Zimografia della gelatina per rilevare l'attività della gelatinasi nelle cellule di melanoma

Le metalloproteasi (MMP) sono secrete da molte cellule, incluso il melanoma maligno. La scissione mediata da MMP dei componenti della matrice extracellulare porta all'aumento del potenziale invasivo di queste cellule. La zimografia della gelatina, qui presentata, è un metodo quantificante per studiare l'attività della gelatinasi che si manifesta come un'area di gelatina digerita su un gel di poliacrilammide.

Le cellule di melanoma, avendo proprietà altamente invasive, mostrano la formazione di invadopodi, strutture formate da cellule tumorali e responsabili della digestione della matrice extracellulare circostante (ECM). Diverse metalloproteasi (MMP) sono secrete dalle cellule per idrolizzare le proteine della ECM. Sono principalmente secreti attraverso strutture note come invadopodia. La degradazione della ECM è fondamentale per le cellule tumorali durante la formazione di metastasi, poiché le cellule che si dirigono verso i vasi sanguigni devono allentare il tessuto denso.

Un gruppo di metalloproteasi secrete dalle cellule di melanoma comprende le gelatinasi, cioè le metalloproteasi 2 e 9. Le gelatinasi scindono la gelatina (collagene denaturato), alcuni tipi di collagene (incluso il tipo IV) e la fibronectina, tutti componenti strutturali della MEC. Questo articolo descrive un saggio di zimografia della gelatina per analizzare l'attività della gelatinasi delle cellule di melanoma. Questo approccio si basa sull'analisi dell'entità della digestione di un substrato (gelatina) aggiunto a un gel di poliacrilammide. Diversi vantaggi, come la semplicità, la sensibilità, il basso costo e l'analisi semiquantitativa mediante densitometria, nonché il rilevamento di forme attive e inattive di MMP, rendono questo test prezioso e ampiamente utilizzato.

Questo protocollo descrive come concentrare il terreno privo di cellule galleggianti intatte, detriti cellulari e corpi apoptotici. Successivamente, si concentra sulla preparazione del gel di poliacrilammide con aggiunta di gelatina, sull'esecuzione dell'elettroforesi su gel di dodecilsolfato-poliacrilammide di sodio (SDS-PAGE), sulla rimozione della SDS e sulla colorazione del gel per rilevare le bande prive di gelatina corrispondenti all'attività delle gelatinasi secrete dalle cellule di melanoma. Infine, l'articolo descrive come analizzare quantitativamente i dati di questo saggio. Questo metodo è una buona alternativa per stimare l'attività della gelatinasi delle cellule di melanoma a un saggio di degradazione della gelatina fluorescente, al western blot o ai saggi di immunoassorbimento enzimatico (ELISA).

Le metalloproteinasi della matrice (MMP) sono una famiglia di endopeptidasi contenenti Zn²⁺ che scindono varie proteine della ECM e proteine non ECM, come fattori di crescita, recettori cellulari, proteinasi e i loro inibitori 1,2,3,4. La specificità delle MMP nel substrato della MEC dipende dai domini peptidici e dai motivi, nonché dalle somiglianze nelle loro sequenze, definendo così i loro sottogruppi. Esistono, ad esempio, collagenasi che digeriscono vari tipi di collageni, oltre a gelatina e aggrecano; gelatinasi che scindono gelatine e collageni; e matrilisine o MT-MMP che digeriscono varie proteine della ECM⁵.

Questo articolo si concentra su due gelatinasi: MMP-2 e MMP-9, in quanto possono digerire proteoliticamente il collagene denaturato (gelatina), consentendo il rilevamento della loro attività utilizzando un saggio di zimografia su gelatina ^3,6. Sebbene MMP-2 e MMP-9 abbiano una forte somiglianza strutturale, non hanno una specificità di substrato identica⁷. Un dominio C-terminale simile all'emopessina delle MMP è responsabile del riconoscimento della sequenza⁸ del substrato. Lievi differenze nei loro domini catalitici sono responsabili delle differenze nella selettività del substrato di MMP-2 e MMP-9, ad esempio, MMP-2, a differenza di MMP-9, può scindere il collagene^{nativo di tipo I 9}. Tuttavia, le loro attività proteolitiche possono essere indiscutibilmente determinate con la zimografia della gelatina, poiché entrambe possono scindere la gelatina ^3,6.

