מידול הידרוצפלוס פוסט-דימומי של פגות בחולדות

ניתן לעצב הידרוצפלוס פוסט-דימומי של פגות (PHHP) בחולדות יילודים על ידי שילוב של כוריואמניוניטיס ודימום תוך חדרי. השילוב של אירועים אלה לפני הלידה ואחרי הלידה מסכם במדויק את סימני ההיכר הקליניים של PHHP, כולל מקרוצפליה, ונטריקולומגליה, ולחץ תוך גולגולתי מוגבר, לאורך החיים.

הידרוצפלוס פוסט-דימומי של פגות (PHHP) הוא המשך חמור של דימום תוך חדרי חמור (IVH) בתינוקות פגים מאוד מתחת לגיל הריון של 32 שבועות (GA). PHHP מוגדר על ידי הצטברות נוזל מוחי (CSF) הקשור לתסמינים קליניים של לחץ תוך גולגולתי מוגבר (ICP). תינוקות עם PHHP סובלים מתלות בשאנט לכל החיים, כאשר מחציתם זקוקים לניתוח חוזר בשנה הראשונה לחייהם ורבים זקוקים לניתוחים נוספים מרובים לאורך החיים. כוריואמניוניטיס טרום לידתית נוטה פגים ל-IVH חמור וצורך בטיפול כירורגי במגמות PHHP עם אלח דם בילודים. מאפיינים קליניים אלה מצביעים על כך שדלקת מערכתית היא מרכיב בלתי נפרד מהפתופיזיולוגיה של PHHP.

כאן, אנו מגדירים מודל של בעלי חיים המסכם את כל ההיבטים הקליניים והמאפיינים החיוניים של PHHP בחולדות. מטרת פרוטוקול זה היא להמחיש כיצד ניתן לשלב בכוריואמניוניטיס ברחם ו-IVH לאחר הלידה באמצעות תאי דם אדומים שעברו ליזה כדי לייצר PHHP. גישה פרה-קלינית זו מניבה מקרוצפליה מתקדמת וגולגולת כיפה, לחץ תוך גולגולתי מוגבר וונטריקולומגליה, הניתנים לזיהוי באמצעות הדמיית תהודה מגנטית (MRI) או באמצעות מיקרוסקופיה. בנוסף להפרעה מתמשכת בדינמיקה של CSF, לחולדות יש גם עיכוב קוגניטיבי ומוגבלות תפקודית בבגרות. בהתאם לכך, פלטפורמה פרה-קלינית זו מאפשרת מחקרים תרגומיים ייחודיים וחסרי תקדים של PHHP שיכולים לשלב מדדי תוצאות מולקולריים, תאיים, ביוכימיים, היסטולוגיים, הדמיה ותפקודיים. זה יכול לשמש גם לניתוח קפדני של מקלעת הכורואיד, ריסים ניידים אפנדימליים ומערכת גלימפטית במקביל. לבסוף, זה יכול להיות גם כלי פרה-קליני שלא יסולא בפז לחקירת אסטרטגיות התערבות כירורגיות חדשות וגישות טיפוליות לא כירורגיות לטיפול בהידרוצפלוס.

הידרוצפלוס לאחר דימום של פגים (PHHP) נותר דאגה משמעותית לבריאות הציבור. מוגדר על ידי הצטברות סימפטומטית של נוזל מוחי שדרתי (CSF) במקביל ללחץ תוך גולגולתי מוגבר (ICP) משני לדימום תוך חדרי (IVH), PHHP הוא ביטוי חמור של אנצפלופתיה של פגות ותורם משמעותי לנטל העולמי של פגות והידרוצפלוס נרכש ^1,2. ברחבי העולם, כ-400,000 תינוקות בכל שנה נולדים עם הידרוצפלוס³ או רוכשים את הנטל לכל החיים ורבים מתים בגלל היעדר טיפול³. PHHP שכיח במדינות מפותחות בפגים מאוד (<שבוע 32 להריון) עם IVH חמור, ולעתים קרובות משפיע על התינוקות החולים ביותר שכבר סובלים מתחלואה נלווית מסכנת חיים אחרת ^4,5.

הטיפול היחיד הזמין להידרוצפלוס הוא ניתוח⁶. פרוצדורות כירורגיות מניבות אריכות ימים טובה יותר כאשר תינוקות מעל גיל 6 חודשים בזמן ההתערבות הקבועה הראשונה, בין אם עבור שאנט וונטריקולופריטונאלי (VP) להסטת נוזל המוח השדרתי (CSF), אנדוסקופי שלישי (ETV), או ETV עם קרישת מקלעת כורואיד (ETV-CPC)⁷. האפשרות הנפוצה ביותר, VP shunts, נכשלת לעתים קרובות תוך שנה וגורמת לילדים לסיבוכים לכל החיים, ניתוחים חוזרים ואשפוזים במחיר עצום לילד, למשפחה ולחברה. ⁸ בפרט, החרדה מעיתוק שעלול להיכשל בכל עת מכבידה על משפחות⁹. טיפול בילדים עם הידרוצפלוס סימפטומטי, כולל ניתוחים תכופים, הוא הגורם המוביל להוצאות בריאות לילדים 10,11,12,13,14. העלות השנתית המשוערת להוצאות הקשורות לשאנט בילדים הייתה 2 מיליארד דולר ב-2003¹⁵. בעוד שילדים עם שאנטים מהווים רק 0.6% מהאשפוזים בבתי החולים, הם מייצרים 3.1% מהחיובים בבתי חולים לילדים¹⁵. לפיכך, גילוי טיפולים בטוחים ולא ניתוחיים לטיפול ב-PHHP הוא בעל חשיבות עליונה.

