Melanom hücrelerinde jelatinaz aktivitesini tespit etmek için jelatin zymografi

Metalloproteazlar (MMP'ler), malign melanom da dahil olmak üzere birçok hücre tarafından salgılanır. Hücre dışı matriks bileşenlerinin MMP aracılı bölünmesi, bu hücrelerin invaziv potansiyelinin artmasına yol açar. Burada sunulan jelatin zimografi, bir poliakrilamid jel üzerinde sindirilmiş bir jelatin alanı olarak ortaya çıkan jelatinaz aktivitesini incelemek için bir nicelik belirleme yöntemidir.

Oldukça invaziv özelliklere sahip olan melanom hücreleri, tümör hücreleri tarafından oluşturulan ve çevredeki hücre dışı matrisin (ECM) sindiriminden sorumlu olan invadopodia oluşumunu sergiler. ECM proteinlerini hidrolize etmek için hücreler tarafından çeşitli metaloproteazlar (MMP'ler) salgılanır. Esas olarak invadopodia olarak bilinen yapılar yoluyla salgılanırlar. ECM bozunması, tümör hücreleri için çok önemlidir ve kan damarlarına doğru giden hücrelerin yoğun dokuyu gevşetmesi gerektiğinden metastaz oluşturur.

Melanom hücreleri tarafından salgılanan bir grup metaloproteaz, jelatinazları, yani metaloproteazlar 2 ve 9'u içerir. Jelatinler, ECM'nin tüm yapısal bileşenleri olan jelatini (denatüre kollajen), birkaç tip kollajeni (tip IV dahil) ve fibronektini parçalar. Bu makale, melanom hücrelerinin jelatinaz aktivitesini analiz etmek için bir jelatin zimografi testini açıklamaktadır. Bu yaklaşım, bir poliakrilamid jele eklenen bir substratın (jelatin) sindirim derecesinin analiz edilmesine dayanmaktadır. Basitlik, duyarlılık, düşük maliyet ve dansitometri ile yarı kantitatif analizin yanı sıra MMP'lerin hem aktif hem de aktif olmayan formlarının tespiti gibi çeşitli avantajlar, bu testi değerli ve yaygın olarak kullanılmasını sağlar.

Bu protokol, bozulmamış yüzen hücrelerden, hücre kalıntılarından ve apoptotik cisimlerden yoksun ortamın nasıl konsantre edileceğini açıklar. Daha sonra, jelatin ilaveli poliakrilamid jelin hazırlanmasına, sodyum dodesilsülfat-poliakrilamid jel elektroforezinin (SDS-PAGE) gerçekleştirilmesine, SDS'nin çıkarılmasına ve melanom hücreleri tarafından salgılanan jelatinazların aktivitesine karşılık gelen jelatin içermeyen bantları tespit etmek için jelin boyanmasına odaklanır. Son olarak, makale, bu testten elde edilen verilerin nicel olarak nasıl analiz edileceğini açıklamaktadır. Bu yöntem, melanom hücrelerinin jelatinaz aktivitesini bir floresan jelatin bozunma testi, western blot veya enzime bağlı immünosorbent testlerine (ELISA'lar) tahmin etmek için iyi bir alternatiftir.

Matriks metalloproteinazlar (MMP'ler), büyüme faktörleri, hücre reseptörleri, proteinazlar ve bunların inhibitörleri 1,2,3,4 gibi çeşitli ECM proteinlerini ve ECM olmayan proteinleri parçalayan Zn 2+ içeren bir endopeptidaz ailesidir. MMP'lerin ECM-substrat özgüllüğü, peptit alanlarına ve motiflerine ve ayrıca dizilerindeki benzerliklere bağlıdır, böylece alt gruplarını tanımlar. Örneğin, çeşitli kollajen türlerini sindiren kollajenazların yanı sıra jelatin ve agrekan vardır; jelatinleri ve kollajenleri parçalayan jelatinazlar; ve çeşitli ECM proteinlerini sindiren matrilizinler veya MT-MMP'ler⁵.

