sonrası 1. günde (P1) bir erkek ve bir dişi Sprague-Dawley sıçan yavrusu alın. Özel cerrahi makasla her donör yavrunun kafasını hızla kesin.
      NOT: Kan alımı için 1 erkek ve 1 dişi yavru kullanıyoruz ve her birini donör kohortlarında temsil ederek olası bir cinsiyet yanlılığını ortadan kaldırıyoruz. Ek olarak, yavrularına enjekte etmek için yeterli hacim ve lizle üretilmiş RBC'lerin verimini garanti etmek için cinsiyete uygun bir çift kullanıyoruz. Tipik olarak, her donör yavru, maksimum 4-5 yavru üzerinde ICV enjeksiyonu gerçekleştirmek için yeterli parçalanmış RBC verir.
   2. Kanı hemen 0.2 mL steril salin içeren 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne toplayın, dekapitasyondan sonra sadece serbest akışlı kanı toplamaya dikkat edin ve erken hemolize yol açtığından daha fazla kan üretmek için kazıma veya sıkma yapmamaya dikkat edin. İyi girdap.
      NOT: Kesin kan miktarı, bireysel donör hayvana ve ağırlığa göre değişir, ancak yukarıdaki önlemler korunurken maksimum olmalıdır.
   3. Kan pıhtılarını küçük cerrahi makasla doğrayın/doğrayın.
   4. Kan süspansiyonunu 500 × g'da 4 ^{° C'de}10 dakika santrifüjleyin, süpernatanı çıkarın ve peleti 0.2 mL steril salin içinde yeniden süspanse edin. İyi girdap.
   5. Vorteks sonrası kalan kan pıhtılarını küçük cerrahi makasla doğrayın/kıyın.
   6. 2.1.4-2.1.5 adımlarını toplam 3 kez daha iki kez tekrarlayın ve her onaylama turu arasında cerrahi makası %70 etanol spreyi ile temizleyin.
2. Kırmızı kan hücrelerinin parçalanması
   1. Son santrifüjlemeden sonra, pelete 0.25 mL steril salin ekleyin; iyi girdap.
   2. Süspansiyonu 5 dakika kuru buz üzerine yerleştirin.
   3. Süspansiyonu kuru buzdan çıkarın, tamamen çözülene kadar 5 dakika boyunca 37,5 ^oC'ye ayarlanmış bir inkübatöre yerleştirin ve iyice girdaplayın.
   4. Dondurma ve çözülme döngülerini toplam 3 kez tekrarlayın (üç dondurma ve üç çözülme).
   5. Son çözülmenin sonunda, girdap yapın ve hızlı bir dönüş yapın. RBC'ler artık parçalanmış ve kullanıma hazırdır.
      NOT: Karışım opak domates suyu benzeri bir renkte olmalı ve şırıngalara kolayca çekilmelidir.

