Modelización de la hidrocefalia poshemorrágica de la prematuridad en ratas

La hidrocefalia poshemorrágica del prematuro (PHHP, por sus siglas en inglés) se puede modelar en ratas neonatas mediante la combinación de corioamnionitis y hemorragia intraventricular. La combinación de estos eventos prenatales y postnatales recapitula con precisión las características clínicas distintivas de la PHHP, incluida la macrocefalia, la ventriculomegalia y la presión intracraneal elevada, a lo largo de la vida.

La hidrocefalia poshemorrágica del prematuro (PHHP, por sus siglas en inglés) es una secuela grave de una hemorragia intraventricular grave (IVH, por sus siglas en inglés) en recién nacidos muy prematuros con menos de 32 semanas de edad gestacional (AG). La PHHP se define por la acumulación de líquido cefalorraquídeo (LCR) asociada a síntomas clínicos de presión intracraneal (PIC) elevada. Los lactantes con PHHP sufren dependencia de la derivación de por vida, y la mitad de ellos requiere cirugía repetida en el primer año de vida y muchos requieren múltiples cirugías adicionales a lo largo de la vida. La corioamnionitis prenatal predispone a los recién nacidos prematuros a una hemorragia intraventricular grave y a la necesidad de tratamiento quirúrgico de las tendencias de PHHP con sepsis neonatal. Estas características clínicas sugieren que la inflamación sistémica es un componente integral de la fisiopatología de la PHHP.

Aquí, definimos un modelo animal que recapitula todos los aspectos clínicos y características esenciales de PHHP en ratas. El objetivo de este protocolo es ilustrar cómo la corioamnionitis intrauterina y la hemorragia intraventricular postnatal con glóbulos rojos lisados pueden combinarse para producir PHHP. Este abordaje preclínico produce macrocefalia progresiva y cráneos abovedados, presión intracraneal elevada y ventriculomegalia que se pueden detectar mediante imágenes por resonancia magnética (RM) o mediante microscopía. Además de la interrupción sostenida en la dinámica del LCR, las ratas también tienen retraso cognitivo y discapacidad funcional en la edad adulta. En consecuencia, esta plataforma preclínica facilita estudios traslacionales únicos e incomparables de PHHP que pueden incorporar medidas de resultados moleculares, celulares, bioquímicas, histológicas, de imágenes y funcionales. También se puede utilizar para el análisis riguroso del plexo coroideo, los cilios móviles ependimarios y el sistema glinfático en paralelo. Por último, también puede ser una herramienta preclínica invaluable para la investigación de nuevas estrategias de intervención quirúrgica y enfoques terapéuticos no quirúrgicos para el tratamiento de la hidrocefalia.

La hidrocefalia poshemorrágica del prematuro (PHHP, por sus siglas en inglés) sigue siendo un problema importante de salud pública. Definida por la acumulación sintomática de líquido cefalorraquídeo (LCR) concomitante con presión intracraneal (PIC) elevada secundaria a hemorragia intraventricular (HIV), la HPH es una manifestación grave de la encefalopatía del prematuro y un contribuyente significativo a la carga global de prematuridad e hidrocefalia adquirida ^1,2. A nivel mundial, aproximadamente 400.000 lactantes nacen cada año con hidrocefalia o adquieren la carga de por vida de la hidrocefalia³ y muchos mueren debido a la falta de tratamiento³. La PHHP es común en los países desarrollados en recién nacidos muy prematuros (<32 semanas de gestación) con IVH grave, y a menudo afecta a los lactantes más enfermos que ya sufren otras comorbilidades potencialmente mortales ^4,5.

El único tratamiento disponible para la hidrocefalia es la cirugía⁶. Los procedimientos quirúrgicos producen una mayor longevidad cuando los lactantes tienen más de 6 meses en el momento de la primera intervención permanente, ya sea para una derivación ventriculoperitoneal (VP) para desviar el líquido cefalorraquídeo (LCR), una endoscópica del tercer ventriculostomía (ETV) o una ETV con coagulación del plexo coroideo (ETV-CPC)⁷. La opción más común, las derivaciones VP, a menudo fallan en un año y predisponen a los niños a una vida de complicaciones, cirugías repetidas y hospitalizaciones a un costo tremendo para el niño, la familia y la sociedad. ⁸ En particular, la ansiedad de que una derivación pueda fallar en cualquier momento es una carga para las familias⁹. La atención a los niños con hidrocefalia sintomática, incluidas las cirugías frecuentes, es una de las principales causas de gasto en atención médica pediátrica 10,11,12,13,14. El costo anual estimado de los gastos relacionados con la derivación en niños fue de 2.000 millones de dólares en 2003¹⁵. Mientras que los niños con derivaciones representan solo el 0,6% de las admisiones hospitalarias, generan el 3,1% de los gastos hospitalarios pediátricos¹⁵. Por lo tanto, el descubrimiento de terapias seguras y no quirúrgicas para el tratamiento de la PHHP es primordial.