בתינוקות, PHHP מתפתח לאחר IVH במהלך זמן קליני שנמשך שבועות עד חודשים לאחר הזיהוי הראשוני של הדימום המוחי. מחקר שנערך על ידי רשת המחקר הקליני של הידרוצפלוס (HCRN) אישר כי שאנטים VP נותרו האפשרות הכירורגית הטובה ביותר עבור יילודים עם PHHP¹⁶. אפילו עבור ילדים עם PHHP במדינות בעלות הכנסה גבוהה עם גישה לטיפול נוירוכירורגי מיומן בילדים, התוצאות רחוקות מלהיות אופטימליות, כאשר >50% מהשאנטים שהוכנסו לתינוקות עם PHHP דורשים תיקון כירורגי במהלך^{השנתיים} הראשונות. למרות הצורך הברור לזהות טיפולים בטוחים ויעילים יותר ל-PHHP, המחקר נתקל במכשולים. ההתקדמות נפגעה בחלקה מכיוון שהספרות הפרה-קלינית על PHHP לרוב לא מצליחה להבחין כראוי בין ventriculomegaly הנגרמת על ידי hydrocephalus ex vacuo ^17,18 לבין הידרוצפלוס סימפטומטי עם מקרוצפליה^19,20. אכן, מודלים התפתחותיים של הידרוצפלוס צריכים לכלול מקרוצפליה מתקדמת ו/או מדידות של ICP¹ מוגבר.

מיזוג תובנות קליניות ופרה-קליניות שיפר את תכנון המחקר והניע את ההבנה שלנו לגבי PHHP². מחקרים שנערכו במרכזים שונים ברחבי העולם הראו כי IVH שכיח ביותר ביילודים פגים מאוד משניים לכוריואמניוניטיס 21,22,23,24,25,26,27,28. בנוסף לזיהום ודלקת שליה, אלח דם בילודים הוא גורם סיכון חשוב נוסף ויכול למלא תפקיד מרכזי בהתקדמות מ-IVH ל-PHHP סימפטומטי והתערבות כירורגית לאחר מכן²⁹. נתונים פרה-קליניים וקליניים תומכים בכך שדלקת המועברת בדם עלולה לגרום להידרוצפלוס²⁰, ודלקת מערכתית מגבירה את הפרשת CSF על ידי מקלעת הכורואיד³⁰. יתר על כן, מבוגרים עם דימום תת-עכבישי ו-IVH הסובלים גם מאלח דם נוטים הרבה יותר להזדקק לשאנט³¹. ספרות עדכנית יותר אישרה כי דלקת מפחיתה את הנעת הריסים הניידת של CSF 19,20,32 ואת הספיגה החוזרת של CSF על ידי המערכת הגלימפטית 33,34,35,36. בסך הכל, דלקת מערכתית היא מניע פתופיזיולוגי וקליני מרכזי ב-PHHP¹.

בהתחשב בממצאים אלה, יצרנו מודל פרה-קליני מותאם גיל של PHHP. מודל זה משלב IVH בתקופה המיידית והמוקדמת שלאחר הלידה עם כוריואמניוניטיס, הגורם העיקרי ללידה מוקדמת¹⁹. גישה ניסיונית זו מתחילה ברחם, עם אי ספיקת שליה, דלקת שליה ודלקת תוך מי שפיר המגדירה כוריואמניוניטיס 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 ^,20,21,22,
23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40^,41,42,
43,44,45. באופן ספציפי, אנו מסכמים תסמונת תגובה דלקתית עוברית, נויטרופיליה של שליה ומיקרו-סביבה פרו-דלקתית של מערכת העצבים המרכזית בתקופה המוקדמת באמצעות לפרוטומיה בטנית בסכרי חולדות בהריון ביום העוברי 18 (E18)37,38,39,40,41,42,43,44,45. פגיעה תוך רחמית נגרמת על ידי חסימה זמנית של עורק הרחם הדו-צדדי המובילה להיפוקסיה-איסכמיה מערכתית חולפת (TSHI) ואחריה הזרקה תוך מי שפיר של ליפופוליסכריד (LPS)37,38,39,40,41,42,43,44,45. לאחר מכן, כדי לשבש את הדינמיקה של CSF ולזרז את התפתחות ההידרוצפלוס בגורים שנולדו חיים, IVH מושרה ביום 1 לאחר הלידה. זה מושג על ידי הזרקה תוך-חדרית דו-צדדית (ICV) של תאי דם אדומים (RBCs) לתוך החדרים הצדדיים 19,37,44. לאחר מכן גורים נחקרים עם התפתחות הידרוצפלוס ולאורך כל חייהם.

הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים (ACUC) באוניברסיטת ג'ונס הופקינס אישרה את כל ההליכים הניסיוניים המתוארים כאן. פרוטוקול זה משתמש בסכרי עכברושים בהריון של Sprague-Dawley וגורים משני המינים.