Bu makale iki jelatina odaklanmaktadır: MMP-2 ve MMP-9, denatüre kollajeni (jelatin) proteolitik olarak sindirebildikleri için bir jelatin zimografi testi ^3,6 kullanılarak aktivitelerinin tespit edilmesine izin verir. MMP-2 ve MMP-9 güçlü bir yapısal benzerlik taşısalar da, aynı substrat özgüllüğüne sahip değildirler⁷. MMP'lerin C-terminali hemopeksin benzeri bir alanı, substrat dizisi^8'in tanınmasından sorumludur. Katalitik alanlarındaki küçük farklılıklar, MMP-2 ve MMP-9'un substrat seçiciliğindeki farklılıklardan sorumludur, örneğin, MMP-2, MMP-9'dan farklı olarak, doğal tip I kollajen^9'u parçalayabilir. Bununla birlikte, proteolitik aktiviteleri, her ikisi de jelatin^3,6'yı parçalayabildiğinden, jelatin zimografi ile tartışmasız bir şekilde belirlenebilir.

MMP'lerin hem fizyolojik hem de patolojik durumlarda rol oynadığı zaten bilinmektedir. Hücre göçünü, istilasını, yayılmasını ve adezini etkilediği, dolayısıyla anjiyogenez, iltihaplanma, tümör ilerlemesi ve metastazı bozduğu bulundu 10,11,12,13. Çeşitli önemli süreçlerde yer aldıkları için, yüksek terapötik veya tanısal potansiyelleri nedeniyle kapsamlı bir şekilde incelenmektedirler 14,15,16. MMP-2 (jelatinaz A), prodomaini katalitik bölgede Zn^{2 +} 'ya bağlanan ve enzimatik aktivite^9'un inhibisyonuna yol açan 72 kDa'lık bir proenzim olarak ortaya çıkar. MMP-2, MMP-14 (MT1-MMP), trombin ve aktive edilmiş protein C ^17,18,19,20 tarafından zimojeninin prodomaininin bölünmesi yoluyla aktive edilebilir. Bu nedenle, aktif MMP-2'nin kütlesi daha düşüktür (~ 64 kDa). Buna karşılık, MMP-9 (jelatinaz B) ~92 kDa proenzim olarak ifade edilir ve 83 kDa proteini elde etmek için N-terminal alanının bölünmesi ile aktive edilir. MMP-9 olgunlaşması, serin proteazlar, diğer MMP'ler tarafından bir prodomain bölünmesinden ve oksidatif strese bir yanıt olarak^{ortaya çıkar 21}.

Melanomun ilerlemesi ve malignitesi, hücrelerin ilerlemesini ve metastaz oluşumunu sınırlayan bir "bariyer" olduğu için, tümör hücrelerinin ECM'yi sindirme yeteneğine büyük ölçüde bağlıdır²². Hücrelerin dermise girmesi, kan damarlarına doğru göç etmesi, vasküler endotelyuma yapışması ve kana ulaşması için önce bazal zara (BM) nüfuz etmesi gerekir. Jelatinaz ekspresyonunun farklı kanserlerde arttığı ve artmış invazyon ve migrasyon ile ilişkili olduğu ve hastalar için daha kötü bir prognoz olduğu gösterilmiştir^23,24. MMP-2, melanom hücrelerinde yüksek oranda eksprese edildi ve aktivasyon durumu progresyon^25,26 ile korele ilişkilendirildi. MMP-9'un ayrıca insan derisi tümörlerinde ve melanom hücre hatlarında biriktiği bulunmuştur^27,28.

MMP'lerin özellikleri ile melanom hücrelerinin invazivliği arasındaki yüksek korelasyon nedeniyle, varlıklarını ve aktivitelerini belirlemek için basit, hassas, düşük maliyetli, fonksiyonel bir testin mevcudiyeti, melanomun biyolojisini daha iyi anlamak ve tespiti için yeni tanı teknikleri tasarlamak için çok önemlidir. Bu makale, bu amaç için en iyi aday olarak kabul edilebileceği için jelatin zimografi tekniğini ayrıntılı olarak açıklamaktadır. Bu yaklaşım, jelatin^29,30 ilavesiyle hazırlanan poliakrilamid jeller kullanılarak, denatüre edici ancak indirgeyici olmayan koşullar altında SDS-elektroforezine dayanmaktadır. MMP-2 ve MMP-9 dahil olmak üzere proteinler, elektroforez sırasında SDS varlığında denatüre olmasına rağmen, Triton X-100 içeren tamponda yıkama, bir SDS: Triton X-100 değişiminin³¹ sonucu olarak yeniden doğuşlarına neden olur.