3. P1 üzerinde parçalanmış kırmızı kan hücrelerinin intraserebroventriküler enjeksiyonları

1. Hipotermi kullanarak anestezi
   1. Soğuması için ıslak buzun üzerine küçük bir platform yerleştirin.
   2. Yavrunun cildini korumak için üstüne kuru bir laboratuvar mendili yerleştirin.
      NOT: Bu düz soğuk yüzey, yavruları uyuşturmak ve enjekte etmek için kullanılır.
   3. Hipotermi ile anesteziyi indüklemek için yavruyu (yaşlı P1) ısıtma pedinden soğuk platformun üzerine görev mendili üzerine aktarın.
   4. Bir pençe sıkarak ve ayak parmağı kıstırma refleksinin olmadığını teyit ederek anestezi derinliğini onaylayın.
   5. Harici bir cerrahi lambayı en parlak ayarlarına ayarlayın.
   6. Hayvanın başının orta hattını nazikçe korumak için işaret parmağını ve orta parmağını kullanan bir asistanla, kafatasındaki yan ventrikülleri görselleştirmek için kafatasını transillumin. Superior sagital sinüsü (orta hat) deriden görselleştirerek ve koronal sütürün ince forsepslerle palpasyonunu kesişen yer işaretleri olarak tanımlayarak bregmayı tanımlayın.
2. Yoğun bakım ünitesi enjeksiyonu
   1. Anestezi uygulanmış yavrunun başını %70 etanole batırılmış bir pamuklu çubukla silin.
   2. Enjeksiyon bölgesini sagital sütürden 1 mm lateral, lambda ve bregma arasında yarı yolda tanımlayın ve işaretleyin.
   3. Görselleştirmeden sonra, sağ lateral ventriküle 20 μL parçalanmış RBC enjekte etmek için ultra ince perkütan iğne ile 0.3 mL, 8 mm uzunluğunda, 31 G insülin şırıngası kullanın. İğneyi, iğne uzunluğunun yaklaşık yarısı kadar bir derinliğe kadar serbest el tekniği kullanarak düz bir şekilde aşağı doğru sokun ve iğneyi yavaşça enjekte edin ve çıkarın (yaklaşık 10-15 saniye boyunca enjeksiyon ve çıkarma işlemi).
   4. Enjekte edilen parçalanmış eritrositlerin çıkışını önlemek için enjeksiyondan sonra iğneyi birkaç saniye yerinde bırakın.
   5. Sol lateral ventrikül ile tekrarlayın ve 20 μL parçalanmış RBC enjekte edin.
   6. Anesteziden kurtulmak için yavruyu 37,5 ^oC'ye ayarlanmış bir ısıtma pedine yerleştirin.
   7. Yavrunun cinsiyetini kaydedin ve benzersiz bir hayvan tanımlayıcısı atayın.
   8. Yavruyu ancak ısınma pedi üzerinde tam olarak iyileştikten ve hayvanın sternal yaslanmayı güvenli bir şekilde sürdürebilmesi için bilincini yeniden kazandıktan sonra ev kafesine geri koyun.
   9. Sağlık ve zindelik için tüm sıçan yavrularını günlük olarak izleyin.

4. P2'de başarılı bilateral intraventriküler kanamanın doğrulanması

1. Kafa ultrasonu
   1. Kafa ultrasonuna hazırlanmak için P2 yavrularını ev kafeslerinden çıkarın.
   2. Ultrason jelini ultrason probunun üzerine yerleştirin ve probu kafatasının üstüne yerleştirin.
   3. Son derece hafif bir basınçla, ventrikülleri görselleştirmek için probu hareket ettirin. IVH'yi temsil eden lateral ventriküllerde bilateral hiperekojeniteyi onaylayın.