En los bebés, la PHHP se desarrolla después de la hemorragia intraventricular durante un curso clínico que dura semanas o meses después de la identificación inicial de la hemorragia cerebral. Un estudio realizado por la Red de Investigación Clínica de Hidrocefalia (HCRN) confirmó que las derivaciones VP siguen siendo la mejor opción quirúrgica para los neonatos con PHHP¹⁶. Incluso para los niños con PHHP en países de ingresos altos con acceso a atención neuroquirúrgica pediátrica especializada, los resultados están lejos de ser óptimos, con >50% de las derivaciones colocadas en lactantes con PHHP que requieren revisión quirúrgica dentro de los primeros 2 años⁸. A pesar de la clara necesidad de identificar tratamientos más seguros y eficaces para la PHHP, la investigación se ha enfrentado a obstáculos. El progreso se ha visto obstaculizado en parte porque la literatura preclínica sobre PHHP a menudo no distingue adecuadamente la ventriculomegalia causada por hidrocefalia ex vacuo^17,18 de la hidrocefalia sintomática con macrocefalia^19,20. De hecho, los modelos de desarrollo de la hidrocefalia deben incluir la macrocefalia progresiva y/o las mediciones de la PIC elevada¹.

La combinación de conocimientos clínicos y preclínicos ha mejorado el diseño del estudio e impulsado nuestra comprensión de PHHP². Estudios realizados en diversos centros de todo el mundo han demostrado que la hemorragia intraventricular es más frecuente en neonatos muy prematuros secundarios a corioamnionitis 21,22,23,24,25,26,27,28. Además de la infección e inflamación de la placenta, la sepsis neonatal es un factor de riesgo adicional importante y puede desempeñar un papel central en la progresión de la hemorragia intraventricular a la ventriculomegalia sintomática y a la posterior intervención quirúrgica²⁹. Los datos preclínicos y clínicos apoyan que la inflamación transmitida por la sangre puede causar hidrocefalia²⁰, y la inflamación sistémica aumenta la secreción de LCR por el plexo coroideo³⁰. Además, los adultos con hemorragia subaracnoidea y hemorragia intraventricular que también sufren de sepsis tienen muchas más probabilidades de requerir una derivación³¹. La literatura más reciente ha confirmado que la inflamación reduce la propulsión de los cilios móviles ependimarios del LCR 19,20,32 y la reabsorción del LCR por el sistema glinfático 33,34,35,36. En general, la inflamación sistémica es un factor fisiopatológico y clínico clave en la PHHP¹.

Teniendo en cuenta estos hallazgos, creamos un modelo preclínico de PHHP apropiado para la edad. Este modelo combina la hemorragia intraventricular en el postnatal inmediato y temprano con la corioamnionitis, principal causa de parto prematuro¹⁹. Este abordaje experimental comienza en el útero, con la insuficiencia placentaria, la inflamación placentaria y la inflamación intraamniótica que definen la corioamnionitis ^{7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,}
23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40^,41,42,
43,44,45. En concreto, recapitulamos un síndrome de respuesta inflamatoria fetal, neutrofilia placentaria y microambiente proinflamatorio del SNC en el período prematuro mediante laparotomía abdominal en madres de ratas embarazadas en el día embrionario 18 (E18)37,38,39,40,41,42,43,44,45. La lesión intrauterina es inducida por la oclusión temporal de la arteria uterina bilateral que conduce a hipoxia-isquemia sistémica transitoria (TSHI) seguida de inyección intraamniótica de lipopolisacárido (LPS)37,38,39,40,41,42,43,44,45. Posteriormente, para alterar la dinámica del LCR y catalizar el desarrollo de hidrocefalia en las crías nacidas vivas, se induce la hemorragia intraventricular en el día 1 postnatal. Esto se logra con la inyección intracerebroventricular (ICV) bilateral de glóbulos rojos (RBC) lisados en los ventrículos laterales 19,37,44. Las crías se estudian a medida que se desarrolla la hidrocefalia y a lo largo de su vida.

El Comité de Cuidado y Uso de Animales (ACUC, por sus siglas en inglés) de la Universidad Johns Hopkins aprobó todos los procedimientos experimentales descritos en este documento. Este protocolo utiliza madres y cachorros de ratas Sprague-Dawley preñadas de ambos sexos.