È già noto che le MMP sono coinvolte sia in condizioni fisiologiche che patologiche. È stato scoperto che influenzano la migrazione, l'invasione, la diffusione e l'adesione cellulare, compromettendo così l'angiogenesi, l'infiammazione, la progressione tumorale e le metastasi 10,11,12,13. Poiché prendono parte a vari processi importanti, sono ampiamente studiati a causa del loro elevato potenziale terapeutico o diagnostico 14,15,16. MMP-2 (gelatinasi A) si presenta come un proenzima 72 kDa il cui prodominio lega Zn²⁺ nel sito catalitico, portando all'inibizione dell'attività enzimatica⁹. MMP-2 può essere attivata attraverso la scissione del prodominio del suo zimogeno da parte di MMP-14 (MT1-MMP), trombina e proteina C 17,18,19,20 attivata. Pertanto, la massa di MMP-2 attiva è inferiore (~64 kDa). Al contrario, la MMP-9 (gelatinasi B) è espressa come un proenzima ~92 kDa ed è attivata dalla scissione del dominio N-terminale per ottenere la proteina 83 kDa. La maturazione di MMP-9 deriva da una scissione del prodominio da parte delle serina proteasi, di altre MMP e come risposta allo stress ossidativo²¹.

La progressione e la malignità del melanoma dipendono fortemente dalla capacità delle cellule tumorali di digerire la MEC, in quanto è "una barriera" che limita la progressione e la formazione di metastasi²². Le cellule devono prima penetrare la membrana basale (BM) per entrare nel derma, migrare verso i vasi sanguigni, aderire all'endotelio vascolare e raggiungere il sangue. È stato dimostrato che l'espressione della gelatinasi era aumentata in diversi tumori ed era correlata con un aumento dell'invasione e della migrazione e con una prognosi peggiore per i pazienti^23,24. MMP-2 era altamente espresso nelle cellule di melanoma, con il suo stato di attivazione correlato con la progressione^25,26. È stato anche scoperto che MMP-9 si accumula nei tumori della pelle umana e nelle linee cellulari di melanoma^27,28.

A causa dell'elevata correlazione tra le proprietà delle MMP con l'invasività delle cellule di melanoma, la disponibilità di un test funzionale, semplice, sensibile e a basso costo per determinarne la presenza e l'attività è fondamentale per comprendere meglio la biologia del melanoma e progettare nuove tecniche diagnostiche per la loro rilevazione. Questo articolo descrive in dettaglio la tecnica di zimografia con gelatina, in quanto può essere considerata la migliore candidata per questo scopo. Questo approccio si basa sull'elettroforesi SDS in condizioni denaturanti ma non riducenti, utilizzando gel di poliacrilammide preparati con l'aggiunta di gelatina^29,30. Sebbene le proteine, tra cui MMP-2 e MMP-9, siano denaturate in presenza di SDS durante l'elettroforesi, il lavaggio in tampone contenente Triton X-100 provoca la loro rinaturazione come risultato di uno scambio SDS:Triton X-100³¹.

Queste MMP rinaturate digeriscono la gelatina durante l'incubazione del gel in un tampone di incubazione, che può essere infine osservato come chiare bande zimolitiche nel gel colorato con blu di Coomassie⁵. La quantità e l'area di gelatina digerita presentate sotto forma di bande trasparenti corrispondenti all'attività gelatinolitica delle MMP possono essere determinate utilizzando sia applicazioni comunemente utilizzate che open-source: ImageLab e ImageJ ^29,32. Sebbene questo metodo abbia molti vantaggi, possiede anche alcune limitazioni menzionate nella discussione. Questo protocollo "passo dopo passo" con note e commenti eseguiti sulle diverse linee cellulari di melanoma dovrebbe essere sufficiente per la riproducibilità e l'ottimizzazione per ottenere risultati rappresentativi. Nella Figura 1 vengono illustrati i passaggi della procedura descritta.