Bu yeniden yapılandırılmış MMP'ler, bir inkübasyon tamponunda jel inkübasyonu sırasında jelatini sindirir ve bu, sonunda Coomassie Blue lekeli jel^5'te berrak zimolitik bantlar olarak gözlemlenebilir. MMP'lerin jelatinolitik aktivitesine karşılık gelen şeffaf bantlar olarak sunulan sindirilmiş jelatinin miktarı ve alanı, hem yaygın olarak kullanılan hem de açık kaynaklı uygulamalar (ImageLab ve ImageJ^29,32) kullanılarak belirlenebilir. Bu yöntemin birçok avantajı olmasına rağmen, tartışmada belirtilen bazı sınırlamaları da vardır. Farklı melanom hücre hatları üzerinde gerçekleştirilen notlar ve yorumlar içeren bu "adım adım" protokol, temsili sonuçlar elde etmek için tekrarlanabilirlik ve optimizasyon için yeterli olmalıdır. Şekil 1, açıklanan prosedürün adımlarını göstermektedir.

1. Hücre kültürü ortamının toplanması ve konsantrasyonu

1. Melanom hücrelerini (burada A375, SK-MEL-28, Hs 294T, WM9, WM1341D hücre hatları) tam ortamda doku kültürü 75^cm2 şişelerine tohumlayın [Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle'ın orta-yüksek glikozu, azaltılmış konsantrasyonda (1.5 g / L) NaHCO₃, %10 (h/h) Fetal Sığır Serumu (FBS), %1 (h/h) L-Glutamin ve %1 (h/h) Antibiyotik-Antimikotik ile desteklenmiştir].
2. Hücreleri standart koşullar altında (% 5 CO₂, 37 ° C) kültürleyin.
3. Hücreler% 80-90 birleşmeye ulaştıktan sonra, süpernatanı aspire edin ve atın ve kültür şişesindeki kalıntı ortamı çıkarmak için şişeleri serumsuz ortam veya 37 ° C'ye ısıtılmış PBS ile 3 kez yıkayın.
   NOT: Serumsuz ortam eklenmeden önce süpernatan (tam ortam) tamamen çıkarılmalıdır. FBS, yanlış pozitif sonuçlara ve yanlış veri analizine ve yorumlanmasına yol açabilecek çeşitli MMP'ler içerir²⁹.
4. 10 mL ılık serumsuz ortam ekleyin ve hücreleri 37 ° C'de% 5 CO₂ içeren nemlendirilmiş bir atmosferde 48-72 saat boyunca inkübe edin.
   NOT: Serumsuz ortamda hücre inkübasyon süresi, hücre canlılığını ve salgılanan protein miktarını etkileyebilir. Bu nedenle, hücre hattının tipine bağlı olarak zimografi yapılmadan önce hücre açlığının süresi optimize edilmelidir. İşin püf noktası, hücrelerin en uygun olduğu zamanı seçmek ve en yüksek miktarda MMP salgılamaktır. Burada kullanılan tüm melanom hücre hatları, canlılığı etkilemeden 48 saat boyunca serum içermeyen bir ortamda kültürlendi. Hücrelerin durumu bir faz kontrast mikroskobu kullanılarak doğrulandı, ancak bir XTT veya MTT hücre canlılığı testi yapılabilir.
5. 48-72 saat sonra hücre kültürlerinden ortamı toplayın ve bunları 15 mL'lik tüplere aktarın. Protein bozulmasını önlemek için ortamı sürekli olarak buz üzerinde tutun.
6. Ortamı 4 ° C'de 7.000 × g'da 20 dakika santrifüjleyin³³.
   NOT: Santrifüjleme, aktif MMP'lerin kaynağı olabileceğinden, yüzen sağlam hücreleri, hücre kalıntılarını ve apoptotik cisimleri çıkarmak için çok önemlidir. Bu adımın atlanması, yanlış pozitif sonuçlara ve yanlış veri analizine ve yorumlanmasına yol açabilir. İsteğe bağlı olarak, apoptotik cisimleri, büyük mikro-parçacıkları ve hücre kalıntılarını³⁴ çıkarmak için ortam 0,22 μm filtrelerden filtrelenebilir. Hücrelerin donması ve çözülmesi hasarlarına yol açabileceğinden, böylece hücre içi bileşenlerin açığa çıkmasına neden olabileceğinden, depolama için -20 °C'ye aktarmadan önce ortamı santrifüjlemek önemlidir³⁵.
7. Daha fazla analizden önce gerekirse ortamı -20 °C'de saklayın (DURDURMA NOKTASI 1).
8. Ortamı buz üzerinde çözdürün ve üreticinin tavsiyesine göre 10 kDa'lık bir kesme ile ultra santrifüj filtre üniteleri kullanarak istenen nihai konsantre hacmini elde etmek için konsantre edin ( Malzeme Tablosuna bakın).
   NOT: Burada elde edilen konsantrasyon faktörü yaklaşık 20 kat idi. Tespit edilen MMP'lerin molekül ağırlığı 43-215 kDa olduğundan, 10 kDa Nominal Moleküler Ağırlık Limitine (NMWL) sahip ultrasantrifüj filtre ünitelerinin kullanılması tavsiye edilir. Daha yüksek NMWL (30 kDa) kullanmak, daha düşük moleküler ağırlığa sahip MMP moleküllerinin kaybına neden olabilir (örneğin, 43 kDa kollajenaz MMP-1).
9. Konsantre ortamı hemen -80 °C'ye aktarın ve -80 °C'DE SAKLAYIN (DURMA NOKTASI 2).
   NOT: Protein bozulmasını önlemek için protokolün sonraki adımlarında taze veya çözülmüş numuneler buz üzerinde tutulmalıdır.
10. Üreticinin tavsiyesine göre (STOP POINT 3) Bradford veya BCA yöntemi gibi toplanan ve konsantre edilen ortamdaki protein konsantrasyonunu ölçün.