1. אינדוקציה של כוריואמניוניטיס ב- E18

הערה: החלק של עלבון ברחם של פרוטוקול זה פורסם בעבר בפירוט, סוכם לעיל, והוא נושא של פרוטוקול JOVE נפרד ווידאו 19,37,38,39,40,41,42,43,44,46. בקצרה, נקבות חולדות ספראג-דולי בהריון עוברות לפרוטומיה בטנית ביום העוברי 18 (E18) כדי לגרום לכוריואמניוניטיס, הכוללת TSHI ומתן LPS תוך מי שפיר.

1. הרדמה
   1. לגרום להרדמה בסכר חולדות בהריון E18 עם 2-4% איזופלורן.
   2. הסר את הסכר ההריוני מתא האינדוקציה והנח את החולדה במצב שכיבה על שמיכת מים כירורגית עטופה במחזור המכוונת ל-37 מעלות צלזיוס.
   3. מרחו משחה עיניים למניעת ייבוש הקרנית. לחץ בעדינות על כפה כדי לאשר את היעדר רפלקס צביטה בבוהן. עקוב אחר עומק ההרדמה כל 15-20 דקות והגדל את האיזופלורן במקרה של תגובה חיובית לצביטה בבוהן.
   4. יש לתת בופרנורפין בשחרור מושהה (0.1 מ"ג/ק"ג SC) בעורף.
2. הכנה כירורגית וקרצוף
   1. בטכניקה סטרילית סטנדרטית יש לגלח את הבטן.
   2. שפשפו את הבטן פי 3 עם בטדין ואתנול 70% לסירוגין.
   3. עטפו את החיה באמצעות וילונות כירורגיים סטריליים.
3. לפרוטומיה בטנית
   1. בצע חתך בקו האמצע של 3 ס"מ על עור הבטן המוכן בעזרת אזמל.
   2. השתמש במלקחיים ובמספריים כירורגיים כדי להחזיק את השכבה הפשיאלית של הבטן ולבצע חתך של הלינאה אלבה האווסקולרית של שכבת השריר כדי לגשת לחלל הצפק.
   3. להחצין את הרחם.
   4. בודד והדק את עורקי הרחם בעזרת קליפס מפרצת למשך 60 דקות. שמרו על הטמפרטורה ושמרו על התוכן התוך בטני לח במי מלח סטריליים.
   5. הסר את הקליפים והזריק 100 מיקרוליטר LPS (4 מיקרוגרם/שק של תמיסת LPS) לכל שק מי שפיר של כל עובר. אין להפריע לעובר או לשליה.
   6. להשקות את קרני הרחם ולשפוך בנדיבות פי 3 עם מי מלח סטריליים.
4. סגירת הלפרוטומיה
   1. החלף את קרני הרחם בחלל הצפק.
   2. החזר את קצוות השכבה השרירית וסגור באמצעות תפר רץ 3-0.
   3. החזר את שכבת העור וסגור את העור באמצעות תפר רץ 3-0.
   4. השתמש במחט 26 גרם כדי להזריק תת עורית 0.125% בופיבקאין סביב קצוות הפצע.
   5. עבור בקרות דמה, בצע את הלפרוטומיה למשך אותו פרק זמן כדי לשלוט במשך ההרדמה. אין להדק את העורקים ואל תיתן זריקות תוך מי שפיר. בסיום ההליך יש לסגור את הלפרוטומיה בשתי שכבות (שריר הבטן והעור) באמצעות תפר 3-0. בכל המקרים, הגורים נולדים במועד (E21/22) ומטופלים על ידי הסכר.

2. הכנת כדוריות דם אדומות על P1

1. איסוף דם
   1. קחו גור עכברוש Sprague-Dawley זכר אחד ונקבה אחת ביום 1 לאחר הלידה (P1) מהמלטה שחוותה כוריואמניוניטיס ב-E18. ערפו במהירות את ראשו של כל גור תורם בעזרת מספריים כירורגיות ייעודיות.
      הערה: אנו משתמשים בגור זכר אחד ונקבה אחת לאיסוף דם כדי למנוע הטיה מינית פוטנציאלית על ידי ייצוג כל אחד מקבוצות התורמים. בנוסף, אנו משתמשים בזוג תואם מין כדי להבטיח נפח ותפוקה מספיקים של תאי דם אדומים שעברו ליזה כדי להזריק לחבריהם לשגר. בדרך כלל, כל גור תורם מניב מספיק RBCs ליז כדי לבצע הזרקת ICV על מקסימום 4-5 חברים.
   2. אסוף את הדם מיד לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה של 2 מ"ל המכיל 0.2 מ"ל של מי מלח סטריליים, הקפד לאסוף רק דם זורם חופשי לאחר עריפת הראש ולא לגרד או לסחוט כדי לייצר יותר דם מכיוון שהדבר מוביל להמוליזה מוקדמת. מערבולת היטב.
      הערה: כמות הדם המדויקת משתנה בהתאם לבעל החיים התורם ולמשקל, אך צריכה להיות מקסימלית תוך שמירה על אמצעי הזהירות לעיל.
   3. קוצצים / טוחנים קרישי דם עם מספריים כירורגיים קטנים.
   4. צנטריפוגה של תרחיף הדם ב-500 × גרם למשך 10 דקות ב-4 ^{מעלות צלזיוס}, הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את הכדור ב-0.2 מ"ל של מי מלח סטריליים. מערבולת היטב.
   5. קוצצים / טוחנים קרישי דם שיוריים לאחר מערבולת עם מספריים כירורגיים קטנים.
   6. חזור על שלבים 2.1.4-2.1.5 פעמיים נוספות בסך הכל פי 3, נקה מספריים כירורגיים עם תרסיס אתנול של 70% בין כל סבב ליזינג.
2. ליזה של כדוריות דם אדומות
   1. לאחר הצנטריפוגה הסופית, הוסף 0.25 מ"ל מי מלח סטריליים לגלולה; מערבולת היטב.
   2. הניחו את המתלה על קרח יבש למשך 5 דקות.
   3. הסר את התרחיף מקרח יבש, הנח אותו בחממה המכוונת ל -37.5 ^{מעלות צלזיוס}למשך 5 דקות עד להפשרה מלאה, ומערבל היטב.
   4. חזור על מחזורי ההקפאה וההפשרה בסך הכל פי 3 (שלוש הקפאות ושלוש הפשרה).
   5. בסיום ההפשרה האחרונה, מערבולת ובצע סיבוב מהיר. ה-RBCs כעת מוכנים לשימוש.
      הערה: התערובת צריכה להיות בצבע אטום דמוי מיץ עגבניות ולהימשך בקלות למזרקים.

