Modellierung des posthämorrhagischen Hydrozephalus der Frühgeburt bei Ratten

Der posthämorrhagische Hydrozephalus der Frühgeburt (PHHP) kann bei neugeborenen Ratten durch Kombination von Chorioamnionitis und intraventrikulärer Blutung modelliert werden. Die Kombination dieser pränatalen und postnatalen Ereignisse rekapituliert genau die klinischen Merkmale von PHHP, einschließlich Makrozephalie, Ventrikulomegalie und erhöhtem Hirndruck, über die gesamte Lebensspanne.

Der posthämorrhagische Hydrozephalus der Frühgeburt (PHHP) ist eine schwerwiegende Folge einer schweren intraventrikulären Blutung (IVH) bei sehr frühgeborenen Säuglingen unter 32 Wochen Gestationsalter (GA). PHHP ist definiert als die Ansammlung von Liquor cerebrospinalis (CSF), die mit klinischen Symptomen eines erhöhten intrakraniellen Drucks (ICP) einhergeht. Säuglinge mit PHHP leiden lebenslang an einer Shunt-Abhängigkeit, wobei die Hälfte im ersten Lebensjahr wiederholt operiert werden muss und viele im Laufe des Lebens mehrere zusätzliche Operationen benötigen. Die pränatale Chorioamnionitis prädisponiert Frühgeborene für eine schwere IVH und die Notwendigkeit einer chirurgischen Behandlung von PHHP-Trends mit neonataler Sepsis. Diese klinischen Merkmale deuten darauf hin, dass die systemische Entzündung ein integraler Bestandteil der PHHP-Pathophysiologie ist.

Hier definieren wir ein Tiermodell, das alle klinischen Aspekte und wesentlichen Merkmale von PHHP bei Ratten rekapituliert. Das Ziel dieses Protokolls ist es, zu veranschaulichen, wie in utero Chorioamnionitis und postnatale IVH mit lysierten roten Blutkörperchen kombiniert werden können, um PHHP zu erhalten. Dieser präklinische Ansatz führt zu einer fortschreitenden Makrozephalie und gewölbten Schädeln, einem erhöhten Hirndruck und einer Ventrikulomegalie, die mittels Magnetresonanztomographie (MRT) oder Mikroskopie nachgewiesen werden können. Zusätzlich zu einer anhaltenden Störung der Liquordynamik haben Ratten auch kognitive Verzögerungen und funktionelle Behinderungen bis ins Erwachsenenalter. Dementsprechend ermöglicht diese präklinische Plattform einzigartige und beispiellose translationale Studien von PHHP, die molekulare, zelluläre, biochemische, histologische, bildgebende und funktionelle Ergebnismessungen einbeziehen können. Es kann auch für eine rigorose parallele Analyse des Plexus choroideus, der ependymalen beweglichen Zilien und des glymphatischen Systems verwendet werden. Schließlich kann es auch ein unschätzbares präklinisches Werkzeug für die Untersuchung neuartiger chirurgischer Interventionsstrategien und nicht-chirurgischer Therapieansätze zur Behandlung des Hydrozephalus sein.

Der posthämorrhagische Hydrozephalus der Frühgeburt (PHHP) ist nach wie vor ein erhebliches Problem für die öffentliche Gesundheit. Definiert durch eine symptomatische Akkumulation von Liquor cerebrospinalis (CSF), die mit einem erhöhten intrakraniellen Druck (ICP) als Folge einer intraventrikulären Blutung (IVH) einhergeht, ist die PHHP eine schwere Manifestation der Frühgeborenenzephalopathie und trägt wesentlich zur globalen Belastung durch Frühgeburt und erworbenen Hydrozephalus^{bei 1,2}. Weltweit werden jedes Jahr etwa 400.000 Säuglinge mit Hydrozephalus geboren oder erkranken an einem lebenslangen Hydrozephalus³, und viele sterben aufgrund mangelnder Behandlung³. PHHP tritt in Industrieländern häufig bei sehr frühgeborenen Säuglingen (<32. Schwangerschaftswoche) mit schwerer IVH auf und betrifft häufig die kränksten Säuglinge, die bereits an anderen lebensbedrohlichen Komorbiditäten leiden ^4,5.

Die einzige verfügbare Behandlung für Hydrozephalus ist die Operation⁶. Chirurgische Eingriffe führen zu einer besseren Langlebigkeit, wenn Säuglinge zum Zeitpunkt des ersten dauerhaften Eingriffs älter als 6 Monate sind, sei es für einen ventrikuloperitonealen (VP) Shunt zur Umleitung von Liquor cerebrospinalis (CSF), eine endoskopische dritte Ventrikulostomie (ETV) oder eine ETV mit Koagulation des Plexus choroideus (ETV-CPC)⁷. Die häufigste Option, VP-Shunts, versagt oft innerhalb eines Jahres und prädisponiert Kinder für ein Leben voller Komplikationen, wiederholter Operationen und Krankenhausaufenthalte mit enormen Kosten für das Kind, die Familie und die Gesellschaft. ⁸ Insbesondere die Angst, dass ein Shunt jederzeit versagen könnte, ist für die Familien belastend⁹. Die Versorgung von Kindern mit symptomatischem Hydrozephalus, einschließlich häufiger Operationen, ist eine der Hauptursachen für die Ausgaben für die pädiatrische Gesundheitsversorgung 10,11,12,13,14. Die geschätzten jährlichen Kosten für Shunt-bezogene Ausgaben bei Kindern beliefen sich 2003 auf 2 Milliarden US-Dollar¹⁵. Während Kinder mit Shunts nur 0,6 % der Krankenhauseinweisungen ausmachen, verursachen sie 3,1 % der pädiatrischen Krankenhauskosten¹⁵. Daher ist die Entdeckung sicherer, nicht-chirurgischer Therapien für die Behandlung von PHHP von größter Bedeutung.