2. Jelatin zimografi için SDS-PAGE ayırma ve jellerin jelatin (1 mg / mL) ile istiflenmesinin hazırlanması

1. Bir kaset oluşturmak için kısa bir plaka ile ara plakayı bir döküm çerçevesine yerleştirin ve çerçeveyi döküm standının üzerine yerleştirin.
   NOT: 0.75-1.5 mm entegre ara parçalı ara plaka kullanılabilir (burada 1 mm). Çalışma yüzeyinin sabit ve mükemmel bir şekilde düzlendiğinden emin olun.
2. Uygun miktarda jelatini tartarak ve çözeltiyi 65 ° C'ye ısıtarak ultra saf veya steril deiyonize H₂O içinde çözerek 2.65 mg / mL jelatin hazırlayın. Çözeltiyi 0.22 μm'lik bir şırınga filtresi kullanarak sterilize edin. Ayırma jelini hazırlamadan önce jelatin çözeltisini oda sıcaklığına kadar soğutun.
   NOT: Jelatin çözeltisi 4 °C'de 1 hafta saklanabilir. Uzun süreli depolama, bakteriyel kontaminasyona ve bunlar tarafından salgılanan proteolitik enzimlerin varlığına neden olabilir³⁶.
3. 3.95 mL 2.65 mg / mL jelatin, 3.3 mL %30 akrilamid / bis-akrilamid, 2.5 mL 1.5 M Tris-HCl (pH 8.8), 48 μL %10 SDS, 80 μL %50 gliserol, 70 μL H₂O, 48 μL %10 APS ve 4.8 μL TEMED.
   NOTE: DİKKAT! Akrilamid/bis-akrilamid ile çalışırken eldiven ve gözlük takın. Jel hazırlamanın sonunda APS (bir aktivatör) ve TEMED (jel polimerizasyon katalizörü) eklenmelidir, bundan sonra hızlı ve verimli çalışmak önemlidir. DİKKAT! TEMED çeker ocak altına eklenmelidir. Ayırma jelinin bu hacmi, referans alınan elektroforez aparatına uygun 1 mm'lik bir ara parçaya sahip iki ayırma jeli hazırlamak için yeterlidir (bkz. Malzeme Tablosu). Jelin daha düşük bir yüzdesi gerekiyorsa, jelde istenen akrilamid yüzdesini elde etmek için bileşenlerin hacimlerini yeniden hesaplayın.
4. % 10'luk ayırıcı jel çözeltisini, hava kabarcığı oluşumunu önleyerek altı ila sekiz kez ters çevirerek karıştırın ve çözeltiyi kısa plakanın yüksekliğinin %2.1'ine kadar jel kaset sandviçine (adım 75) dökün.
   NOT: Jelin kalınlığı, yüklenen protein miktarı ve inkübasyon tamponundaki inkübasyon süresi (bileşim için bkz. adım 5.1.3), jelin tamamen sindirilmiş jelatin bantları ile ayrı MMP'ler için ayrılmış alanlarını elde etmek için optimize edilmelidir. Sonuçta, bu, belirli bir hücre tipi tarafından salgılanan MMP miktarına bağlıdır.
5. Jelin üst kısmını% 70 etanol ile kaplayın.
   NOT: Kabarcıkların giderilmesi ve jelin kurumasını ve polimerizasyon için uygun olmayan hava ile temas etmesini önlemek önemlidir.
6. Jeli oda sıcaklığında yaklaşık 30 dakika bekletin. Polimerizasyon tamamlandığında ve jel karışımı ile etanol katmanları arasında net bir ayırma çizgisi göründüğünde, etanol katmanını dikkatlice çıkarın.
7. 3.05 mL H₂O, 0.67 mL %30 akrilamid / bis-akrilamid, 1.25 mL 0.5 M Tris-HCl (pH 6.8), 50 μL %10 SDS, 50 μL %10 APS ve 5 μL TEMED'i karıştırarak %4 istifleme jeli (5 mL) hazırlayın. % 4'lük istifleme jeli çözeltisini altı ila sekiz kez ters çevirerek karıştırın.
   NOT: Bu hacim, 1 mm ara parçalı iki istifleme jeli hazırlamak için yeterlidir.
8. Jel sandviç kasetinin üstüne hemen bir tarak yerleştirin ve istifleme jeli solüsyonu ile doldurun.
9. İstifleme jelini tamamen polimerize olmasını sağlamak için oda sıcaklığında yaklaşık 30 dakika inkübe edin.
10. Jelleri nemli kağıt havlularla sarın, plastik bir torbaya koyun ve jelleri en az 1 hafta boyunca en az gece boyunca 4°C'de tutun.
11. Jel sandviç kasetini bir elektrot tertibatına yükleyin, tanka aktarın ve SDS-PAGE elektroforezini çalıştırmadan önce 1x SDS-PAGE tamponu [250 mM Tris-HCl, 1.92 M glisin, %1 (w/h) SDS] ile doldurun.
    NOT: SDS-PAGE tamponu 4 °C'de uzun süre saklanabilir.
12. Tarağı jelden çıkarın.