1. Inducción de corioamnionitis en E18

NOTA: La parte de insulto en el útero de este protocolo se ha publicado previamente en detalle, se resume arriba y es objeto de un protocolo JOVE separado y video 19,37,38,39,40,41,42,43,44,46. Brevemente, ratas hembras Sprague-Dawley preñadas se someten a una laparotomía abdominal en el día embrionario 18 (E18) para inducir corioamnionitis, que incluye TSHI y administración de LPS intraamniótico.

1. Anestesia
   1. Inducir la anestesia en la madre de ratas preñadas E18 con isoflurano al 2-4%.
   2. Retire la madre embarazada de la cámara de inducción y coloque a la rata en posición supina sobre una manta quirúrgica de agua circulante colocada a 37 °C.
   3. Aplique ungüento oftálmico para prevenir la sequedad de la córnea. Apriete suavemente una pata para confirmar la ausencia de reflejo de pellizco del dedo del pie. Controle la profundidad del anestésico cada 15-20 minutos y aumente el isoflurano en caso de una respuesta positiva al pinzamiento de los dedos del pie.
   4. Administrar buprenorfina de liberación prolongada (0,1 mg/kg SC) en la nuca.
2. Preparación quirúrgica y exfoliación
   1. Usando una técnica estéril estándar, afeita el abdomen.
   2. Frote el abdomen 3 veces con betadine alternado y etanol al 70%.
   3. Cubra al animal con paños quirúrgicos estériles.
3. Laparotomía abdominal
   1. Realice una incisión de 3 cm en la línea media de la piel abdominal preparada con un bisturí.
   2. Utilice fórceps y tijeras quirúrgicas para sujetar la capa fascial abdominal y haga una incisión de la línea avascular alba de la capa muscular para acceder a la cavidad peritoneal.
   3. Exteriorizar el útero.
   4. Aísle y pinje las arterias uterinas con clips para aneurismas durante 60 minutos. Mantenga la temperatura y mantenga húmedo el contenido intraabdominal con solución salina estéril.
   5. Retire las pinzas e inyecte 100 μL de LPS (4 μg/saco de solución de LPS) en cada saco amniótico de cada feto. No moleste al feto ni a la placenta.
   6. Irrigar los cuernos uterinos y plantar generosamente 3 veces con solución salina estéril.
4. Cierre de la laparotomía
   1. Reemplace los cuernos uterinos en la cavidad peritoneal.
   2. Reaproximar los bordes de la capa musculofascial y cerrar con una sutura 3-0 corrida.
   3. Vuelva a aproximar la capa de piel y cierre la piel con una sutura 3-0 en ejecución.
   4. Utilice una aguja de 26 G para inyectar bupivacaína al 0,125% por vía subcutánea alrededor de los bordes de la herida.
   5. En el caso de los controles simulados, realice la laparotomía durante el mismo período de tiempo para controlar la duración de la anestesia. No pinza las arterias y no administre inyecciones intraamnióticas. Al final del procedimiento, cierre la laparotomía en dos capas (fascia muscular abdominal y piel) con sutura 3-0. En todos los casos, las crías nacen a término (E21/22) y son cuidadas por la madre.

2. Preparación de glóbulos rojos lisados en P1

1. Recolección de sangre
   1. Tome un cachorro de rata Sprague-Dawley macho y una hembra en el día postnatal 1 (P1) de una camada que experimentó corioamnionitis en E18. Decapita rápidamente a cada cachorro donante con tijeras quirúrgicas específicas.
      NOTA: Utilizamos 1 cachorro macho y 1 hembra para la recolección de sangre para eliminar un posible sesgo sexual al representar a cada uno en las cohortes de donantes. Además, utilizamos una pareja emparejada por sexo para garantizar suficiente volumen y rendimiento de glóbulos rojos lisados para inyectar a sus compañeros de camada. Por lo general, cada cachorro donante produce suficientes glóbulos rojos lisados para realizar la inyección de ICV en un máximo de 4-5 compañeros de camada.
   2. Recoja la sangre inmediatamente en un tubo de microcentrífuga de 2 mL que contenga 0,2 mL de solución salina estéril, teniendo cuidado de recolectar solo la sangre que fluye libremente después de la decapitación y no raspar ni apretar para producir más sangre, ya que esto conduce a una hemólisis prematura. Pozo de vórtice.
      NOTA: La cantidad exacta de sangre varía según el animal donante y el peso individual, pero debe ser máxima manteniendo las precauciones anteriores.
   3. Picar o picar los coágulos de sangre con unas tijeras quirúrgicas pequeñas.
   4. Centrifugar la suspensión sanguínea a 500 × g durante 10 min a 4 ^oC, retirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet en 0,2 mL de solución salina estéril. Pozo de vórtice.
   5. Picar / picar los coágulos de sangre residuales posteriores al vórtice con tijeras quirúrgicas pequeñas.
   6. Repita los pasos 2.1.4-2.1.5 dos veces más para un total de 3 veces, limpiando las tijeras quirúrgicas con etanol en aerosol al 70% entre cada ronda de lisado.
2. Lisis de glóbulos rojos
   1. Después de la centrifugación final, agregue 0,25 mL de solución salina estéril al pellet; pozo de vórtice.
   2. Coloque la suspensión sobre hielo seco durante 5 min.
   3. Retire la suspensión del hielo seco, colóquela en una incubadora a 37,5 ^oC durante 5 minutos hasta que se descongele por completo y haga un buen vórtice.
   4. Repita los ciclos de congelación y descongelación por un total de 3 veces (tres congelaciones y tres descongelaciones).
   5. Al final del último deshielo, haga vórtice y realice un giro rápido. Los glóbulos rojos ya están lisados y listos para usar.
      NOTA: La mezcla debe tener un color opaco similar al jugo de tomate y debe introducirse fácilmente en las jeringas.