3. זריקות תוך מוחיות של תאי דם אדומים שעברו ליזה על P1

1. הרדמה באמצעות היפותרמיה
   1. מניחים פלטפורמה קטנה על קרח רטוב להתקררות.
   2. הניחו מגבון מעבדה יבש מעל כדי להגן על עור הגור.
      הערה: משטח קר ושטוח זה משמש להרדמה והזרקה של הגורים.
   3. העבירו על גור (בגיל P1) מכרית החימום אל ניגוב המשימה על גבי פלטפורמה קרה כדי לגרום להרדמה על ידי היפותרמיה.
   4. אשר את עומק ההרדמה על ידי סחיטת כפה ואישור היעדר רפלקס צביטת הבוהן.
   5. הגדר מנורת ניתוח חיצונית להגדרות הבהירות ביותר שלה.
   6. עם עוזר המשתמש באצבע המורה והאמצעית שלו כדי לשמור בעדינות על קו האמצע של ראש החיה, העביר את הגולגולת כדי לדמיין את החדרים הצדדיים דרך הגולגולת. זהה ברגמה על ידי הדמיית הסינוס הסגיטלי העליון (קו האמצע) דרך העור ומישוש התפר העטרתי עם מלקחיים עדינים כציוני דרך מצטלבים.
2. הזרקת ICV
   1. נגב את ראשו של הגור המורדם עם צמר גפן ספוג באתנול 70%.
   2. זהה וסמן את אתר ההזרקה כרוחב של 1 מ"מ מהתפר הסגיטלי, באמצע הדרך בין למבדה לברגמה.
   3. לאחר ההדמיה, השתמש במזרק אינסולין של 0.3 מ"ל, באורך 8 מ"מ, 31 גרם עם מחט מלעורית דקה במיוחד כדי להזריק 20 מיקרוליטר של תאי דם אדומים שעברו ליזה לחדר הצדדי הימני. הכנס את המחט ישר כלפי מטה בטכניקת יד חופשית לעומק של כמחצית מאורך המחט והזריק והסר את המחט לאט (תהליך הזרקה והסרה במשך כ-10-15 שניות).
   4. השאר את המחט במקומה למשך מספר שניות לאחר ההזרקה כדי למנוע יציאה של ה-RBCs המוזרקים.
   5. חזור על הפעולה עם החדר הצדדי השמאלי והזריק 20 מיקרוליטר של תאי דם אדומים שעברו ליזה.
   6. הניחו את הגור על כרית חימום בטמפרטורה של 37.5 ^{מעלות צלזיוס}כדי להתאושש מההרדמה.
   7. רשום את מין הגור והקצה מזהה בעל חיים ייחודי.
   8. החזירו את הגור לכלוב הביתי רק לאחר התאוששות מלאה על כרית החימום והחזרת ההכרה כך שהחיה תוכל לשמור בבטחה על שכיבה על עצם החזה.
   9. עקוב אחר כל גורי החולדות מדי יום לבריאות ורווחה.

4. אישור דימום תוך-חדרי דו-צדדי מוצלח ב-P2

1. אולטרסאונד ראש
   1. כדי להתכונן לאולטרסאונד ראש, הוציאו את גורי ה-P2 מהכלוב הביתי שלהם.
   2. הנח ג'ל אולטרסאונד על בדיקת האולטרסאונד ומקם את הגשושית מעל החלק העליון של הגולגולת.
   3. בלחץ קל במיוחד, הזז את הגשושית כדי לדמיין את החדרים. אשר היפר-אקוגניות דו-צדדית בחדרים הצדדיים המייצגים IVH.