Bei Säuglingen entwickelt sich PHHP nach IVH über einen klinischen Verlauf, der Wochen bis Monate nach der ersten Identifizierung der Hirnblutung andauert. Eine vom Hydrocephalus Clinical Research Network (HCRN) durchgeführte Studie bestätigte, dass VP-Shunts nach wie vor die beste chirurgische Option für Neugeborene mit PHHP¹⁶ sind. Selbst für Kinder mit PHHP in Ländern mit hohem Einkommen und Zugang zu qualifizierter pädiatrischer neurochirurgischer Versorgung sind die Ergebnisse alles andere als optimal: >50 % der Shunts, die bei Säuglingen mit PHHP platziert werden, müssen innerhalb der ersten 2 Jahre operativ überarbeitet werden⁸. Trotz der eindeutigen Notwendigkeit, sicherere und wirksamere Behandlungen für PHHP zu finden, stieß die Forschung auf Hindernisse. Der Fortschritt wurde zum Teil dadurch behindert, dass die präklinische Literatur zu PHHP die durch einen Hydrozephalus ex vacuo verursachte Ventrikulomegalie oft nicht angemessen unterscheidet ^17,18 von einem symptomatischen Hydrozephalus mit Makrozephalie^19,20. In der Tat sollten Entwicklungsmodelle des Hydrozephalus eine progressive Makrozephalie und/oder Messungen eines erhöhten ICP¹ umfassen.

Die Zusammenführung klinischer und präklinischer Erkenntnisse hat das Studiendesign verbessert und unser Verständnis von PHHP² vorangetrieben. Studien, die in verschiedenen Zentren auf der ganzen Welt durchgeführt wurden, haben gezeigt, dass IVH am häufigsten bei sehr frühgeborenen Neugeborenen als Folge einer Chorioamnionitis^auftritt 21,22,23,24,25,26,27,28. Neben einer Plazentainfektion und -entzündung ist die neonatale Sepsis ein weiterer wichtiger Risikofaktor und kann eine zentrale Rolle bei der Progression von der IVH über die Ventrikulomegalie zur symptomatischen PHHP und den anschließenden chirurgischen Eingriff spielen²⁹. Präklinische und klinische Daten belegen, dass eine durch Blut übertragene Entzündung einen Hydrozephalus^{verursachen kann 20}, und eine systemische Entzündung erhöht die Sekretion von Liquor durch den Plexus choroideus³⁰. Darüber hinaus benötigen Erwachsene mit Subarachnoidalblutungen und IVH, die auch an einer Sepsis leiden, viel häufiger einen Shunt³¹. Neuere Literatur hat bestätigt, dass eine Entzündung den Antrieb der beweglichen Zilien der Ependymale reduziert ^19,20,32 und die Liquorresorption durch das glymphatische System 33,34,35,36. Insgesamt ist die systemische Entzündung ein wichtiger pathophysiologischer und klinischer Treiber bei PHHP¹.

Unter Berücksichtigung dieser Erkenntnisse haben wir ein altersgerechtes präklinisches Modell der PHHP erstellt. Dieses Modell kombiniert die IVH in der unmittelbaren und frühen postnatalen Phase mit der Chorioamnionitis, der Hauptursache für Frühgeburten¹⁹. Dieser experimentelle Ansatz beginnt in utero mit der Plazentainsuffizienz, der Plazentaentzündung und der intraamniotischen Entzündung, die die Chorioamnionitis definiert ^{7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,}
23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40^,41,42,
43,44,45. Konkret rekapitulieren wir ein fetales Entzündungsreaktionssyndrom, eine Plazenta-Neutrophilie und eine proinflammatorische ZNS-Mikroumgebung in der Frühphase mittels abdominaler Laparotomie bei trächtigen Rattendamen am embryonalen Tag 18 (E18)37,38,39,40,41,42,43,44,45. Die intrauterine Schädigung wird durch einen vorübergehenden bilateralen Verschluss der Arteria uterine induziert, der zu einer vorübergehenden systemischen Hypoxie-Ischämie (TSHI) führt, gefolgt von einer intraamniotischen Injektion von Lipopolysaccharid (LPS)37,38,39,40,41,42,43,44,45. Um die Liquordynamik zu stören und die Entwicklung eines Hydrozephalus bei den lebend geborenen Welpen zu katalysieren, wird die IVH am postnatalen Tag 1 induziert. Dies wird durch eine bilaterale intrazerebroventrikuläre Injektion (ICV) von Wurfgeschwister-lysierten roten Blutkörperchen (RBCs) in die lateralen Ventrikel erreicht 19,37,44. Die Jungtiere werden dann untersucht, während sich der Hydrozephalus entwickelt und während ihrer gesamten Lebensspanne.

Das Animal Care and Use Committee (ACUC) der Johns Hopkins University hat alle hier beschriebenen Versuchsverfahren genehmigt. Dieses Protokoll verwendet trächtige Sprague-Dawley-Rattenmütter und Jungtiere beiderlei Geschlechts.

1. Induktion einer Chorioamnionitis auf E18

HINWEIS: Der Teil dieses Protokolls über die Beleidigung in utero wurde zuvor ausführlich veröffentlicht, ist oben zusammengefasst und ist Gegenstand eines separaten JOVE-Protokolls und Videos 19,37,38,39,40,41,42,43,44,46. Kurz gesagt, schwangere weibliche Sprague-Dawley-Ratten werden am embryonalen Tag 18 (E18) einer abdominalen Laparotomie unterzogen, um eine Chorioamnionitis auszulösen, die die Verabreichung von TSHI und intraamniotischem LPS umfasst.