5. Başarılı pozitorajik hidrosefalinin doğrulanması

1. Makrosefaliyi doğrulamak için baş çevresi için bir vekil olan intraaural mesafenin (IAD) ölçümü
   1. Ölçüme hazırlanmak için, ideal olarak net bir şekilde görselleştirilmiş milimetre tanımlarına sahip, kafa çevresini ölçmek için uygun küçük bir mezura edinin.
   2. Maskeli bir gözlemcinin yavruyu ev kafesinden çıkarmasını sağlayın.
   3. Yavruyu nazikçe tutarken, kulaktan kulağa olan mesafeyi (intraaural mesafe, IAD) ölçün ve değeri milimetre cinsinden kaydedin.
   4. IAD'yi günlük olarak P1'den P15'e kadar tekrarlayın ve değerlerin grafiğini çizin. IAD'yi seri olarak takip edin ve yavruları barajdan fiziksel olarak ayrılmış yeni kafeslere (yavruların sütten kesilmesi için standart zaman noktasıdır) yerleştirdikten sonra P21'de tekrar ölçün. Daha sonra her 5 günde bir, P25'ten P60'a kadar IAD'yi tekrarlayın.
2. Yüksek kafa içi basıncını doğrulamak için açma basıncının ölçülmesi
   1. Maskeli bir gözlemcinin yavruyu ev kafesinden çıkarmasını sağlayın.
   2. Ötenaziye hazırlık için 75-100 mg / kg intraperitoneal (IP) ketamin ve 5-10 mg / kg IP ksilazin ile uyuşturun.
   3. Bir pençeyi sıkarak ve ayak parmağı sıkışma / pedal refleksinin olmadığını onaylayarak anestezi derinliğini kontrol edin.
   4. Bir manometreye bağlı küçük bir iğneyi (31 G) servikomedüller bileşke BOS boşluğuna yerleştirin.
   5. Açma basıncını manometreye kaydedin.
   6. İğneyi çıkarın ve farenin başını keskin bir makasla kesin ve doku toplamaya devam edin.
3. Ventrikülomegali değerlendirmesi için ex-vivo manyetik rezonans görüntüleme (MRG)
   1. Ötenaziye hazırlık olarak 75-100 mg/kg intraperitoneal (İP) Ketamin ve 5-10 mg/kg IP Ksilazin ile anestezi uygulayın.
   2. Bir pençeyi sıkarak ve ayak parmağı sıkışma / pedal refleksinin olmadığını onaylayarak anestezi derinliğini kontrol edin.
   3. Sıçanları fosfat tamponlu salin (PBS) ile perfüze edin, ardından iyice sabitlenene kadar% 4 paraformaldehit (PFA) uygulayın.
   4. Beyni çıkarın ve beyni% 4 PFA'da bırakın
   5. Beyni 50 mL'lik konik bir tüpte% 2 agaroz içine gömün. Oda sıcaklığında bekletin.
   6. Ex vivo MRG için beyni MRI tarayıcısına aktarın.
   7. 11.7T MRG'yi aşağıdaki gibi çalıştırın: T2 Turbo NADİR; TE/TR = 30.0/3000 ms; ortalama = 2; Yankı aralığı = 10.000 ms; NADİR faktörü = 8; dilim sayısı = 30; dilim kalınlığı = 1 mm; görüntü boyutu = 128 x 128; Görüş Açısı = 28 mm x 28 mm; dilim çözünürlüğü = 0,219 x 0,219 mm²; FA = 90.0° olur.
      NOT: MRI görüntüleme, başarılı PHHP modellemesine dair kanıt sağlarken, PHHP'yi doğrulamak için belirli bir kohorttaki tüm beyinleri taramak gerekli değildir. IAM ve ICP ölçümü, yukarıda açıklandığı gibi doğrulamak için yeterlidir. Sonuç olarak, bir araştırmacının in vivo veya ex vivo MRG gerçekleştirme yeteneği, MRI tarayıcı erişimi, fonlar ve teknik yetenek gibi çeşitli faktörlere bağlı olacaktır. Bu adım, PHHP modelini yeni dahil ederken doğrulama için özellikle yararlıdır. Yüksek açılma basıncı gibi belgelenmiş kafa içi basınç belirtilerinin yokluğunda, MRG görüntülemede izole edilmiş ventrikülomegali bulgularının hidrosefaliyi temsil etmediğini belirtmek önemlidir.