5. אישור של הידרוצפלוס פוסתמורגי מוצלח

1. מדידת מרחק תוך-אוזני (IAD), תחליף להיקף הראש, לאישור מקרוצפליה
   1. כדי להתכונן למדידה, רכשו סרט מדידה קטן המתאים למדידת היקף הראש, באופן אידיאלי עם ייעודי מילימטר חזותיים בבירור.
   2. בקשו ממשקיף רעול פנים להוציא את הגור מהכלוב הביתי שלו.
   3. תוך כדי החזקת הגור בעדינות, מדוד את המרחק מאוזן לאוזן (מרחק תוך אוזני, IAD) ורשום את הערך במילימטרים.
   4. חזור על IAD מדי יום מ-P1 ל-P15 ושרטט גרף של הערכים. עקבו אחר IAD באופן סדרתי ומדדו שוב ב-P21 עם העברת הגורים לכלובים חדשים המופרדים פיזית מהסכר (שהיא נקודת הזמן הסטנדרטית לגמילת גורים). חזור על IAD לאחר מכן כל 5 ימים החל מ-P25 עד P60.
2. מדידת לחץ פתיחה לאישור לחץ תוך גולגולתי מוגבר
   1. בקשו ממשקיף רעול פנים להוציא את הגור מהכלוב הביתי שלו.
   2. יש להרדים עם 75-100 מ"ג/ק"ג קטמין תוך-צפקי (IP) ו-5-10 מ"ג/ק"ג IP קסילזין כהכנה להמתת חסד.
   3. בדוק את עומק ההרדמה על ידי לחיצה על כפה ואישור היעדר רפלקס צביטת הבוהן/דוושה.
   4. הכנס מחט קטנה (31 G) המחוברת למנומטר לחלל CSF של צומת צוואר הרחם.
   5. רשום את לחץ הפתיחה על המונומטר.
   6. הסר את המחט וערף את ראשה של החולדה במספריים חדים והמשך באיסוף רקמות.
3. הדמיית תהודה מגנטית Ex-vivo (MRI) להערכת ונטריקולומגליה
   1. יש להרדים עם 75-100 מ"ג/ק"ג קטמין תוך-צפקי (IP) ו-5-10 מ"ג/ק"ג IP קסילזין כהכנה להמתת חסד.
   2. בדוק את עומק ההרדמה על ידי לחיצה על כפה ואישור היעדר רפלקס צביטת הבוהן/דוושה.
   3. יש להחדיר את החולדות עם מי מלח עם פוספט (PBS), ואחריו 4% פרפורמלדהיד (PFA) עד לקיבוע היטב.
   4. הסר את המוח ותקן את המוח ב-4% PFA
   5. הטמיעו את המוח ב-2% אגרוז בצינור חרוטי של 50 מ"ל. תן לזה לעמוד בטמפרטורת החדר.
   6. העבירו את המוח לסורק ה-MRI ל-MRI ex vivo .
   7. הפעל MRI 11.7T באופן הבא: T2 Turbo RARE; TE/TR = 30.0/3000 אלפיות השנייה; ממוצע = 2; מרווח הד = 10.000 אלפיות השנייה; גורם נדיר = 8; מספר הפרוסות = 30; עובי פרוסה = 1 מ"מ; גודל תמונה = 128 x 128; FOV = 28 מ"מ x 28 מ"מ; רזולוציית פרוסה = 0.219 x 0.219 מ"מ²; FA = 90.0°.
      הערה: בעוד שהדמיית MRI מספקת עדות למודלים מוצלחים של PHHP, אין צורך לסרוק את כל המוחות בקבוצה נתונה כדי לאמת את ה-PHHP. מדידת IAM ו-ICP מספיקה כדי לאמת כמתואר לעיל. בסופו של דבר, יכולתו של חוקר לבצע MRI in vivo או ex vivo תהיה תלויה במגוון גורמים כגון גישה לסורק MRI, כספים ויכולת טכנית. שלב זה שימושי במיוחד לאימות בעת שילוב חדש של מודל PHHP. חשוב לציין כי בהיעדר סימנים מתועדים של לחץ תוך גולגולתי מוגבר, כגון לחץ פתיחה מוגבר, ממצאים מבודדים של ונטריקולומגליה בהדמיית MRI אינם מייצגים הידרוצפלוס.

באמצעות מודל זה, הידרוצפלוס מתפתח בימים ובשבועות לאחר הזרקת כדוריות דם אדומות שעברו ליזה. ייצוג של תכנון ניסוי טיפוסי והתקדמות של הידרוצפלוס מסופק באיור 1. הערכנו 5-6 חיות דמה ו-6-8 חיות PHHP לקבוצה. כצעירים, חולדות עם PHHP הפגינו מקרוצפליה (איור 2), לחץ תוך גולגולתי מוגבר (איור 3) וונטריקולומגה (איור 4). קבוצת הכוכבים והשילוב של ממצאים אלה מייצגים הידרוצפלוס. לחולדות אלה יש גם עיכוב התפתחותי¹⁹, וכבוגרות, שורדות עם קשיים קוגניטיביים מתמשכים ו-ICP מוגבר. זכרים מתפקדים גרוע יותר מנקבות במודל^{זה 19}, המשחזר את התרחיש הקליני שבו זכרים נוטים יותר לפתח הידרוצפלוס ^3,19. חוקרים המשתמשים בפלטפורמה ניסויית זו לחקר הידרוצפלוס יוכלו לאשר את השלמתו המוצלחת של ההליך על ידי הדמיה של מקרוצפליה מתקדמת וגולגולת כיפתית המתפתחת במהלך 5 ימים לאחר השראת IVH ונשמרת לאורך כל החיים (איור 2). מקרוצפליה מתמשכת היא סימן חיוני, חשוב מבחינה קלינית, הניתן לזיהוי בקלות להליך מוצלח. ביום ה-21 שלאחר הלידה (P21), ניתן לכמת עלייה מובהקת סטטיסטית ב-IADs (חלופה של היקף הראש בשימוש קליני) ובלחץ הפתיחה (איור 3). באופן דומה, ניתן להבחין ב-ventriculomegaly, ועלייה בנפח החדר, ב-MRI ובהיסטולוגיה בהשוואה לבקרות דמה (איור 4)^1,2,19. כימות נפח החדר על ידי הדמיית MRI מבנית או באמצעות הליכים היסטולוגיים סטנדרטיים כמו צביעת קרסיל סגול או המטוקסילין ואאוזין הוא השלמה מצוינת לדיפוזיה מתוחכמת יותר והדמיה פונקציונלית. נתונים אלה עולים בקנה אחד עם המאפיינים הקליניים של PHHP, כולל מקרוצפליה, דינמיקת CSF משובשת המובילה להתרחבות חדרית ו-ICP מוגבר.