3. Toplam protein içeriği tayini için SDS-PAGE ayırma ve istifleme jellerinin hazırlanması

NOT: Bölüm 3'teki adımlar, jelatin zimografi için jel hazırlamayı açıklayan bölüm 2'deki adımlara benzer. Jellerin bileşiminin farklı olduğuna dikkat edin. Toplam protein içeriği tayini için bir jel, Coomassie Brilliant Blue çözeltisi ile de lekeleneceği için jelatin içermemelidir.

1. 3.34 mL %30 akrilamid / bis-akrilamid, 2.5 mL 1.5 M Tris-HCl (pH 8.8), 100 μL %10 SDS, 3.99 mL H₂O, 50 μL %10 APS ve 20 μL TEMED'i karıştırarak 10 mL %10'luk ayırma jeli hazırlayın.
2. Çözeltiyi hava kabarcığı oluşumundan kaçınarak ters çevirerek karıştırın ve çözeltiyi kısa plakanın yüksekliğinin %75'ine kadar jel kasetli sandviçe aktarın.
3. Jelin üst kısmını etanol ile kaplayın ve jeli oda sıcaklığında yaklaşık 30 dakika bekletin. Etanolü çıkarın.
4. 650 μL %30 akrilamid/bis-akrilamid, 1.25 mL 1.5 M Tris-HCl (pH 8.8), 50 μL %10 SDS, 2.99 mL H₂O, 25 μL %10 APS ve 12.5 μL TEMED'i karıştırarak 5 mL %4'lük istifleme jeli hazırlayın.
5. Jel sandviç kasetinin üstüne bir tarak yerleştirin ve istifleme jeli solüsyonu ile doldurun.
6. Jeli oda sıcaklığında yaklaşık 30 dakika bekletin.
   NOT: JEL, SDS-PAGE elektroforezinden hemen önce hazırlanabilir veya 4 °C'de birkaç gün saklanabilir. Jel saklama için jeli ıslak bir kağıt havluya sarın ve nemli kalması için plastik bir torbaya koyun.
7. Jellerle birlikte kasetleri tanka koyun, jel sandviç kasetini bir elektrot tertibatına yükleyin ve tertibatı 1x SDS-PAGE tamponu [250 mM Tris-HCl, 1.92 M glisin,% 1 (w/v) SDS] ile bir tanka aktarın.
8. Tarağı jelden çıkarın.