1. Anästhesie
   1. Induzieren Sie die Anästhesie bei der E18-trächtigen Rattenmutter mit 2-4% Isofluran.
   2. Nehmen Sie die trächtige Mutterdame aus der Induktionskammer und legen Sie die Ratte in Rückenlage auf eine drapierte chirurgische Zirkulationswasserdecke, die auf 37 °C eingestellt ist.
   3. Tragen Sie eine Augensalbe auf, um ein Austrocknen der Hornhaut zu verhindern. Drücken Sie vorsichtig eine Pfote, um zu bestätigen, dass es keinen Zehenklemmreflex gibt. Überwachen Sie die Anästhesietiefe alle 15-20 Minuten und erhöhen Sie den Isofluran im Falle einer positiven Zehenklemmreaktion.
   4. Verabreichen Sie Buprenorphin mit verlängerter Freisetzung (0,1 mg/kg SC) in den Nacken.
2. Chirurgische Vorbereitung und Peeling
   1. Rasieren Sie den Bauch mit der sterilen Standardtechnik.
   2. Schrubben Sie den Bauch 3x abwechselnd mit Betadin und 70% Ethanol.
   3. Drapieren Sie das Tier mit sterilen OP-Abdeckungen.
3. Abdominale Laparotomie
   1. Machen Sie mit einem Skalpell einen 3 cm langen Schnitt in der Mittellinie auf der vorbereiteten Bauchhaut.
   2. Verwenden Sie eine Pinzette und eine chirurgische Schere, um die fasziale Schicht des Bauches hochzuhalten, und machen Sie einen Schnitt in die avaskuläre Linea alba der Muskelschicht, um Zugang zur Bauchhöhle zu erhalten.
   3. Externalisieren Sie die Gebärmutter.
   4. Isolieren Sie die Gebärmutterarterien und klemmen Sie sie mit Aneurysmaclips für 60 Minuten fest. Halten Sie die Temperatur aufrecht und halten Sie den intraabdominalen Inhalt mit steriler Kochsalzlösung feucht.
   5. Entfernen Sie die Clips und injizieren Sie 100 μl LPS (4 μg/Sack LPS-Lösung) in jede Fruchtblase jedes Fötus. Stören Sie weder den Fötus noch die Plazenta.
   6. Spülen Sie die Gebärmutterhörner und das Feld großzügig 3x mit steriler Kochsalzlösung.
4. Verschluss der Laparotomie
   1. Ersetzen Sie die Gebärmutterhörner in der Bauchhöhle.
   2. Die Ränder der muskulofaszialen Schicht wieder annähern und mit einer laufenden 3-0-Naht verschließen.
   3. Nähern Sie sich der Hautschicht wieder an und schließen Sie die Haut mit einer laufenden 3-0-Naht.
   4. Verwenden Sie eine 26-g-Nadel, um 0,125 % Bupivacain subkutan um die Wundränder zu injizieren.
   5. Bei Scheinkontrollen führen Sie die Laparotomie für die Dauer der Anästhesie genauso lange durch wie die Kontrolle. Verklemmen Sie die Arterien nicht und verabreichen Sie keine intraamniotischen Injektionen. Am Ende des Eingriffs schließen Sie die Laparotomie in zwei Schichten (Bauchmuskelfaszie und Haut) mit einer 3-0-Naht. In allen Fällen werden die Jungtiere termingerecht geboren (E21/22) und von der Hündin betreut.

2. Aufbereitung von lysierten roten Blutkörperchen auf P1

1. Entnahme von Blut
   1. Entnehmen Sie ein männliches und ein weibliches Sprague-Dawley-Rattenjunges am postnatalen Tag 1 (P1) aus einem Wurf, der am E18 eine Chorioamnionitis hatte. Enthaupten Sie jeden Spenderwelpen schnell mit einer speziellen chirurgischen Schere.
      HINWEIS: Wir verwenden 1 männlichen und 1 weiblichen Welpen für die Blutentnahme, um eine mögliche geschlechtsspezifische Verzerrung auszuschließen, indem wir jeden in den Spenderkohorten repräsentieren. Zusätzlich verwenden wir ein geschlechtsspezifisches Paar, um ein ausreichendes Volumen und eine ausreichende Ausbeute an lysierten Erythrozyten zu gewährleisten, um ihre Wurfgeschwister zu injizieren. In der Regel liefert jeder Spenderwelpe genügend lysierte Erythrozyten, um eine ICV-Injektion bei maximal 4-5 Wurfgeschwistern durchzuführen.
   2. Sammeln Sie das Blut sofort in ein 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit 0,2 ml steriler Kochsalzlösung und achten Sie darauf, nach der Enthauptung nur frei fließendes Blut zu sammeln und nicht zu kratzen oder zu quetschen, um mehr Blut zu produzieren, da dies zu einer vorzeitigen Hämolyse führt. Gut vortexen.
      HINWEIS: Die genaue Blutmenge variiert je nach Spendertier und Gewicht, sollte jedoch unter Einhaltung der oben genannten Vorsichtsmaßnahmen maximal sein.
   3. Zerkleinern/zerkleinern Sie Blutgerinnsel mit einer kleinen chirurgischen Schere.
   4. Die Blutsuspension wird bei 500 × g für 10 min bei 4 ^°C zentrifugiert, der Überstand entfernt und das Pellet in 0,2 ml steriler Kochsalzlösung resuspendiert. Gut vortexen.
   5. Zerkleinern/zerkleinern Sie die verbleibenden Blutgerinnsel nach dem Wirbel mit einer kleinen chirurgischen Schere.
   6. Wiederholen Sie die Schritte 2.1.4-2.1.5 noch zweimal für insgesamt 3x und reinigen Sie die chirurgische Schere zwischen jeder Lyserunde mit 70 % Ethanolspray.
2. Lyse der roten Blutkörperchen
   1. Nach der abschließenden Zentrifugation fügen Sie dem Pellet 0,25 ml sterile Kochsalzlösung hinzu; Wirbel gut.
   2. Legen Sie die Suspension für 5 Minuten auf Trockeneis.
   3. Nehmen Sie die Suspension aus dem Trockeneis, legen Sie sie 5 Minuten lang in einen auf 37,5 ^°C eingestellten Inkubator, bis sie vollständig aufgetaut ist, und wirbeln Sie sie gut ein.
   4. Wiederholen Sie die Gefrier- und Auftauzyklen insgesamt 3x (drei Einfrieren und drei Auftauen).
   5. Am Ende des letzten Tauwetters wirbeln Sie und drehen sich schnell. Die Erythrozyten sind nun lysiert und einsatzbereit.
      HINWEIS: Die Mischung sollte eine undurchsichtige , tomatensaftähnliche Farbe haben und sich leicht in Spritzen ziehen lassen.