1. Raccolta e concentrazione di terreni di coltura cellulare

1. Seminare le cellule di melanoma (qui A375, SK-MEL-28, Hs 294T, WM9, WM1341D linee cellulari) in fiasche di coltura tissutale da 75 cm² in terreno completo [glucosio medio-alto di Eagle's modificato di Dulbecco con concentrazione ridotta (1,5 g/L) di NaHCO₃, integrato con il 10% (v/v) di siero fetale bovino (FBS), l'1% (v/v) di L-glutammina e l'1% (v/v) di antibiotico-antimicotico].
2. Coltura delle cellule in condizioni standard (5% CO₂, 37 °C).
3. Dopo che le cellule hanno raggiunto l'80-90% di confluenza, aspirare e scartare il surnatante e lavare i matracci 3 volte con terreno privo di siero o PBS riscaldato a 37 °C per rimuovere il terreno residuo nel pallone di coltura.
   NOTA: Il surnatante (terreno completo) deve essere rimosso completamente prima di aggiungere il terreno privo di siero. FBS contiene vari MMP, che possono portare a risultati falsi positivi e a un'analisi e un'interpretazione errate dei dati²⁹.
4. Aggiungere 10 mL di terreno caldo privo di siero e incubare le cellule a 37 °C in un'atmosfera umidificata al 5% di CO₂ per 48-72 ore.
   NOTA: La durata dell'incubazione cellulare nel terreno privo di siero può influire sulla vitalità cellulare, così come sulla quantità di proteine secrete. Pertanto, la durata della carenza cellulare deve essere ottimizzata prima di eseguire la zimografia a seconda del tipo di linea cellulare. Il trucco è scegliere quando le cellule sono più vitali e secernono la più alta quantità di MMP. Tutte le linee cellulari di melanoma qui utilizzate sono state coltivate in un terreno privo di siero per 48 ore senza influire sulla vitalità. Le condizioni delle cellule sono state verificate utilizzando un microscopio a contrasto di fase, sebbene sia possibile eseguire un test di vitalità cellulare XTT o MTT.
5. Raccogliere i terreni dalle colture cellulari dopo 48-72 ore e trasferirli in provette da 15 mL. Mantenere il terreno costantemente sul ghiaccio per evitare la degradazione delle proteine.
6. Centrifugare il terreno per 20 minuti a 7.000 × g a 4 °C³³.
   NOTA: La centrifugazione è fondamentale per rimuovere le cellule intatte galleggianti, i detriti cellulari e i corpi apoptotici, in quanto possono essere fonti di MMP attive. Saltare questo passaggio potrebbe portare a risultati falsi positivi e a un'analisi e un'interpretazione errate dei dati. Opzionalmente, i terreni possono essere filtrati attraverso filtri da 0,22 μm per rimuovere corpi apoptotici, microvescicole di grandi dimensioni e detriti cellulari³⁴. È importante centrifugare il terreno prima di trasferirlo a -20 °C per la conservazione, poiché il congelamento e lo scongelamento delle cellule possono causare il loro danneggiamento, rilasciando così componenti intracellulari³⁵.
7. Se necessario, conservare il terreno a -20 °C prima di ulteriori analisi (PUNTO DI ARRESTO 1).
8. Scongelare i mezzi con ghiaccio e concentrarli per ottenere il volume finale di concentrato desiderato utilizzando unità filtranti ultracentrifughe con un cutoff di 10 kDa (vedere la Tabella dei materiali), secondo le raccomandazioni del produttore.
   NOTA: Qui, il fattore di concentrazione ottenuto è stato di circa 20 volte. Poiché il peso molecolare delle MMP rilevate è compreso tra 43 e 215 kDa, si consiglia di utilizzare unità filtranti ultracentrifughe con limite di peso molecolare nominale (NMWL) di 10 kDa. L'uso di NMWL più elevati (30 kDa) può comportare la perdita delle molecole MMP con peso molecolare inferiore (ad esempio, 43 kDa collagenasi MMP-1).
9. Trasferire immediatamente il mezzo concentrato a -80 °C e conservare a -80 °C (PUNTO DI ARRESTO 2).
   NOTA: I campioni freschi o scongelati devono essere conservati in ghiaccio durante le fasi successive del protocollo per evitare la degradazione delle proteine.
10. Misurare la concentrazione di proteine nei terreni raccolti e concentrati utilizzando, ad esempio, il metodo Bradford o BCA, secondo le raccomandazioni del produttore (PUNTO 3 STOP).