3. Inyecciones intracerebroventriculares de glóbulos rojos lisados en P1

1. Anestesia mediante hipotermia
   1. Coloque una pequeña plataforma sobre hielo húmedo para que se enfríe.
   2. Coloque una toallita de laboratorio seca encima para proteger la piel del cachorro.
      NOTA: Esta superficie plana y fría se utiliza para anestesiar e inyectar a los cachorros.
   3. Transfiera al cachorro (P1 de edad) desde la almohadilla térmica a la toallita de trabajo sobre la plataforma fría para inducir la anestesia por hipotermia.
   4. Confirme la profundidad de la anestesia apretando una pata y confirmando la ausencia del reflejo de pinzamiento del dedo del pie.
   5. Ajuste una lámpara quirúrgica externa a sus configuraciones más brillantes.
   6. Con un asistente que usa sus dedos índice y medio para mantener suavemente la línea media de la cabeza del animal, transilumine el cráneo para visualizar los ventrículos laterales a través del cráneo. Identifique el bregma visualizando el seno sagital superior (línea media) a través de la piel y la palpación de la sutura coronal con pinzas finas como puntos de referencia que se cruzan.
2. Inyección de ICV
   1. Limpie la cabeza del cachorro anestesiado con un hisopo de algodón empapado en etanol al 70%.
   2. Identifique y marque el lugar de la inyección como 1 mm lateral de la sutura sagital, a medio camino entre lambda y bregma.
   3. Después de la visualización, utilice una jeringa de insulina de 0,3 ml, 8 mm de largo y 31 g con una aguja percutánea ultrafina para inyectar 20 μl de glóbulos rojos lisados en el ventrículo lateral derecho. Inserte la aguja directamente hacia abajo utilizando la técnica a mano alzada hasta una profundidad de aproximadamente la mitad de la longitud de la aguja e inyecte y retire la aguja lentamente (proceso de inyección y extracción durante aproximadamente 10-15 s).
   4. Deje la aguja en su lugar durante varios segundos después de la inyección para evitar la salida de los glóbulos rojos lisados inyectados.
   5. Repita con el ventrículo lateral izquierdo e inyecte 20 μL de glóbulos rojos lisados.
   6. Coloque al cachorro en una almohadilla térmica a 37,5 ^oC para recuperarse de la anestesia.
   7. Registre el sexo del cachorro y asigne un identificador único de animal.
   8. Regrese al cachorro a la jaula de inicio solo después de que se haya recuperado por completo en la almohadilla de calentamiento y haya recuperado la conciencia de modo que el animal pueda mantener la decúbito esternal de manera segura.
   9. Monitoree a diario a todas las crías de rata para verificar su salud y bienestar.

4. Confirmación de éxito de hemorragia intraventricular bilateral en P2

1. Ecografía de la cabeza
   1. Para prepararse para la ecografía de la cabeza, retire a los cachorros P2 de su jaula doméstica.
   2. Coloque gel de ultrasonido en la sonda de ultrasonido y coloque la sonda sobre la parte superior del cráneo.
   3. Con una presión extremadamente ligera, mueva la sonda para visualizar los ventrículos. Confirmar la hiperecogenicidad bilateral en los ventrículos laterales representativos de la hemorragia intraventricular.