4. Numune yükleme ve elektroforez çalışması

1. 3-20 μg (burada 10 μg) konsantre ortamın 1: 1 oranını 2x indirgeyici olmayan yükleme tamponu [10 mM Tris pH 6.8, %1 (a/h) SDS, %10 (h/h) gliserol, %0.03 (a/h) bromofenol mavisi] ortamdaki tahmini protein konsantrasyonuna göre karıştırarak her bir SDS-PAGE örneğini zymografi için hazırlayın.
   NOT: Yükleme tamponu 4°C'de saklanmalıdır. β-merkaptoetanol ve ditiyotreitol (DTT) kullanılması, sistein kalıntıları arasındaki disülfid bağlarını yok etme yetenekleri nedeniyle önerilmez, bu da MMP'nin elektroforezden sonra yeniden eskimemesine neden olur.
2. Numuneleri 4x indirgeyici tampon [% 40 (h / h) gliserol,% 40 (h / h) gliserol,% 8 (a / h) SDS,% 0.04 (a / h) bromofenol mavisi,% 5 (h / h) β-merkaptoetanol] ile 1: 3 oranında karıştırarak jeli hazırlayın.
   NOTE: DİKKAT! Eldiven ve gözlük takın ve çeker ocak altında çalışın. Yükleme tamponu -20 °C'de saklanmalıdır. Her şeride aynı miktarda protein yüklenmelidir. Numuneler isteğe bağlı olarak gerekirse -80 °C'de birkaç gün saklanabilir (DURDURMA NOKTASI 4).
3. Elektroforezi çalıştırmadan önce numuneleri jelatin zimografi için 37 ° C'de 20 dakika inkübe edin.
   NOT: Numuneleri 37 °C'den daha yüksek bir sıcaklıkta ısıtmayın. Proteinlerin termal denatürasyonu, proteaz aktivitesinin inaktivasyonuna yol açabilir veya enzimlerin yeniden katlanmasını önleyerek yanlış negatif sonuçlara ve yanlış veri yorumlamasına neden olabilir³¹.
4. Toplam protein içeriği tayini için numuneleri 95 °C'de 10 dakika inkübe edin.
5. Numuneleri küçük bir masa santrifüjünde birkaç saniye döndürün ve bunları jellerin kuyucuklarına yükleyin.
6. İsteğe bağlı olarak, bir moleküler ağırlık merdiveni ve negatif (95 ° C'de 10 dakika kaynatılmış numuneler) ve pozitif kontrol numuneleri (örneğin, rekombinant MMP-2 ve MMP-9 veya MMP-2 ve MMP-9³⁶ salgıladığı bilinen bir hücre hattı) kuyucuklara yükleyin.
7. İyi bir MMP-9 ve MMP-2 bant ayrımı sağlamak için boya jelden dışarı akana kadar elektroforez çalıştırın. Aşağıdaki SDS-PAGE elektroforez koşullarını kullanın: başlangıçta, jel başına 20 mA, numuneler ayırma jeline girdiğinde gücü jel başına 40 mA'ya çıkarır.
   NOT: Dört jel için maksimum elektrik akımı 130 mA'yı geçmemelidir. Aksi takdirde, elektroforez sırasında jel aşırı ısınır. Elektroforez, buz içeren bir kutuda veya varsa soğuk bir odada (4 °C) gerçekleştirilebilir.