3. Intrazerebroventrikuläre Injektionen von lysierten roten Blutkörperchen auf P1

1. Anästhesie mittels Hypothermie
   1. Lege eine kleine Plattform zum Abkühlen auf nasses Eis.
   2. Legen Sie ein trockenes Labortuch darauf, um die Haut des Welpen zu schützen.
      HINWEIS: Diese flache kalte Oberfläche wird zum Betäuben und Injizieren der Welpen verwendet.
   3. Übertragen Sie den Welpen (im Alter von P1) vom Wärmekissen auf das Aufgabentuch auf der kalten Plattform, um eine Anästhesie durch Unterkühlung einzuleiten.
   4. Bestätigen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie eine Pfote zusammendrücken und das Fehlen des Zehenkneifreflexes bestätigen.
   5. Stellen Sie eine externe OP-Lampe auf die hellsten Einstellungen ein.
   6. Mit einem Assistenten, der mit Zeige- und Mittelfinger die Mittellinie des Tierkopfes sanft hält, durchleuchten Sie den Schädel, um die seitlichen Ventrikel durch den Schädel sichtbar zu machen. Identifizieren Sie Bregma, indem Sie den Sinus sagittalis superior (Mittellinie) durch die Haut und das Abtasten der Koronalnaht mit feiner Pinzette als sich schneidende Orientierungspunkte visualisieren.
2. ICV-Injektion
   1. Wischen Sie den Kopf des betäubten Welpen mit einem Wattestäbchen ab, das mit 70% Ethanol getränkt ist.
   2. Identifizieren und markieren Sie die Injektionsstelle als 1 mm lateral von der sagittalen Naht, auf halbem Weg zwischen Lambda und Bregma.
   3. Nach der Visualisierung verwenden Sie eine 0,3 ml, 8 mm lange 31-g-Insulinspritze mit einer ultrafeinen perkutanen Nadel, um 20 μl lysierte Erythrozyten in den rechten lateralen Ventrikel zu injizieren. Führen Sie die Nadel in der Freihandtechnik bis zu einer Tiefe von etwa der halben Nadellänge gerade nach unten ein und injizieren und entfernen Sie die Nadel langsam (Injektions- und Entnahmevorgang über ca. 10-15 s).
   4. Lassen Sie die Nadel nach der Injektion einige Sekunden lang an Ort und Stelle, um ein Austreten der injizierten lysierten Erythrozyten zu verhindern.
   5. Wiederholen Sie den Vorgang mit dem linken Seitenventrikel und injizieren Sie 20 μl lysierte Erythrozyten.
   6. Legen Sie den Welpen auf ein auf 37,5 ^°C eingestelltes Wärmekissen, um sich von der Narkose zu erholen.
   7. Notieren Sie das Geschlecht des Welpen und weisen Sie ihm eine eindeutige Tierkennung zu.
   8. Bringen Sie den Welpen erst dann wieder in den Käfig zurück, wenn er sich vollständig auf dem Wärmekissen erholt und das Bewusstsein wiedererlangt hat, damit das Tier sicher auf dem Brustbein liegen kann.
   9. Überwachen Sie alle Rattenbabys täglich auf Gesundheit und Wohlbefinden.

4. Bestätigung einer erfolgreichen bilateralen intraventrikulären Blutung auf P2

1. Ultraschall des Kopfes
   1. Um sich auf den Kopfultraschall vorzubereiten, nehmen Sie die P2-Welpen aus ihrem Heimkäfig.
   2. Legen Sie das Ultraschallgel auf die Ultraschallsonde und positionieren Sie die Sonde über dem Schädel.
   3. Bewegen Sie die Sonde mit extrem leichtem Druck, um die Ventrikel sichtbar zu machen. Bestätigen Sie die bilaterale Hyperechogenität in den lateralen Ventrikeln, die die IVH darstellen.