איור 1: תכנון ניסוי. הפרוטוקול להשראת PHHP מתחיל בזירוז כוריואמניוניטיס בחולדות ביום העוברי 18 (E18) ודימום תוך חדרי ביום 1 לאחר הלידה (P1). הידרוצפלוס מתפתח ומתפתח לאורך כל החיים וניתן להעריך אותו על ידי מדדים מרובים, כולל מבחנים פונקציונליים, עד לבגרות. קיצורים: PHHP = הידרוצפלוס פוסטמורגי של פגות; IVH = דימום תוך חדרי. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: מקרוצפליה המאפיינת את PHHP. לחולדות עם PHHP יש גולגולות מוגדלות, כיפות ומקרוצפליה בהשוואה לבקרות דמה. קיצור: PHHP = הידרוצפלוס פוסטמורגי של פגות. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: כימות של מקרוצפליה ולחץ תוך גולגולתי מוגבר. לחולדות עם PHHP (n=8) יש מרחק תוך-אוזני מוגבר (תחליף להיקף הראש) ולחץ פתיחה מוגבר (לחץ תוך גולגולתי, n=6) ביום 21 לאחר הלידה (P21) בהשוואה לביקורת דמה (n=5-6). (מבחן t **p < 0.01, קווי שגיאה מייצגים שגיאת תקן של הממוצע). קיצור: PHHP = הידרוצפלוס פוסטמורגי של פגות. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: לחולדות עם PHHP יש וונטריקולומגה בינונית-חמורה. לחולדות עם PHHP יש חדרים מוגדלים ונפח חדרים מוגדל בהשוואה לבקרות דמה הניתנות לזיהוי בבירור בהדמיית תהודה מגנטית. (A) הדמיה מבנית T2 מראה התרחבות חדרית במישור העטרה מקדימה לאחורית ב-P21. (B) עליות בנפח החדרים בחולדות PHHP בהשוואה לחיות דמה נראות גם במישורים ציריים, קורונליים וסגיטלים בחולדות בוגרות ב-P60. ניתן לכמת נפחי חדרים באמצעות (C) MRI (n=5-7/קבוצה) ולשלב עם (D) שחזור תלת מימד של מערכת החדרים בכל גיל. (מבחן t **p < 0.01, קווי שגיאה מייצגים שגיאת תקן של הממוצע). קיצור: PHHP = הידרוצפלוס פוסטמורגי של פגות. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

פרוטוקול זה לאינדוקציה של PHHP מאפשר מדידות תוצאות קפדניות, ניתנות לכימות וניתנות לתרגום קליני של מבנה ותפקוד המוח במקביל לסימני היכר פנוטיפיים של הידרוצפלוס, כולל עלייה כרונית של ICP, ventriculomegaly ומקרוצפליה, מלידה ועד בגרות⁴. ניתן להשתמש במבחנים ביוכימיים, היסטולוגיים ופונקציונליים כדי להעריך את הבריאות של מקלעת הכורואיד, האפנדימה והמערכת הגלימפטית, כמו גם חומר אפור ולבן¹⁹. בנוסף, מודל זה יכול לתמוך בשילוב של CSF תפקודי והדמיית ריסים של תאים חיים עם הדמיה נוירולוגית רב-מודאלית ותוצאות ביו-התנהגותיות. זה יכול לשמש גם לשילוב מחקרים מכניסטיים באמצעות ציטומטריית זרימה רב-פרמטרית ובדיקות תאים עצביים דינמיות עם היסטולוגיה ואימונוכימיה כדי להעריך בקפדנות את המיקרו-סביבה החדרית. יחד עם הערכות הליכה דיגיטליות ובדיקות מסך מגע של קוגניציה ותפקוד ניהולי ^2,19, גישה זו עשויה לאפשר הערכה של סמנים ביולוגיים תאיים, נוזלים ונוירו-התנהגותיים שלא שימשו בעבר במחקרים תרגומיים של PHHP.