5. Poliakrilamid jelin aktivasyonu, boyanması ve lekelerinin giderilmesi

1. Jel yıkama ve aktivasyon
   1. Zymografi jelini kısa ve ara plakalar arasından çıkarın ve yıkama tamponlu plastik bir kaba aktarın [50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 10 mM CaCl₂, %2.5 (h/h) Triton X-100]. Jelatin zimografi gününde yıkama tamponu hazırlayın.
      NOT: Triton X-100 çok viskoz olduğundan, tampon her hazırlandığında aynı hacimde Triton X-100 eklemek için viskoz sıvıları pipetleme kurallarına göre pipetleyin³⁷.
   2. Jeli yıkama tamponunda iki kez inkübe edin, her seferinde 30 dakika boyunca SDS'yi jelden çıkarmak için hafif çalkalama ile ve Triton X-100 ile değiştirin.
   3. Jeli inkübasyon tamponu (50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 10 mM CaCl₂) içeren plastik bir tanka aktarın.
      NOT: Uzun süreli depolama için inkübasyon tamponunu 4 °C'de tutun. Herhangi bir mikrobiyal kontaminasyon veya yağış belirtisi varsa taze tampon hazırlayın.
   4. Jeli inkübasyon tamponunda 37 ° C'de 12-20 saat (burada 16 saat) inkübe edin.
      NOT: Jelin kalınlığı ve yüklenen protein miktarı, jeldeki iyi sindirilmiş jelatin alanlarını elde etmek için optimize edilmesi gereken inkübasyon tamponundaki inkübasyon süresini etkiler.
2. Jel boyama ve leke çıkarma
   1. %0,5 (a/h) Coomassie Brilliant Blue R-250, %30 (h/h) etanol ve %10 (h/h) asetik asit içeren sulu bir çözelti içeren boyama solüsyonunu hazırlayın.
      NOTE: DİKKAT! Çeker ocak altında çalışın ve asetik asit kullanırken eldiven giyin. Tartılan Coomassie Blue miktarını suda eritin, etanol ekleyin ve çözeltiyi karıştırın. Sonunda, ekzotermik bir reaksiyonu önlemek için etanol-su çözeltisine yavaşça asetik asit ekleyin.
   2. % 30 (h / h) etanol ve% 10 (h / h) asetik çözelti içeren leke giderme çözeltisini H₂O içinde hazırlayın.
      NOT: Etanolü H₂O ile karıştırın. Ekzotermik bir reaksiyonu önlemek için sonunda etanol-su çözeltisine yavaşça asetik asit ekleyin.
   3. Jeli Coomassie Brilliant Blue solüsyonu ile plastik bir kaba aktarın ve jeli oda sıcaklığında 30 dakika boyunca hafif çalkalama ile boyayın.
      NOT: FastGene Q-Stain, jeli boyamak için de kullanılabilir. Bu boyanın avantajı, kullanıma hazır olması ve lekeli jelin herhangi bir leke giderme adımı gerektirmemesidir.
   4. Jeli, lekeyi çıkarmak için hafif çalkalama ile oda sıcaklığında leke giderme tamponunda inkübe edin. Jelatinaz aktivitesini temsil eden şeffaf bantlar görünene kadar leke çıkarmaya devam edin.
      NOT: Coomassie Brilliant Blue solüsyonu ile boyama çok yoğunsa, inkübasyon sırasında leke giderme tamponunu birkaç kez değiştirin.
   5. Jeli nemli tutun ve görüntülenene kadar kurumasına izin vermeyin.
      NOT: Görselleştirmeye kadar leke giderme işlemini yavaşlatmak için leke giderme tamponunu suyla değiştirin.

6. Poliakrilamid jellerdeki proteinlerin görselleştirilmesi

NOT: Poliakrilamid jellerdeki proteinleri görselleştirmek için kullanılan görüntüleme sistemi ve yazılımla ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın (Şekil 2A-C). Hazır bulunan diğer jel görselleştirme sistemleri (iBright Görüntüleme Sistemleri, UVP PhotoDoc-It Görüntüleme Sistemi, E-Gel Görüntüleyici ve Azure Görüntüleyiciler gibi) de bu amaç için kullanılabilir.

1. Görüntüleme ekipmanını açın ve yazılımı açın.
2. Dosya | Yeni bir proje açmak için yeni proje.
3. Seç'e tıklayarak uygulama türünü seçin ... | Protein jelleri | Coomassie mavisi.
4. Jelleri teker teker görüntüleme sistemine aktarın ve Position Gel düğmesini kullanarak jel konumunu kontrol edin.
5. Protokolü çalıştır'a tıklayarak jeli görselleştirin.
6. Başvurulan yazılımı kullanarak daha fazla analize izin vermek için görüntüyü .scn olarak kaydedin.
7. Ayrıca.tif, Dosya | İhracat | ImageJ (STOP POINT 5) kullanarak analiz için yararlı olacak Analiz için Dışa Aktar.