5. Bestätigung des erfolgreichen posthemorrhagischen Hydrozephalus

1. Messung der intraauralen Distanz (IAD), einem Surrogat für den Kopfumfang, zur Bestätigung der Makrozephalie
   1. Besorgen Sie sich zur Vorbereitung der Messung ein kleines Maßband, das für die Messung des Kopfumfangs geeignet ist, idealerweise mit übersichtlich visualisierten Millimeterbezeichnungen.
   2. Lassen Sie einen maskierten Beobachter den Welpen aus seinem Käfig nehmen.
   3. Während Sie den Welpen vorsichtig halten, messen Sie den Abstand von Ohr zu Ohr (intraaurale Distanz, IAD) und notieren Sie den Wert in Millimetern.
   4. Wiederholen Sie den IAD-Vorgang täglich von P1 bis P15, und stellen Sie die Werte grafisch dar. Verfolgen Sie die IAD seriell und messen Sie erneut bei P21, wenn die Welpen in neue Käfige umgesiedelt werden, die physisch vom Muttertier getrennt sind (was der Standardzeitpunkt für die Entwöhnung der Welpen ist). Wiederholen Sie die IAD anschließend alle 5 Tage, beginnend bei P25 bis P60.
2. Messung des Öffnungsdrucks zur Bestätigung eines erhöhten Hirndrucks
   1. Lassen Sie einen maskierten Beobachter den Welpen aus seinem Käfig nehmen.
   2. Anästhesie mit 75-100 mg/kg intraperitonealem (IP) Ketamin und 5-10 mg/kg IP Xylazin zur Vorbereitung auf die Euthanasie.
   3. Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie eine Pfote zusammendrücken und bestätigen, dass das Fehlen des Zehenklemm-/Pedalreflexes vorhanden ist.
   4. Führen Sie eine kleine Nadel (31 G), die mit einem Manometer verbunden ist, in den Liquorraum des zervikomdullären Übergangs ein.
   5. Notieren Sie den Öffnungsdruck auf dem Manometer.
   6. Entfernen Sie die Nadel und enthaupten Sie die Ratte mit einer scharfen Schere und fahren Sie mit der Gewebeentnahme fort.
3. Ex-vivo-Magnetresonanztomographie (MRT) zur Beurteilung der Ventrikulomegalie
   1. Anästhesie mit 75-100 mg/kg intraperitonealem (IP) Ketamin und 5-10 mg/kg IP Xylazin zur Vorbereitung auf die Euthanasie.
   2. Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie eine Pfote zusammendrücken und bestätigen, dass das Fehlen des Zehenklemm-/Pedalreflexes vorhanden ist.
   3. Perfundieren Sie die Ratten mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), gefolgt von 4 % Paraformaldehyd (PFA), bis sie gut fixiert sind.
   4. Entfernen Sie das Gehirn und fixieren Sie das Gehirn mit 4 % PFA
   5. Betten Sie das Gehirn in 2% Agarose in ein konisches 50-ml-Röhrchen ein. Lassen Sie es bei Zimmertemperatur stehen.
   6. Übertragen Sie das Gehirn auf den MRT-Scanner für die ex vivo MRT.
   7. Führen Sie die 11,7-T-MRT wie folgt durch: T2 Turbo RARE; TE/TR = 30,0/3000 ms; Durchschnitt = 2; Echoabstand = 10.000 ms; SELTENHEITSFAKTOR = 8; Anzahl der Scheiben = 30; Dicke der Scheibe = 1 mm; Bildgröße = 128 x 128; Sichtfeld = 28 mm x 28 mm; Schnittauflösung = 0,219 x 0,219 mm²; FA = 90,0°.
      HINWEIS: Die MRT-Bildgebung liefert zwar einen Nachweis für eine erfolgreiche PHHP-Modellierung, ist jedoch nicht erforderlich, alle Gehirne in einer bestimmten Kohorte zu scannen, um die PHHP zu verifizieren. Die IAM- und ICP-Messung ist ausreichend, um die oben beschriebene Überprüfung durchzuführen. Letztendlich hängt die Fähigkeit eines Prüfarztes, eine In-vivo - oder Ex-vivo-MRT durchzuführen, von einer Vielzahl von Faktoren ab, wie z. B. dem Zugang zum MRT-Scanner, den finanziellen Mitteln und den technischen Fähigkeiten. Dieser Schritt ist besonders nützlich für die Validierung bei der Neueinbindung des PHHP-Modells. Es ist wichtig zu beachten, dass in Ermangelung dokumentierter Anzeichen eines erhöhten intrakraniellen Drucks, wie z. B. erhöhter Öffnungsdruck, isolierte Befunde einer Ventrikulomegalie in der MRT-Bildgebung keinen Hydrozephalus darstellen.