5. Confirmación de hidrocefalia poshemorrágica exitosa

1. Medición de la distancia intraaural (DIA), un sustituto de la circunferencia de la cabeza, para confirmar la macrocefalia
   1. Para prepararse para la medición, adquiera una pequeña cinta métrica apropiada para medir la circunferencia de la cabeza, idealmente con designaciones de milímetros claramente visualizadas.
   2. Pídele a un observador enmascarado que saque al cachorro de la jaula de su casa.
   3. Mientras sostiene suavemente al cachorro, mida la distancia de oreja a oreja (distancia intraaural, IAD) y registre el valor en milímetros.
   4. Repita el IAD diariamente de P1 a P15 y grafique los valores. Realice un seguimiento en serie de la IAD y vuelva a medir en P21 al reubicar a las crías en nuevas jaulas separadas físicamente de la madre (que es el punto de tiempo estándar para el destete de las crías). Repita la IAD posteriormente cada 5 días a partir de P25 hasta P60.
2. Medición de la presión de apertura para confirmar la presión intracraneal elevada
   1. Pídele a un observador enmascarado que saque al cachorro de su jaula de origen.
   2. Anestesiar con 75-100 mg/kg de ketamina intraperitoneal (IP) y 5-10 mg/kg de xilacina IP en preparación para la eutanasia.
   3. Verifique la profundidad de la anestesia apretando una pata y confirmando la ausencia del reflejo de pellizco del dedo del pie/pedal.
   4. Inserte una aguja pequeña (31 G) conectada a un manómetro en el espacio del líquido cefalorraquídeo de la unión cervicomedular.
   5. Registre la presión de apertura en el manómetro.
   6. Retire la aguja y decapita a la rata con unas tijeras afiladas y proceda a la recolección de tejidos.
3. Resonancia magnética (RM) ex vivo para la evaluación de la ventriculomegalia
   1. Anestesiar con 75-100 mg/kg de ketamina intraperitoneal (IP) y 5-10 mg/kg de xilacina IP en preparación para la eutanasia.
   2. Verifique la profundidad de la anestesia apretando una pata y confirmando la ausencia del reflejo de pellizco del dedo del pie/pedal.
   3. Perfundir las ratas con solución salina tamponada con fosfato (PBS), seguida de paraformaldehído (PFA) al 4% hasta que se fijen bien.
   4. Extirpar el cerebro y fijarlo en PFA al 4%
   5. Incrustar el cerebro en agarosa al 2% en un tubo cónico de 50 mL. Déjalo reposar a temperatura ambiente.
   6. Transfiera el cerebro al escáner de resonancia magnética para una resonancia magnética ex vivo .
   7. Ejecute 11.7T MRI de la siguiente manera: T2 Turbo RARE; TE/TR = 30,0/3000 ms; promedio = 2; Espaciado de eco = 10.000 ms; Factor de rareza = 8; número de rebanadas = 30; espesor de la loncha = 1 mm; tamaño de la imagen = 128 x 128; FOV = 28 mm x 28 mm; resolución de corte = 0,219 x 0,219 mm²; FA = 90,0°.
      NOTA: Si bien las imágenes de resonancia magnética proporcionan evidencia de un modelado exitoso de PHHP, no es necesario escanear todos los cerebros de una cohorte determinada para verificar el PHHP. La medición de IAM e ICP es suficiente para verificar como se describe anteriormente. En última instancia, la capacidad de un investigador para realizar resonancias magnéticas in vivo o ex vivo dependerá de una variedad de factores, como el acceso al escáner de resonancia magnética, los fondos y la capacidad técnica. Este paso es particularmente útil para la validación cuando se incorpora recientemente el modelo PHHP. Es clave señalar que, en ausencia de signos documentados de aumento de la presión intracraneal, como una presión de apertura elevada, los hallazgos aislados de ventriculomegalia en las imágenes de RMN no representan hidrocefalia.