Bu modeli kullanarak, parçalanmış kırmızı kan hücrelerinin enjeksiyonundan sonraki günler ve haftalarda hidrosefali gelişir. Tipik bir deneysel tasarımın ve hidrosefalinin ilerlemesinin bir temsili Şekil 1'de verilmiştir. Grup başına 5-6 sahte hayvan ve 6-8 PHHP hayvan değerlendirildi. Gençler olarak, PHHP'li sıçanlar makrosefali (Şekil 2), artmış intrakraniyal basınç (Şekil 3) ve ventrikülomegali (Şekil 4) sergiledi. Bu bulguların takımyıldızı ve kombinasyonu hidrosefaliyi temsil eder. Bu sıçanlar ayrıca gelişimsel gecikmeye⁽¹⁹) sahiptir ve yetişkinler olarak kalıcı bilişsel zorluklar ve yüksek ICP ile hayatta kalırlar. Erkeklerin hidrosefali geliştirmeye daha yatkın olduğu klinik senaryoyu tekrarlayan bu modelde¹⁹ erkekler kadınlardan daha kötü performans gösterir ^3,19. Hidrosefaliyi incelemek için bu deneysel platformu kullanan araştırmacılar, ilerleyici makrosefali ve IVH indüksiyonunu takip eden 5 gün boyunca gelişen ve yaşam boyu sürdürülen kubbeli bir kafatasını görselleştirerek prosedürün başarılı bir şekilde tamamlandığını doğrulayabileceklerdir (Şekil 2). Kalıcı makrosefali, başarılı bir prosedürün temel, klinik olarak önemli, kolayca tanımlanabilir bir işaretidir. Doğum sonrası 21. günde (P21), IAD'lerde (klinik olarak kullanılan baş çevresinin vekili) ve açılma basıncında istatistiksel olarak anlamlı artışlar ölçülebilir (Şekil 3). Benzer şekilde, ventrikülomegali ve ventriküler hacimdeki artışlar, sahte kontrollere kıyasla MRG ve histolojide gözlenebilir (Şekil 4)^1,2,19. Ventriküler hacmin yapısal MRG görüntüleme veya kresil menekşe veya hematoksilen ve eozin boyama gibi standart histolojik prosedürlerle ölçülmesi, daha sofistike difüzyon ve fonksiyonel görüntüleme için mükemmel bir tamamlayıcıdır. Bu veriler, makrosefali, ventriküler genişlemeye yol açan bozulmuş BOS dinamikleri ve yüksek ICP dahil olmak üzere PHHP'nin klinik özellikleri ile tutarlıdır.

Şekil 1: Deney tasarımı. PHHP'yi indükleme protokolü, embriyonik 18. günde (E18) sıçanlarda koryoamniyonit indüksiyonu ve doğum sonrası 1. günde (P1) intraventriküler kanama ile başlar. Hidrosefali yaşam boyu gelişir ve gelişir ve yetişkinlik boyunca fonksiyonel tahliller de dahil olmak üzere birçok ölçümle değerlendirilebilir. Kısaltmalar: PHHP = prematüre pozitorajik hidrosefali; IVH = intraventriküler kanama. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: PHHP'yi gösteren makrosefali. PHHP'li sıçanlar, sahte kontrollere kıyasla genişlemiş, kubbeli kafatası ve makrosefali vardır. Kısaltma: PHHP = prematüre pozitorajik hidrosefali. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Makrosefali ve artmış kafa içi basıncının ölçülmesi. PHHP'li sıçanlar (n = 8), doğum sonrası 21. günde (P21) sahte kontrollere (n = 5-6) kıyasla artmış intra-aural mesafeye (baş çevresi için bir vekil) ve artmış açılma basıncına (kafa içi basınç, n = 6) sahiptir. (T-testi **p < 0.01, hata çubukları ortalamanın standart hatasını temsil eder). Kısaltma: PHHP = prematüre pozitorajik hidrosefali. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: PHHP'li sıçanlar orta-şiddetli ventrikülomegaliye sahiptir. PHHP'li sıçanlar, manyetik rezonans görüntülemede açıkça tanımlanabilen sahte kontrollere kıyasla genişlemiş ventriküllere ve artmış ventriküler hacme sahiptir. (A) T2 yapısal görüntüleme, P21'de anteriordan posteriora koronal düzlemde ventriküler dilatasyonu gösterir. (B) PHHP sıçanlarında sahte hayvanlara kıyasla ventriküler hacim artışları, P60'ta yetişkin sıçanlarda eksenel, koronal ve sagital düzlemlerde de görülebilir. Ventriküler hacimler (C) MRG (n = 5-7 / grup) kullanılarak ölçülebilir ve herhangi bir yaşta ventriküler sistemin (D) 3D rekonstrüksiyonu ile eşleştirilebilir. (T-testi **p < 0.01, hata çubukları ortalamanın standart hatasını temsil eder). Kısaltma: PHHP = prematüre pozitorajik hidrosefali. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