Nach diesem Modell entwickelt sich der Hydrozephalus in den Tagen und Wochen nach der Injektion von lysierten roten Blutkörperchen. Eine Darstellung eines typischen Versuchsaufbaus und des Verlaufs des Hydrozephalus ist in Abbildung 1 dargestellt. Wir bewerteten 5-6 Scheintiere und 6-8 PHHP-Tiere pro Gruppe. Als Jugendliche zeigten Ratten mit PHHP eine Makrozephalie (Abbildung 2), einen erhöhten intrakraniellen Druck (Abbildung 3) und eine Ventrikulomegalie (Abbildung 4). Die Konstellation und Kombination dieser Befunde stellt einen Hydrozephalus dar. Diese Ratten haben auch eine Entwicklungsverzögerung¹⁹ und überleben als Erwachsene mit anhaltenden kognitiven Schwierigkeiten und erhöhtem ICP. Männer schneiden in diesem Modell schlechter ab als Frauen¹⁹, was das klinische Szenario repliziert, in dem Männer anfälliger für die Entwicklung eines Hydrozephalus sind ^3,19. Forscher, die diese experimentelle Plattform zur Untersuchung des Hydrozephalus verwenden, können den erfolgreichen Abschluss des Verfahrens bestätigen, indem sie eine fortschreitende Makrozephalie und einen gewölbten Schädel sichtbar machen, der sich im Laufe von 5 Tagen nach der Einleitung der IVH entwickelt und während der gesamten Lebensspanne aufrechterhalten wird (Abbildung 2). Anhaltende Makrozephalie ist ein wesentliches, klinisch wichtiges und leicht erkennbares Zeichen für einen erfolgreichen Eingriff. Bis zum 21. postnatalen Tag (P21) sind statistisch signifikante Erhöhungen der IADs (Surrogat des Kopfumfangs klinisch verwendet) und des Öffnungsdrucks quantifizierbar (Abbildung 3). In ähnlicher Weise sind Ventrikulomegalie und eine Zunahme des ventrikulären Volumens in MRT und Histologie im Vergleich zu Scheinkontrollen beobachtbar (Abbildung 4)^1,2,19. Die Quantifizierung des ventrikulären Volumens entweder durch strukturelle MRT-Bildgebung oder durch histologische Standardverfahren wie Kresylviolett- oder Hämatoxylin- und Eosin-Färbung ist eine hervorragende Ergänzung zu anspruchsvolleren Diffusions- und Funktionsbildgebungen. Diese Daten stimmen mit den klinischen Merkmalen der PHHP überein, einschließlich Makrozephalie, gestörter Liquordynamik, die zu ventrikulärer Expansion führt, und erhöhtem ICP.

Abbildung 1: Versuchsaufbau. Das Protokoll zur Induktion von PHHP beginnt mit der Induktion einer Chorioamnionitis bei Ratten am embryonalen Tag 18 (E18) und einer intraventrikulären Blutung am postnatalen Tag 1 (P1). Der Hydrozephalus entwickelt und entwickelt sich im Laufe des Lebens und kann bis ins Erwachsenenalter durch mehrere Metriken, einschließlich funktioneller Assays, bewertet werden. Abkürzungen: PHHP = posthemorrhagischer Hydrozephalus der Frühgeburt; IVH = intraventrikuläre Blutung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Makrozephalie, typisiert PHHP. Ratten mit PHHP haben im Vergleich zu Scheinkontrollen vergrößerte, gewölbte Schädel und Makrozephalie. Abkürzung: PHHP = posthemorrhagischer Hydrozephalus der Frühgeburt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Quantifizierung von Makrozephalie und erhöhtem Hirndruck. Ratten mit PHHP (n=8) haben am postnatalen Tag 21 (P21) im Vergleich zu Scheinkontrollen (n=5-6) einen erhöhten intraauralen Abstand (ein Surrogat für den Kopfumfang) und einen erhöhten Öffnungsdruck (intrakranieller Druck, n=6). (t-Test **p < 0,01, Fehlerbalken stellen den Standardfehler des Mittelwerts dar). Abkürzung: PHHP = posthemorrhagischer Hydrozephalus der Frühgeburt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Ratten mit PHHP haben eine mittelschwere bis schwere Ventrikulomegalie. Ratten mit PHHP haben im Vergleich zu Scheinkontrollen vergrößerte Ventrikel und ein erhöhtes Ventrikelvolumen, was in der Magnetresonanztomographie deutlich erkennbar ist. (A) Die strukturelle Bildgebung von T2 zeigt eine ventrikuläre Dilatation in der koronalen Ebene von anterior nach posterior bei P21. (B) Ventrikuläre Volumenzunahmen bei PHHP-Ratten im Vergleich zu Scheintieren sind auch in axialer, koronaler und sagittaler Ebene bei erwachsenen Ratten bei P60 sichtbar. Das ventrikuläre Volumen kann mit Hilfe von (C) MRT (n=5-7/Gruppe) quantifiziert und mit (D) 3D-Rekonstruktion des ventrikulären Systems in jedem Alter kombiniert werden. (t-Test **p < 0,01, Fehlerbalken stellen den Standardfehler des Mittelwerts dar). Abkürzung: PHHP = posthemorrhagischer Hydrozephalus der Frühgeburt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Dieses Protokoll für die Induktion von PHHP ermöglicht rigorose, quantifizierbare und klinisch übertragbare Ergebnismessungen der Gehirnstruktur und -funktion, die mit phänotypischen Kennzeichen des Hydrozephalus, einschließlich chronischer ICP-Erhöhung, Ventrikulomegalie und Makrozephalie, von der Geburt bis zum Erwachsenenalter einhergehen⁴. Biochemische, histologische und funktionelle Assays können verwendet werden, um die Gesundheit des Plexus choroideus, des Ependyms und des glymphatischen Systems sowie der grauen und weißen Substanz zu beurteilen¹⁹. Darüber hinaus kann dieses Modell die Integration von funktioneller Liquor- und Lebendzell-Zilien-Bildgebung mit multimodaler Neurobildgebung und biobehavioralen Ergebnissen unterstützen. Es kann auch verwendet werden, um mechanistische Studien unter Verwendung von Multiparameter-Durchflusszytometrie und dynamischen neuronalen Zellassays mit Histologie und Immunchemie zu kombinieren, um die ventrikuläre Mikroumgebung streng zu beurteilen. Zusammen mit digitalen Gangbewertungen und Touchscreen-Tests der Kognition und der exekutiven Funktion ^2,19 kann dieser Ansatz die Bewertung von zellulären, flüssigen und neurologischen Verhaltensbiomarkern ermöglichen, die bisher in translationalen Studien von PHHP nicht verwendet wurden.