עבור משפחות לילדים עם PHHP, העדיפות הגבוהה ביותר לאחר תפקוד שאנט עמיד היא שיפור התוצאה הקוגניטיבית וההבטחה לאסטרטגיות טיפול לא ניתוחיות 47,48,49. פיתוח תרופות כדי לענות על צרכים אלה הוא הצעד הראשון לשינוי הטיפול בילדים עם PHHP 2,47,48,49. מודל פרה-קליני זה מתאים לבדיקת משטרי תרופות ותרופות מתפתחות. זה מתאים להערכה של התערבויות לא כירורגיות וטיפולים תרופתיים שנועדו לווסת את דינמיקת CSF. תרופות אלו יכולות להינתן במספר דרכי מתן בחולדות (כלומר, מיני-משאבה תוך-צפקית, תוך-ורידית, תת עורית, אוסמוטית) וניתן לעקוב, לנטר ולכמת את ההידרוצפלוס והוונטריקולומגליה שלהן לאורך כל החיים באמצעות הדמיה וסימנים קליניים. ניתן גם לבחון היבטים מרובים של בריאות המוח, כולל נפח החדר, אובדן החומר הלבן וקישוריות תפקודית. ניתן לבצע היסטולוגיה, אימונוהיסטוכימיה, qPCR וניסויים נלווים על איסוף רקמות מאזורים ספציפיים ונקודות קצה שונות מבחינה התפתחותית. פלטפורמה זו למחקר בחולדות יכולה גם להקל על חקר מצבים נלווים הקשורים להידרוצפלוס, כולל שיתוק מוחין, אפילפסיה וכאב כרוני⁴.

התמותה במודל זה היא 3-7% ומתרחשת לרוב ב-48 השעות הראשונות לאחר IVH^19,44. לעיתים, גורי חולדות לא מצליחים לעלות במשקל ולהאכיל ביעילות. כישלון זה לשגשג יכול להיות תוצאה ישירה של מקרוצפליה מתקדמת הקשורה להליך מוצלח, או דימום קליפת המוח/תת-קורטיקלי הנגרם על ידי טכניקת הזרקת ICV לקויה. בהיעדר הדיוק הדרוש, ניתן להבחין באוטם דימומי, קליפת המוח או טראומה בבסיס הגולגולת. הטיפול לאחר הלידה יכול להיות מופרע על ידי ההתערבויות לפני הלידה או לאחר הלידה המתוארות מכיוון שהגורים שונים באופן ניכר מבקרות מזויפות ביחס לצורת הראש, גודל הגוף וההתנהגות. טכניקת ניתוח והזרקה נכונה, בשילוב עם מיומנות נוירו-אנטומית מתקדמת, היא חיונית כדי להבטיח שהתוצאות המייצגות לעיל יתממשו במלואן.

פלטפורמה פרה-קלינית זו דורשת ביצוע לפרוטומיה בטנית פתוחה בחולדות בהריון. זה דורש מיומנות כירורגית מתקדמת. בתקופה שלאחר הלידה, כישלון בהזרקה מדויקת של תאי דם אדומים לחדרים הצדדיים לא יגרום ל-IVH או ל-PHHP וחולדות אלה לא יגדלו כדי להפגין מקרוצפליה מתקדמת, לחץ פתיחה מוגבר או ונטריקולומגליה. נוחות עם זריקות ביד חופשית והאנטומיה החדרית של מכרסמים יילודים היא חיונית. יש לציין כי פונטנלים פתוחים וגולגולות דקות יחסית מאפשרים הארה ומקלים על זיהוי ציוני דרך נוירו-אנטומיים כגון ברגמה וההיבטים הגביים של החדרים הצדדיים הנחוצים למיקום מוצלח של המחט. IVH חד צדדי אפשרי אם לא ניגשים לשני החדרים הצדדיים, וזה עלול להניב מקרוצפליה חולפת אך לא מתמשכת. יציאת CSF לאחר גישה לחדר היא אינדיקטור מתאים להזרקות מוצלחות. באופן דומה, שאיבת CSF לרכזת המחט לפני הזרקת תאי דם אדומים ליזים מבטיחה שהמזרק נמצא בחלל החדר המתאים כדי להמשיך בהזרקה. בעוד ש-ventriculomegaly ב-MRI יכול להיות נוכח בהיעדר הידרוצפלוס (אנצפלומלאציה), השילוב של ממצא זה, יחד עם לחץ פתיחה מוגבר וליקויים נוירו-קוגניטיביים, מייצג את הביצוע המוצלח של טכניקת PHHP.

ניתן לברר ניתוח של הצלחה פרוצדורלית על ידי השוואת המדדים המייצגים לעיל בין גורים שעברו הזרקת ICV של RBCs ליזים וגורי דמה או בגורים שעברו הזרקת ICV לעומת גורי ביקורת שחוו כוריואמניוניטיס אך לא הזרקת ICV של RBCs שעברו ליזה. חשוב לציין, סכרי הדמה עוברים חשיפה לאיזופלורן, כמו גם לפרוטומיה והחצנת הרחם. עם זאת, בניגוד למודל PHHP, שקי מי השפיר והרחם מוחזרים לאחר מכן לחלל הבטן והלפרוטומיה הושלמה ללא חסימת עורק הרחם או הזרקת LPS. הגורים שנולדו מסכרים מזויפים אלה בדרך כלל אינם מקבלים זריקות של RBCs שעברו ליזה מכיוון שהשילוב הספציפי של TSHI+LPS ברחם (שעוברי הדמה אינם חווים) ואחריו IVH שמוביל ל-PHHP. בנוסף, על ידי ביקורת תואמת גיל ומין שאינה חשופה ל-TSHI+LPS או IVH, אנו מסוגלים לאמת את ההצלחה הטכנית של המודל ולהשוות באופן ישיר יותר את התוצאות של קבוצות PHHP שקיבלו התערבות עם התוצאות של עמיתיהם המזוייפים. השוואה זו מאפשרת בדיקת יעילות חזקה הן של המודל והן של כל התערבויות טיפוליות בו.