PHHP'nin indüksiyonu için bu protokol, doğumdan yetişkinliğe kadar kronik ICP, ventrikülomegali ve makrosefali yükselmesi dahil olmak üzere hidrosefalinin fenotipik ayırt edici özellikleri ile birlikte beyin yapısı ve fonksiyonunun titiz, ölçülebilir ve klinik olarak çevrilebilir sonuç ölçümlerine izin verir⁴. Biyokimyasal, histolojik ve fonksiyonel tahliller, koroid pleksus, ependima ve glifatik sistemin yanı sıra gri ve beyaz cevherin sağlığını değerlendirmek için kullanılabilir¹⁹. Ek olarak, bu model, fonksiyonel BOS ve canlı hücreli silia görüntülemenin multimodal nörogörüntüleme ve biyodavranışsal sonuçlarla entegrasyonunu destekleyebilir. Ventriküler mikroçevreyi titizlikle değerlendirmek için çok parametreli akış sitometrisi ve dinamik nöral hücre tahlilleri kullanan mekanik çalışmaları histoloji ve immünokimya ile birleştirmek için de kullanılabilir. Dijital yürüyüş değerlendirmeleri ve biliş ve yürütücü işlevin dokunmatik ekran testi ile birlikte ^2,19, bu yaklaşım, daha önce PHHP'nin translasyonel çalışmalarında kullanılmayan hücresel, sıvı ve nörodavranışsal biyobelirteçlerin değerlendirilmesine izin verebilir.

PHHP'li çocukların aileleri için, dayanıklı şant fonksiyonundan sonra en yüksek öncelik, bilişsel sonucun iyileştirilmesi ve cerrahi olmayan tedavi stratejilerinin vaadidir 47,48,49. Bu ihtiyaçları karşılamak için farmakoterapilerin geliştirilmesi, PHHP ^2,47,48,49 olan çocukların bakımını dönüştürmenin ilk adımıdır. Bu klinik öncesi model, ilaç rejimlerini ve gelişmekte olan ilaçları test etmek için uygundur. BOS dinamiklerini modüle etmek için tasarlanmış cerrahi olmayan müdahalelerin ve farmakolojik tedavilerin değerlendirilmesi için uygundur. Bu ilaçlar sıçanlarda birden fazla uygulama yolu ile verilebilir (ör., intraperitoneal, intravenöz, subkütan, ozmotik mini pompa) ve hidrosefali ve ventrikülomegali, görüntüleme ve klinik belirtiler kullanılarak yaşam boyu izlenebilir, izlenebilir ve ölçülebilir. Ventriküler hacim, beyaz madde kaybı ve fonksiyonel bağlantı dahil olmak üzere beyin sağlığının birçok yönü de test edilebilir. Histoloji, immünohistokimya, qPCR ve ilgili deneyler, belirli bölgelerden ve gelişimsel olarak farklı uç noktalardan doku toplanması üzerinde gerçekleştirilebilir. Sıçanlarda çalışmak için bu platform, serebral palsi, epilepsi ve kronik ağrı dahil olmak üzere hidrosefali ile ilişkili komorbid durumların incelenmesini de kolaylaştırabilir⁴.

Bu modelde mortalite %3-7'dir ve en sık IVH'den sonraki ilk 48 saat içinde görülür ^19,44. Bazen, sıçan yavruları kilo alamaz ve etkili bir şekilde beslenemez. Bu gelişme başarısızlığı, başarılı bir prosedürle ilişkili ilerleyici makrosefalinin veya zayıf ICV enjeksiyon tekniğinin neden olduğu kortikal/subkortikal kanamanın doğrudan bir sonucu olabilir. Gerekli hassasiyetin olmaması durumunda kortikal hemorajik enfarktüs veya kafa tabanı travması görülebilir. Doğum sonrası bakım, yavruların kafa şekli, vücut büyüklüğü ve davranış açısından sahte kontrollerden belirgin şekilde farklı olması nedeniyle tanımlanan doğum öncesi veya doğum sonrası müdahalelerle bozulabilir. Gelişmiş nöroanatomik yeterlilik ile birlikte uygun cerrahi ve enjeksiyon tekniği, yukarıdaki temsili sonuçların tam olarak gerçekleştirilmesini sağlamak için çok önemlidir.