Für Familien mit Kindern mit PHHP ist die höchste Priorität nach einer dauerhaften Shunt-Funktion die Verbesserung des kognitiven Ergebnisses und das Versprechen nicht-chirurgischer Behandlungsstrategien 47,48,49. Die Entwicklung von Pharmakotherapien, um diesen Bedürfnissen gerecht zu werden, ist der erste Schritt, um die Versorgung von Kindern mit PHHP 2,47,48,49 zu transformieren. Dieses präklinische Modell eignet sich für die Erprobung von Arzneimitteln und neuen Arzneimitteln. Es eignet sich für die Bewertung von nicht-chirurgischen Eingriffen und pharmakologischen Behandlungen zur Modulation der Liquordynamik. Diese Medikamente können bei Ratten über mehrere Verabreichungswege verabreicht werden (d. h. intraperitoneale, intravenöse, subkutane, osmotische Minipumpe) und ihr Hydrozephalus und ihre Ventrikulomegalie können während der gesamten Lebensspanne mithilfe von Bildgebung und klinischen Symptomen verfolgt, überwacht und quantifiziert werden. Es können auch mehrere Aspekte der Gehirngesundheit untersucht werden, darunter das ventrikuläre Volumen, der Verlust der weißen Substanz und die funktionelle Konnektivität. Histologie, Immunhistochemie, qPCR und damit verbundene Experimente können an Gewebeentnahmen aus bestimmten Regionen und entwicklungsbedingt unterschiedlichen Endpunkten durchgeführt werden. Diese Plattform für Studien an Ratten kann auch die Untersuchung von Hydrozephalus-assoziierten Komorbiditäten, einschließlich Zerebralparese, Epilepsie und chronischen Schmerzen, erleichtern⁴.

Die Mortalität in diesem Modell liegt bei 3-7% und tritt am häufigsten in den ersten 48 Stunden nach IVH^{auf 19,44}. Gelegentlich gelingt es Rattenbabys nicht, an Gewicht zuzunehmen und effektiv zu fressen. Dieses Gedeihversagen kann eine direkte Folge einer fortschreitenden Makrozephalie sein, die mit einem erfolgreichen Verfahren verbunden ist, oder einer kortikalen/subkortikalen Blutung, die durch eine schlechte ICV-Injektionstechnik verursacht wird. In Ermangelung der erforderlichen Präzision kann ein kortikaler hämorrhagischer Infarkt oder ein Schädelbasistrauma beobachtet werden. Die postnatale Versorgung kann entweder durch die beschriebenen pränatalen oder postnatalen Eingriffe gestört werden, da sich die Welpen in Bezug auf Kopfform, Körpergröße und Verhalten deutlich von Scheinkontrollen unterscheiden. Die richtige Operations- und Injektionstechnik, kombiniert mit fortgeschrittenen neuroanatomischen Kenntnissen, ist entscheidend, um sicherzustellen, dass die oben genannten repräsentativen Ergebnisse vollständig erzielt werden.

Diese präklinische Plattform erfordert eine offene abdominale Laparotomie, die bei trächtigen Ratten durchgeführt wird. Dies erfordert fortgeschrittene chirurgische Fähigkeiten. In der postnatalen Phase führt das Versäumnis, lysierte Erythrozyten genau in die lateralen Ventrikel zu injizieren, zu keiner IVH oder PHHP, und diese Ratten wachsen nicht heran, um eine progressive Makrozephalie, einen erhöhten Öffnungsdruck oder eine Ventrikulomegalie zu zeigen. Komfort bei Freihandinjektionen und die ventrikuläre Anatomie von neonatalen Nagetieren sind von entscheidender Bedeutung. Insbesondere offene Fontanellen und relativ dünne Schädel ermöglichen die Durchleuchtung und erleichtern die Identifizierung von neuroanatomischen Orientierungspunkten wie dem Bregma und den dorsalen Aspekten der lateralen Ventrikel, die für die erfolgreiche Platzierung der Nadel erforderlich sind. Eine einseitige IVH ist möglich, wenn nicht beide lateralen Ventrikel zugänglich sind, was zu einer vorübergehenden, aber nicht persistierenden Makrozephalie führen kann. Der Liquorausgang nach ventrikulärem Zugang ist ein geeigneter Indikator für erfolgreiche Injektionen. In ähnlicher Weise stellt die Aspiration von Liquor in die Nadelnabe vor der Injektion von lysierten Erythrozyten sicher, dass sich der Injektor im richtigen ventrikulären Raum befindet, um mit der Injektion fortzufahren. Während eine Ventrikulomegalie in der MRT in Abwesenheit eines Hydrozephalus (Enzephalomalazie) vorliegen kann, stellt die Kombination dieses Befundes zusammen mit einem erhöhten Öffnungsdruck und neurokognitiven Defiziten die erfolgreiche Durchführung der PHHP-Technik dar.

Die Analyse des prozeduralen Erfolgs kann durch den Vergleich der oben genannten repräsentativen Metriken zwischen Jungtieren, die sich einer ICV-Injektion von lysierten Erythrozyten unterzogen haben, und Scheinwelpen oder bei Jungen, die sich einer ICV-Injektion unterzogen haben, mit Kontrollwelpen ermittelt werden, die eine Chorioamnionitis, aber keine ICV-Injektion von lysierten Erythrozyten erlitten haben. Wichtig ist, dass die Schein-Muttertiere sowohl Isofluran als auch Laparotomie und Uterusexternalisierung ausgesetzt sind. Anders als beim PHHP-Modell werden dann jedoch die Fruchtblasen und die Gebärmutter in die Bauchhöhle zurückgeführt und die Laparotomie ohne Uterusarterienverschluss oder LPS-Injektion abgeschlossen. Die Jungen, die aus diesen Schein-Muttertieren hervorgehen, erhalten in der Regel keine Injektionen von lysierten Erythrozyten, da es die spezifische Kombination von TSHI+LPS in utero (die die Schein-Föten nicht erleben) gefolgt von IVH ist, die zu PHHP führt. Darüber hinaus sind wir durch alters- und geschlechtsangepasste Kontrollen, die weder TSHI+LPS noch IVH ausgesetzt sind, in der Lage, den technischen Erfolg des Modells zu validieren und die Ergebnisse von PHHP-Kohorten, die eine Intervention erhielten, direkter mit den Ergebnissen ihrer Schein-Gegenstücke zu vergleichen. Dieser Vergleich ermöglicht eine robuste Wirksamkeitsprüfung sowohl des Modells als auch aller darin enthaltenen therapeutischen Interventionen.