Con este modelo, la hidrocefalia se desarrolla en los días y semanas posteriores a la inyección de glóbulos rojos lisados. En la Figura 1 se proporciona una representación de un diseño experimental típico y la progresión de la hidrocefalia. Se evaluaron 5-6 animales simulados y 6-8 animales PHHP por grupo. Cuando eran jóvenes, las ratas con PHHP exhibieron macrocefalia (Figura 2), presión intracraneal elevada (Figura 3) y ventriculomegalia (Figura 4). La constelación y la combinación de estos hallazgos representan la hidrocefalia. Estas ratas también tienen retraso en el desarrollo¹⁹ y, como adultas, sobreviven con dificultades cognitivas persistentes y PIC elevada. Los hombres se comportan peor que las mujeres en este modelo¹⁹, lo que replica el escenario clínico donde los hombres son más propensos a desarrollar hidrocefalia ^3,19. Los investigadores que utilicen esta plataforma experimental para estudiar la hidrocefalia podrán confirmar la finalización exitosa del procedimiento mediante la visualización de una macrocefalia progresiva y un cráneo abovedado que se desarrolla en el transcurso de 5 días después de la inducción de la hemorragia intraventricular y se mantiene durante toda la vida (Figura 2). La macrocefalia sostenida es un signo esencial, clínicamente importante y fácilmente identificable de un procedimiento exitoso. Hacia el día 21 postnatal (P21), se pueden cuantificar aumentos estadísticamente significativos en los IAD (sustitutos de la circunferencia cefálica utilizados clínicamente) y en la presión de apertura (Figura 3). Del mismo modo, la ventriculomegalia y el aumento del volumen ventricular son observables en la resonancia magnética y la histología en comparación con los controles simulados (Figura 4)^1,2,19. La cuantificación del volumen ventricular, ya sea mediante imágenes de resonancia magnética estructural o mediante procedimientos histológicos estándar como la tinción con violeta de cresilo o hematoxilina y eosina, es un excelente complemento para la difusión más sofisticada y las imágenes funcionales. Estos datos son consistentes con las características clínicas de la PHHP, incluyendo macrocefalia, alteración de la dinámica del LCR que conduce a la expansión ventricular y elevación de la PIC.

Figura 1: Diseño experimental. El protocolo para inducir PHHP comienza con la inducción de corioamnionitis en ratas en el día embrionario 18 (E18) y hemorragia intraventricular en el día postnatal 1 (P1). La hidrocefalia se desarrolla y evoluciona a lo largo de la vida y puede evaluarse mediante múltiples métricas, incluidos ensayos funcionales, hasta la edad adulta. Abreviaturas: PHHP = hidrocefalia poshemorrágica del prematuro; IVH = hemorragia intraventricular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Macrocefalia típica de la PHHP. Las ratas con PHHP tienen cráneos agrandados y abovedados y macrocefalia en comparación con los controles simulados. Abreviatura: PHHP = hidrocefalia poshemorrágica del prematuro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Cuantificación de macrocefalia y presión intracraneal elevada. Las ratas con PHHP (n = 8) tienen un aumento de la distancia intraaural (un sustituto de la circunferencia de la cabeza) y un aumento de la presión de apertura (presión intracraneal, n = 6) en el día 21 postnatal (P21) en comparación con los controles simulados (n = 5-6). (Prueba t **p < 0,01, las barras de error representan el error estándar de la media). Abreviatura: PHHP = hidrocefalia poshemorrágica del prematuro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Las ratas con PHHP tienen ventriculomegalia moderada-grave. Las ratas con PHHP tienen ventrículos agrandados y volumen ventricular aumentado en comparación con los controles simulados claramente identificables en las imágenes de resonancia magnética. (A) Las imágenes estructurales T2 muestran dilatación ventricular en el plano coronal de anterior a posterior en P21. (B) Los aumentos de volumen ventricular en ratas PHHP en comparación con los animales simulados también son visibles en los planos axial, coronal y sagital en ratas adultas en P60. Los volúmenes ventriculares pueden cuantificarse mediante resonancia magnética (C) (n = 5-7/grupo) y emparejarse con (D) reconstrucción 3D del sistema ventricular a cualquier edad. (Prueba t **p < 0,01, las barras de error representan el error estándar de la media). Abreviatura: PHHP = hidrocefalia poshemorrágica del prematuro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Este protocolo para la inducción de PHHP permite medidas de resultado rigurosas, cuantificables y clínicamente traducibles de la estructura y función cerebral concomitantes con las características fenotípicas de la hidrocefalia, incluida la elevación crónica de la PIC, la ventriculomegalia y la macrocefalia, desde el nacimiento hasta la edad adulta⁴. Los ensayos bioquímicos, histológicos y funcionales se pueden utilizar para evaluar la salud del plexo coroideo, el ependima y el sistema glinfático, así como la materia gris y blanca¹⁹. Además, este modelo puede respaldar la integración de imágenes funcionales de LCR y cilios de células vivas con neuroimágenes multimodales y resultados bioconductuales. También se puede utilizar para combinar estudios mecanicistas mediante citometría de flujo multiparamétrica y ensayos dinámicos de células neuronales con histología e inmunoquímica para evaluar rigurosamente el microambiente ventricular. Junto con las evaluaciones digitales de la marcha y las pruebas de pantalla táctil de la cognición y la función ejecutiva ^2,19, este enfoque puede permitir la evaluación de biomarcadores celulares, fluidos y neuroconductuales que no se utilizaban previamente en estudios traslacionales de PHHP.