Bu preklinik platform, hamile sıçanlarda açık abdominal laparotomi yapılmasını gerektirir. Bu ileri cerrahi beceri gerektirir. Doğum sonrası dönemde, parçalanmış eritrositlerin lateral ventriküllere doğru bir şekilde enjekte edilmemesi IVH veya PHHP ile sonuçlanmaz ve bu sıçanlar ilerleyici makrosefali, yüksek açılış basıncı veya ventrikülomegali gösterecek şekilde büyümez. Serbest el enjeksiyonları ve yenidoğan kemirgenlerinin ventriküler anatomisi ile konfor çok önemlidir. Özellikle, açık bıngıldaklar ve nispeten ince kafatasları, transillüminasyonu mümkün kılar ve bregma gibi nöroanatomik işaretlerin ve iğnenin başarılı bir şekilde yerleştirilmesi için gerekli olan lateral ventriküllerin dorsal yönlerinin tanımlanmasını kolaylaştırır. Her iki lateral ventriküle erişilmezse tek taraflı IVH mümkündür ve bu geçici ancak kalıcı makrosefali olmayabilir. Ventriküler erişim sonrası BOS çıkışı, başarılı enjeksiyonların uygun bir göstergesidir. Benzer şekilde, parçalanmış eritrositlerin enjeksiyonundan önce BOS'un iğne göbeğine aspirasyonu, enjektörün enjeksiyona devam etmek için uygun ventriküler boşlukta olmasını sağlar. MRG'de ventrikülomegali, hidrosefali (ensefalomalazi) yokluğunda mevcut olabilirken, bu bulgunun kombinasyonu, yüksek açılış basıncı ve nörobilişsel defisitlerle birlikte, PHHP tekniğinin başarılı bir şekilde uygulanmasını temsil eder.

Prosedürel başarının analizi, parçalanmış RBC'lere ICV enjeksiyonu uygulanan yavrular ile sahte yavrular arasında veya ICV enjeksiyonu yapılan yavrular ile koryoamniyonit yaşayan ancak parçalanmış RBC'lere ICV enjeksiyonu olmayan kontrol yavruları arasında yukarıdaki temsili metriklerin karşılaştırılmasıyla tespit edilebilir. Daha da önemlisi, sahte barajlar izofluranın yanı sıra laparotomi ve uterus dışsallaşmasına maruz kalır. Bununla birlikte, PHHP modelinden farklı olarak, amniyotik keseler ve uterus daha sonra karın boşluğuna geri döndürülür ve laparotomi, uterin arter tıkanıklığı veya LPS enjeksiyonu olmadan tamamlanır. Bu sahte barajlardan doğan yavrular, tipik olarak, uteroda (sahte fetüslerin yaşamadığı) TSHI + LPS'nin spesifik kombinasyonu ve ardından PHHP'ye yol açan IVH'nin spesifik kombinasyonu olduğundan, parçalanmış RBC enjeksiyonları almazlar. Ek olarak, TSHI + LPS veya IVH'ye maruz kalmayan yaş ve cinsiyet uyumlu kontrollere sahip olarak, modelin teknik başarısını doğrulayabiliyor ve sahte meslektaşlarının sonuçlarıyla müdahale alan PHHP kohortlarının sonuçlarını daha doğrudan karşılaştırabiliyoruz. Bu karşılaştırma, hem modelin hem de buradaki herhangi bir terapötik müdahalenin sağlam etkinlik testine izin verir.