Trotz der erforderlichen technischen Kenntnisse ist dieses Modell im Vergleich zu anderen Modellen der frühen IVH und des Hydrozephalus vorteilhaft, da es altersgerecht ist, systemische Entzündungen berücksichtigt, sich entwickelnde PHHP-Folgen bis ins Erwachsenenalter aufweist und die Möglichkeit bietet, translationale Ergebnismaße wie ausgefeilte Funktionstests und Neuroimaging zu evaluieren 30,50,51,52. Es führt auch zu einer anhaltenden Ventrikulomegalie und einem erhöhten ICP. Die Verwendung von lysierten Erythrozyten erhöht die translationale Relevanz dieses Modells. Bei Frühgeborenen, die an IVH leiden, wird Vollblut in die Ventrikel abgegeben. Dieses Blut verbleibt im ventrikulären Liquorsystem und wird über Wochen abgebaut (Erythrozytenlyse), was zu einer anhaltenden Entzündungsreaktion in den Ventrikeln führt, die im routinemäßigen Kopfultraschall allgemein als ependymale Hyperechogenität angesehen wird^53,54. Die Verwendung von lysierten Erythrozyten bestätigt und untermauert frühere Arbeiten zur Bewertung der Wirksamkeit einzelner Blutprodukte/-komponenten bei der Entstehung eines Hydrozephalus und einer anhaltenden Ventrikulomegalie⁵⁵. Im Gegensatz zu gepackten Erythrozyten führt die intraventrikuläre Injektion von lysierten Erythrozyten im MRT 24 h nach der Injektion^{und darüber hinaus} zu signifikant vergrößerten Ventrikeln^. Es wurde festgestellt, dass die lysierte Erythrozyteninjektion die Hemoxygenase-1- und Ferritinspiegel im periventrikulären Raum im Gehirn im Vergleich zur gepackten Erythrox- oder Kochsalzlösungsinjektion hochreguliert⁵⁵. Dies ist wichtig, da die Pathophysiologie der humanen IVH weitgehend auf den Abbau des Anfangsblutes und die allmähliche Freisetzung von Eisenabbauprodukten und anderen Blutbestandteilen zurückzuführen ist, die mit der daraus resultierenden Gewebeschädigung einhergehen.

Häm-Oxygenase 1 ist ein wichtiges Enzym beim Häm-Abbau, und Ferritin ist ein Eisenspeicherprotein; daher stimmt ihre erhöhte periventrikuläre Konzentration nach lysierter Erythrozyteninjektion eng mit der menschlichen IVH-Ätiologie überein. Schließlich vernachlässigt die Injektion von Eisen nur in die Ventrikelräume andere Bestandteile der Erythrozyten wie die Carboanhydrase 29. Darüber hinaus maximiert die Eiseninjektion nicht den potenziellen Schweregrad der induzierten IVH, was direkt mit der Wahrscheinlichkeit eines nachfolgenden Hydrozephalus korreliert. Wie bei der Entscheidung, lysierte Erythrozyten zu verwenden, besteht der Grund für die Injektion beider Ventrikel darin, die Translation zu erhöhen. Die klinische Literatur zeigt einen deutlich erhöhten Zusammenhang zwischen einer schwereren IVH und einer nachfolgenden PHHP. Das beidseitige Einbringen von Blutungen an und für sich erhöht den Schweregrad der IVH sowie die Wahrscheinlichkeit einer Ausdehnung von der Keimmatrix in die Ventrikelräume und der daraus resultierenden Ventrikeldilatation - ein weiteres Merkmal einer schwereren IVH. Darüber hinaus ermöglicht die bilaterale Injektion, wie oben beschrieben, auch einen Modus zur Beurteilung der Liquorkommunikation. Zwanzig Mikroliter sind das niedrigste Volumen, um zuverlässig einen anhaltenden Hydrozephalus und ohne signifikante Parenchymbeteiligung zu erreichen, so dass die Mortalität von Rattenwelpen zu einer erschwerenden Variablen wird.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Verwendung eines Tiermodells, das klinische Aspekte der PHHP rekapituliert, einschließlich progressiver Makrozephalie, erhöhtem Hirndruck, Ventrikulomegalie und kognitiver Verzögerung bis ins Erwachsenenalter, dem Feld Strenge verleiht und einzigartige und beispiellose Studien ermöglicht, die für neue therapeutische Ansätze und ein verbessertes mechanistisches Verständnis der komplexen Pathophysiologie dieser häufigen Form der perinatalen Hirnverletzung erforderlich sind.

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Die Autoren danken für die Finanzierung durch die National Institutes of Health (R01HL139492), das Congressionally Directed Medical Research Program (W81XWH1810166, W81XWH1810167, W81XWH2210461 und W81XWH2210462), die Hydrocephalus Association und das Rudi Schulte Research Institute.