Para las familias de niños con PHHP, la máxima prioridad después de la función de derivación duradera es la mejora del resultado cognitivo y la promesa de estrategias de tratamiento no quirúrgicas 47,48,49. El desarrollo de farmacoterapias para abordar estas necesidades es el primer paso para transformar la atención de los niños con PHHP 2,47,48,49. Este modelo preclínico es susceptible de probar regímenes farmacológicos y productos farmacéuticos emergentes. Es apropiado para la evaluación de intervenciones no quirúrgicas y tratamientos farmacológicos diseñados para modular la dinámica del LCR. Estos fármacos pueden administrarse a través de múltiples vías de administración en las ratas (es decir, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, minibomba osmótica) y su hidrocefalia y ventriculomegalia pueden rastrearse, monitorizarse y cuantificarse a lo largo de la vida mediante imágenes y signos clínicos. También se pueden analizar múltiples aspectos de la salud cerebral, como el volumen ventricular, la pérdida de materia blanca y la conectividad funcional. La histología, la inmunohistoquímica, la qPCR y los experimentos asociados se pueden realizar en la recolección de tejido de regiones específicas y criterios de valoración distintos en el desarrollo. Esta plataforma para el estudio en ratas también puede facilitar el estudio de las condiciones comórbidas asociadas a la hidrocefalia, incluyendo la parálisis cerebral, la epilepsia y el dolor crónico⁴.

La mortalidad en este modelo es del 3-7% y ocurre con mayor frecuencia en las primeras 48 h después de la IVH^19,44. Ocasionalmente, las crías de rata no logran aumentar de peso y alimentarse de manera efectiva. Este retraso en el crecimiento puede ser el resultado directo de una macrocefalia progresiva asociada con un procedimiento exitoso, o una hemorragia cortical/subcortical causada por una mala técnica de inyección de ICV. En ausencia de la precisión necesaria, se puede observar un infarto hemorrágico cortical o un traumatismo de la base del cráneo. La atención postnatal puede verse interrumpida por las intervenciones prenatales o posnatales descritas, ya que los cachorros son marcadamente diferentes de los controles simulados con respecto a la forma de la cabeza, el tamaño del cuerpo y el comportamiento. La técnica quirúrgica y de inyección adecuada, combinada con una competencia neuroanatómica avanzada, es crucial para garantizar que los resultados representativos anteriores se obtengan plenamente.

Esta plataforma preclínica requiere la realización de una laparotomía abdominal abierta en ratas preñadas. Esto requiere habilidad quirúrgica avanzada. En el período postnatal, la falta de inyección precisa de glóbulos rojos lisados en los ventrículos laterales no dará lugar a hemorragia intraventricular ni PHHP y estas ratas no crecerán para demostrar macrocefalia progresiva, presión de apertura elevada o ventriculomegalia. La comodidad con las inyecciones a mano alzada y la anatomía ventricular de los roedores neonatos es esencial. En particular, las fontanelas abiertas y los cráneos relativamente delgados hacen posible la transiluminación y facilitan la identificación de puntos de referencia neuroanatómicos como el bregma y los aspectos dorsales de los ventrículos laterales necesarios para la colocación exitosa de la aguja. La hemorragia intraventricular unilateral es posible si no se accede a ambos ventrículos laterales, y esto puede producir una macrocefalia transitoria pero no persistente. La salida del líquido cefalorraquídeo después del acceso ventricular es un indicador adecuado del éxito de las inyecciones. De manera similar, la aspiración de LCR en el centro de la aguja antes de la inyección de glóbulos rojos lisados garantiza que el inyector esté en el espacio ventricular adecuado para proceder con la inyección. Si bien la ventriculomegalia en la resonancia magnética puede estar presente en ausencia de hidrocefalia (encefalomalacia), la combinación de este hallazgo, junto con una presión de apertura elevada y déficits neurocognitivos, representa la ejecución exitosa de la técnica PHHP.

El análisis del éxito del procedimiento se puede determinar comparando las métricas representativas anteriores entre las crías que se sometieron a la inyección de ICV de glóbulos rojos lisados y las crías simuladas o en las crías que se sometieron a la inyección de ICV frente a las crías de control que experimentaron corioamnionitis pero no la inyección de ICV de glóbulos rojos lisados. Es importante destacar que las madres simuladas se someten a exposición al isoflurano, así como a laparotomía y externalización uterina. Sin embargo, a diferencia del modelo PHHP, los sacos amnióticos y el útero se devuelven a la cavidad abdominal y la laparotomía se completa sin oclusión de la arteria uterina ni inyección de LPS. Las crías nacidas de estas madres falsas generalmente no reciben inyecciones de glóbulos rojos lisados, ya que es la combinación específica de TSHI+LPS en el útero (que los fetos simulados no experimentan) seguida de IVH la que conduce a PHHP. Además, al tener controles emparejados por edad y sexo que no están expuestos a TSHI+LPS ni a IVH, podemos validar el éxito técnico del modelo y comparar más directamente los resultados de las cohortes de PHHP que recibieron intervención con los resultados de sus contrapartes simuladas. Esta comparación permite realizar pruebas sólidas de eficacia tanto del modelo como de cualquier intervención terapéutica en el mismo.