7. Veri analizi

1. Görüntüleme yazılımı kullanılarak jel analizi
   1. Görüntüleme yazılımını ve toplam protein içeriğini temsil eden zymogramın ve jelin görüntülerini açın.
   2. Beyaz bir arka plan üzerinde siyah şeritler elde etmek için görüntüyü ters çevirin. Görüntü dönüştürme ayarına gidin altında, Görüntüyü ters çevir ekranına tıklayın.
   3. Analiz Araç Kutusunu kullanarak MMP-2 ve MMP-9'u manuel veya otomatik olarak temsil eden zymogram üzerindeki çizgileri ve bantları seçin | Şerit ve Bantlar bölümü. Her satırda bir bant oluşturun ve toplam protein içeriğini temsil eden jel üzerinde toplam protein içeriği belirleme için tüm çizgi alanını içerecek şekilde boyutunu ayarlayın.
   4. Şerit ve Bant bölümünde bulunan araçları kullanarak çizgileri ve bantları ayarlayın (Şekil 2A'-C').
   5. Analiz Tablosuna gidin ve her şeridin ve bandın Hacmini (yoğunluğunu) ve moleküler ağırlığını kopyalayın (Şekil 2A"-C").
   6. Şeritler arasındaki toplam protein içeriğini karşılaştırmak için her bir şeridin Hacmini seçilen kontrol şeridinin Hacmine bölün (burada A375) (Şekil 2A").
   7. MMP aktivitesinin Hacmini toplam protein içeriğine normalleştirmek için her bir bandın Hacmini karşılık gelen şeridin değerine bölün (adım 7.6'dan itibaren) (Şekil 2B",C").
   8. Çizgiler arasındaki jelatinazların aktivitesini karşılaştırmak için, incelenen hattın/çalışılan koşulun normalleştirilmiş Hacmini, kontrol çizgisinin/standart durumun normalleştirilmiş Hacmine bölün (burada A375) (Şekil 2B",C").
2. ImageJ yazılımı ile alternatif jel analizi
   1. ImageJ yazılımını açın ve ters çevrilmiş jel görüntüsünü açın (beyaz arka plan üzerinde siyah bantlar).
   2. Dikdörtgen aracını kullanarak ilk şeridi jelatinle sindirilmiş bantlarla çizin.
   3. Analiz Et'i seçin | Jeller | İlk şeridi seçmek ve işaretlemek için ImageJ araç çubuğunda İlk Şerit'i seçin.
   4. Seviyelendirilmiş ilk seçimi (sarı dikdörtgen) bir sonraki şeride aktarın ve Analiz | Jeller | Sonraki şeridi seçmek ve işaretlemek için Sonraki Şerit'i seçin.
   5. Jel üzerinde sunulan tüm şeritleri aynı şekilde seçin (Şekil 3A-C).
   6. Seç Analiz Et'e gidin | Jeller | Şerit profili çizimlerini yapmak için Şeritleri çizin (Şekil 3A'-C').
   7. Düz aracını kullanarak, her tepenin kenarlarında dikey çizgiler olan bantları ayırın ve ardından alanlarını "kapatmak" için yatay çizgiler çizin (Şekil 3A'-C'; sarı çizgiler).
   8. İzleme aracını kullanarak her bir zirvenin boyutunu ölçün. Seçmek için her bir tepe noktasının alanına tıklayın ve tepe noktalarının sarı renkle çerçevelenmesini bekleyin.
   9. Sonuçlar tablosunda seçilen her tepe noktasının boyutunu arayın (Şekil 3A"-C").
   10. Verileri adım 7.1'de açıklandığı gibi toplam protein içeriğine göre Normaize edin.
   11. Çalışılan çizginin/koşulun "alanını" kontrol çizgisinin/standart koşulun "alanına" bölün (Şekil 3A"-C").
3. Veri sunumu
   1. Görüntüleme yazılımı ile elde edilen sonuçları, MMP aktivitesi toplam protein içeriğine ve kontrol hattına normalize edilmiş olarak gösterin (Şekil 4A,B).
   2. ImageJ ile elde edilen sonuçları, toplam protein içeriğine ve kontrol hattına normalize edilmiş MMP aktivitesi olarak sunun (Şekil 4C, D).

Bu protokolde, numune olarak beş melanom hücre hattından (A375, SK-MEL-28, Hs-294T, WM9, WM1341D) elde edilen besiyeri kullanılarak jelatin zimografi (Şekil 1) prosedürü tarif ediyoruz. Burada gösterilen zimografi yaklaşımı iki ayrı SDS-PAGE elektroforu içerir. Bir SDS-PAGE elektroforezi, her satırda yüklenen toplam protein içeriğini temsil eden Coomassie Blue lekeli jel ile sonuçlanır (Şekil 2A). Jelatinaz a...

Burada detaylandırılan "adım adım" protokolüne rağmen, jelatin zimografisi, analiz edilen numunelere/hücre hatlarına bağlı olarak optimizasyon gerektirir. Farklı hücre tipleri ve hücre hatları (burada gösterilen melanom hücre hatları), MMP-2 ve MMP-9'un her iki formunu da (pro- ve aktif) salgılayabilir, ancak farklı jelatinaz aktivitesine sahiptir. Prosedürün optimizasyonu esas olarak hücre açlığının süresini, poliakrilamid jelin kalınlığını, yüklenen pr...

Yazarlar rekabet eden hiçbir mali çıkar beyan etmemektedir.

Bu çalışma Polonya Ulusal Bilim Merkezi tarafından desteklenmiştir (proje #2016/22/E/NZ3/00654, AJM'ye hibe edilmiştir).