Gerekli teknik yeterliliğe rağmen, bu model, yaşa uygun olması, sistemik inflamasyonu içermesi, yetişkinlik boyunca gelişen PHHP sekellerine sahip olması ve sofistike fonksiyonel testler ve nörogörüntüleme gibi translasyonel sonuç ölçütlerini değerlendirme fırsatı sağlaması nedeniyle diğer erken IVH ve hidrosefali modellerine göre avantajlıdır ^30,50,51,52. Aynı zamanda sürekli ventrikülomegali ve yüksek ICP sağlar. Parçalanmış RBC'lerin kullanımı, bu modelin çeviri alaka düzeyini artırır. IVH geçiren erken doğmuş bebeklerin ventriküllerine tam kan salınır. Bu kan ventriküler BOS sisteminde kalır ve haftalar içinde bozulur (RBC lizisi), ventriküllerde kalıcı bir enflamatuar yanıta yol açar, bu da genellikle rutin kafa ultrasonunda ependimal hiper-ekojenite^{olarak görülür 53,54}. Parçalanmış eritrositlerin kullanımı, hidrosefali ve sürekli ventrikülomegali⁵⁵ oluşturmada bireysel kan ürünlerinin/bileşenlerinin etkinliğini değerlendiren önceki çalışmaları destekler ve doğrular. Paketlenmiş eritrositlerin aksine, parçalanmış eritrositlerin intraventriküler enjeksiyonu, enjeksiyondan 24 saat sonra ve ^19,55'in ötesinde MRG'de önemli ölçüde genişlemiş ventriküllerle sonuçlanır. Parçalanmış RBC enjeksiyonunun, paketlenmiş RBC veya salin enjeksiyonu⁵⁵ ile karşılaştırıldığında periventriküler boşluktaki beyin hemoksijenaz-1 ve ferritin seviyelerini yukarı regüle ettiği bulunmuştur. Bu, insan IVH'nin patofizyolojisinin büyük ölçüde ilk kanın parçalanmasına ve ortaya çıkan doku hasarı ile birlikte demir bozunma ürünlerinin ve diğer kan bileşenlerinin kademeli olarak salınmasına bağlı olması nedeniyle önemlidir.

Heme-oksijenaz 1, hem bozunmasında önemli bir enzimdir ve ferritin bir demir depolama proteinidir; bu nedenle, parçalanmış RBC enjeksiyonundan sonra artan periventriküler konsantrasyonları, insan IVH etiyolojisi ile yakından uyumludur. Son olarak, demirin sadece ventriküler boşluklara enjekte edilmesi, karbonik anhidraz 29 gibi RBC'lerin diğer bileşenlerini ihmal eder. Ek olarak, demir enjeksiyonu, indüklenen IVH'nin potansiyel şiddetini maksimize etmez, bu da sonraki hidrosefali olasılığı ile doğrudan ilişkilidir. Parçalanmış RBC'leri kullanma seçimi gibi, her iki ventrikülü de enjekte etmenin ardındaki mantık translasyonu arttırmaktır. Klinik literatür, daha şiddetli IVH ile müteakip PHHP arasında belirgin bir artmış ilişki olduğunu göstermektedir. Kanamaların kendi başına iki taraflı olarak tanıtılması, IVH'nin şiddetini ve ayrıca germinal matriksten ventriküler boşluklara yayılma olasılığını ve bunun sonucunda ortaya çıkan ventriküler dilatasyonu arttırır - daha şiddetli IVH'nin bir başka özelliği. Ek olarak, yukarıda açıklandığı gibi, bilateral enjeksiyon, BOS iletişimini değerlendirmek için bir moda da izin verir. Yirmi mikrolitre, sürekli hidrosefaliyi güvenilir bir şekilde elde etmek için en düşük hacimdir ve sıçan yavrusu mortalitesinin karmaşık bir değişken haline gelmesine neden olacak şekilde önemli parankimal tutulum yoktur.

Sonuç olarak, ilerleyici makrosefali, yüksek intrakraniyal basınç, ventrikülomegali ve yetişkinliğe bilişsel gecikme dahil olmak üzere PHHP'nin klinik yönlerini özetleyen bir hayvan modelinin kullanılması, alana titizlik katmakta ve yeni terapötik yaklaşımlar için gerekli olan benzersiz ve benzersiz çalışmaları kolaylaştırmakta ve bu yaygın perinatal beyin hasarı formunun karmaşık patofizyolojisinin mekanik olarak daha iyi anlaşılmasını sağlamaktadır.

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Yazarlar, Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01HL139492), Kongre Tarafından Yönlendirilen Tıbbi Araştırma Programı (W81XWH1810166, W81XWH1810167, W81XWH2210461 ve W81XWH2210462), Hidrosefali Derneği ve Rudi Schulte Araştırma Enstitüsü tarafından sağlanan finansman için minnettardır.