למרות המיומנות הטכנית הנדרשת, מודל זה הוא יתרון בהשוואה למודלים אחרים של IVH והידרוצפלוס מוקדמים מכיוון שהוא מתאים לגיל, משלב דלקת מערכתית, יש לו השלכות PHHP מתפתחות במהלך הבגרות, ומספק את ההזדמנות להעריך מדדי תוצאות תרגומי כגון בדיקות תפקודיות מתוחכמות והדמיה מוחית ^30,50,51,52. זה גם מניב ventriculomegaly מתמשך ו-ICP מוגבר. השימוש ב-RBCs ליזים מגביר את הרלוונטיות התרגומית של מודל זה. לפגים הסובלים מ-IVH יש דם מלא שמשתחרר לחדריהם. דם זה נשאר במערכת ה-CSF של החדר ומתכלה במשך שבועות (RBC lysis) מה שמוביל לתגובה דלקתית מתמשכת בחדרים, הנתפסת בדרך כלל באולטרסאונד ראש שגרתי כהיפר-אקוגניות אפנדימלית^53,54. השימוש ב-RBCs שעברו ליזה מאשש ומבסס עבודה קודמת להערכת היעילות של תוצרי/רכיבי דם בודדים ביצירת הידרוצפלוס ו-ventriculomegaly מתמשך⁵⁵. בניגוד ל-RBCs ארוזים, הזרקה תוך חדרית של RBCs שעברו ליזה מביאה להגדלה משמעותית של חדרים ב-MRI 24 שעות לאחר ההזרקה ומעבר^ל-19,55. הזרקת RBC Lysed נמצאה מווסתת את רמות ההמוקסיגנז -1 והפריטין במוח בחלל הפרי-חדרי בהשוואה ל-RBC ארוז או הזרקת מי מלח⁵⁵. זה חשוב מכיוון שהפתופיזיולוגיה של IVH אנושי נובעת בעיקר מפירוק הדם הראשוני ושחרור הדרגתי של תוצרי פירוק ברזל ורכיבי דם אחרים במקביל לנזק לרקמות כתוצאה מכך.

Heme-oxygenase 1 הוא אנזים עיקרי בפירוק הם, ופריטין הוא חלבון אחסון ברזל; לפיכך, הריכוז הפרי-חדרי המוגבר שלהם לאחר הזרקת RBC ליז תואם באופן הדוק את האטיולוגיה של IVH האנושי. לבסוף, הזרקת ברזל רק לחללי החדרים מזניחה רכיבים אחרים של תאי דם אדומים כגון קרבוניק אנהידראז 29. בנוסף, הזרקת ברזל אינה ממקסמת את החומרה הפוטנציאלית של ה-IVH המושרה, אשר מתאם ישירות עם הסבירות להידרוצפלוס שלאחר מכן. בדומה לבחירה להשתמש ב-RBCs עם ליזה, הרציונל מאחורי הזרקת שני החדרים הוא להגביר את התרגום. הספרות הקלינית מראה קשר מוגבר ברור בין IVH חמור יותר ל-PHPP שלאחר מכן. החדרת שטפי דם דו-צדדיים כשלעצמה מגדילה את חומרת ה- IVH כמו גם את הסבירות להתפשטות מהמטריצה הנבטית לתוך חללי החדרים וכתוצאה מכך התרחבות החדרים - מאפיין נוסף של IVH חמור יותר. בנוסף, כפי שתואר לעיל, הזרקה דו-צדדית מאפשרת גם מצב להערכת תקשורת CSF. עשרים מיקרוליטר הוא הנפח הנמוך ביותר להשגת הידרוצפלוס מתמשך באופן אמין וללא מעורבות פרנכימלית משמעותית כך שתמותת גורי חולדות הופכת למשתנה מסובך.

לסיכום, השימוש במודל בעלי חיים המסכם היבטים קליניים של PHHP, כולל מקרוצפליה מתקדמת, לחץ תוך גולגולתי מוגבר, ונטריקולומגלייה ועיכוב קוגניטיבי לבגרות מוסיף קפדנות לתחום ומאפשר מחקרים ייחודיים וחסרי תקדים הנחוצים לגישות טיפוליות חדשות והבנה מכניסטית משופרת של הפתופיזיולוגיה המורכבת של צורה נפוצה זו של פגיעה מוחית סביב הלידה.

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

המחברים אסירי תודה על המימון הניתן על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (R01HL139492), תוכנית המחקר הרפואי המכוונת על ידי הקונגרס (W81XWH1810166, W81XWH1810167, W81XWH2210461 ו-W81XWH2210462), אגודת ההידרוצפלוס ומכון המחקר רודי שולטה.