A pesar de la competencia técnica requerida, este modelo es ventajoso en comparación con otros modelos de hemorragia intraventricular temprana e hidrocefalia porque es apropiado para la edad, incorpora inflamación sistémica, tiene secuelas de PHHP en evolución hasta la edad adulta y brinda la oportunidad de evaluar medidas de resultado traslacionales como pruebas funcionales sofisticadas y neuroimagen 30,50,51,52. También produce ventriculomegalia sostenida y PIC elevada. El uso de glóbulos rojos lisados aumenta la relevancia traslacional de este modelo. A los recién nacidos prematuros que sufren hemorragia intraventricular se les libera sangre entera en los ventrículos. Esta sangre permanece en el sistema ventricular del líquido cefalorraquídeo y se degrada a lo largo de semanas (lisis de glóbulos rojos), lo que conduce a una respuesta inflamatoria persistente en los ventrículos, comúnmente observada en la ecografía cefálica de rutina como hiperecogenicidad ependimaria^53,54. El uso de glóbulos rojos lisados corrobora y corrobora trabajos previos que evalúan la eficacia de los productos/componentes sanguíneos individuales en la creación de hidrocefalia y ventriculomegalia sostenida⁵⁵. A diferencia de los glóbulos rojos empaquetados, la inyección intraventricular de glóbulos rojos lisados da lugar a un agrandamiento significativo de los ventrículos en la RM 24 h después de la inyección y después de^19,55. Se ha descubierto que la inyección de glóbulos rojos lisados regula al alza los niveles de hemoxigenasa-1 y ferritina en el espacio periventricular en comparación con la inyección de glóbulos rojos empaquetados o solución salina⁵⁵. Esto es importante ya que la fisiopatología de la hemorragia intraventricular humana se debe en gran medida a la descomposición de la sangre inicial y a la liberación gradual de productos de degradación del hierro y otros componentes de la sangre concomitantes con el daño tisular resultante.

La hemooxigenasa 1 es una enzima importante en la degradación del hemo, y la ferritina es una proteína de almacenamiento de hierro; por lo tanto, su mayor concentración periventricular después de la inyección de glóbulos rojos lisados se alinea estrechamente con la etiología de la IVH humana. Por último, inyectar hierro solo en los espacios ventriculares descuida otros componentes de los glóbulos rojos, como la anhidrasa carbónica 29. Además, la inyección de hierro no maximiza la gravedad potencial de la hemorragia intraventricular inducida, que se correlaciona directamente con la probabilidad de hidrocefalia posterior. Al igual que la elección de usar glóbulos rojos lisados, la razón detrás de la inyección de ambos ventrículos es aumentar la traducción. La literatura clínica muestra un claro aumento de la asociación entre una hemorragia intraventricular más grave y la PHHP posterior. La introducción de hemorragias bilaterales en sí misma aumenta la gravedad de la hemorragia intraventricular, así como la probabilidad de extensión desde la matriz germinal a los espacios ventriculares y la dilatación ventricular resultante, otra característica de la hemorragia intraventricular más grave. Además, como se describió anteriormente, la inyección bilateral también permite un modo para evaluar la comunicación del LCR. Veinte microlitros es el volumen más bajo para lograr de manera confiable una hidrocefalia sostenida y sin afectación parenquimatosa significativa de tal manera que la mortalidad de las crías de rata se convierta en una variable complicada.

En conclusión, el uso de un modelo animal que recapitula los aspectos clínicos de la PHHP, incluida la macrocefalia progresiva, la presión intracraneal elevada, la ventriculomegalia y el retraso cognitivo en la edad adulta, agrega rigor al campo y facilita estudios únicos e incomparables necesarios para nuevos enfoques terapéuticos y una mejor comprensión mecanicista de la compleja fisiopatología de esta forma común de lesión cerebral perinatal.

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Los autores están agradecidos por la financiación proporcionada por los Institutos Nacionales de Salud (R01HL139492), el Programa de Investigación Médica Dirigido por el Congreso (W81XWH1810166, W81XWH1810167, W81XWH2210461 y W81XWH2210462), la Asociación de Hidrocefalia y el Instituto de Investigación Rudi Schulte.