2. Preparazione di gel di separazione e impilamento SDS-PAGE con gelatina (1 mg/mL) per la zimografia della gelatina

1. Posizionare la piastra distanziatrice con una piastra corta in un telaio di colata per formare una cassetta e posizionare il telaio sul supporto di fusione.
   NOTA: È possibile utilizzare la piastra distanziatrice con distanziali integrati da 0,75-1,5 mm (qui 1 mm). Assicurarsi che la superficie di lavoro sia stabile e perfettamente livellata.
2. Preparare 2,65 mg/mL di gelatina pesando la quantità appropriata di gelatina e sciogliendola in H₂O deionizzato ultrapuro o sterile riscaldando la soluzione a 65 °C. Sterilizzare la soluzione utilizzando un filtro per siringa da 0,22 μm. Raffreddare la soluzione di gelatina a temperatura ambiente prima di preparare il gel separatore.
   NOTA: La soluzione di gelatina può essere conservata per 1 settimana a 4 °C. La conservazione a lungo termine può causare contaminazione batterica e la presenza di enzimi proteolitici da essi secreti³⁶.
3. Preparare 10 mL di gel di poliacrilammide al 10% miscelando 3,95 mL di gelatina da 2,65 mg/mL, 3,3 mL di acrilammide/bis-acrilammide al 30%, 2,5 mL di Tris-HCl 1,5 M (pH 8,8), 48 μL di SDS al 10%, 80 μL di glicerolo al 50%, 70 μL di H₂O, 48 μL di APS al 10% e 4,8 μL di TEMED.
   NOTA: ATTENZIONE! Indossare guanti e occhiali protettivi quando si maneggia acrilammide/bis-acrilammide. Al termine della preparazione del gel devono essere aggiunti APS (un attivatore) e TEMED (catalizzatore di polimerizzazione del gel), dopodiché è importante lavorare in modo rapido ed efficiente. CAUTELA! TEMED deve essere aggiunto sotto una cappa aspirante. Questo volume di gel separatore è sufficiente per preparare due gel separatori con un distanziatore da 1 mm adatto all'apparecchio di elettroforesi di riferimento (vedere la Tabella dei materiali). Se è necessaria una percentuale inferiore di gel, ricalcolare i volumi dei componenti per ottenere la percentuale desiderata di acrilammide nel gel.
4. Miscelare la soluzione di gel separatore al 10% mediante inversione da sei a otto volte, evitando la formazione di bolle d'aria, e versare la soluzione nel sandwich della cassetta di gel (passaggio 2.1) fino al 75% dell'altezza della piastra corta.
   NOTA: Lo spessore del gel, la quantità di proteine caricate e il tempo di incubazione nel tampone di incubazione (vedere il passaggio 5.1.3 per la composizione) devono essere ottimizzati per ottenere aree del gel con le bande di gelatina completamente digerite separate per le singole MMP. In definitiva, ciò dipende dalla quantità di MMP secrete da un determinato tipo di cellula.
5. Stratificare la parte superiore del gel con etanolo al 70%.
   NOTA: È fondamentale rimuovere le bolle ed evitare che il gel si secchi e formi contatto con l'aria, che non è adatta alla polimerizzazione.
6. Lasciare il gel per circa 30 minuti a temperatura ambiente. Quando la polimerizzazione è completa ed è visibile una chiara linea di separazione tra la miscela di gel e gli strati di etanolo, rimuovere con cura lo strato di etanolo.
7. Preparare il gel da impilamento al 4% (5 mL) mescolando 3,05 mL di H₂O, 0,67 mL di acrilammide/bis-acrilammide al 30%, 1,25 mL di Tris-HCl 0,5 M (pH 6,8), 50 μL di SDS al 10%, 50 μL di APS al 10% e 5 μL di TEMED. Mescolare la soluzione di gel di impilamento al 4% inversandola da sei a otto volte.
   NOTA: Questo volume è sufficiente per preparare due gel da impilare con un distanziatore da 1 mm.
8. Inserire immediatamente un pettine sulla parte superiore della cassetta sandwich in gel e riempirla con la soluzione di gel da impilare.
9. Incubare il gel di impilamento per circa 30 minuti a temperatura ambiente per consentirne la polimerizzazione completa.
10. Avvolgere i gel con carta assorbente umida, metterli in un sacchetto di plastica e mantenere i gel a 4°C per almeno una notte ma non più di 1 settimana.
11. Caricare la cassetta sandwich in gel in un gruppo di elettrodi, trasferirla nel serbatoio e riempirla con 1 tampone SDS-PAGE [250 mM Tris-HCl, 1,92 M glicina, 1% (p/v) SDS] prima di eseguire l'elettroforesi SDS-PAGE.
    NOTA: Il tampone SDS-PAGE può essere conservato a 4 °C per periodi prolungati.
12. Rimuovere il pettine dal gel.

3. Preparazione di gel di separazione e impilamento SDS-PAGE per la determinazione del contenuto proteico totale

NOTA: I passaggi della sezione 3 sono simili ai passaggi della sezione 2 che descrivono la preparazione del gel per la zimografia della gelatina. Si noti che la composizione dei gel è diversa. Un gel per la determinazione del contenuto proteico totale non deve contenere gelatina, poiché sarà anche colorato dalla soluzione Coomassie Brilliant Blue.

1. Preparare 10 mL di gel separatore al 10% mescolando 3,34 mL di acrilammide/bis-acrilammide al 30%, 2,5 mL di Tris-HCl 1,5 M (pH 8,8), 100 μL di SDS al 10%, 3,99 mL di H₂O, 50 μL di APS al 10% e 20 μL di TEMED.
2. Mescolare la soluzione per inversione, evitando la formazione di bolle d'aria, e trasferire la soluzione nel sandwich della cassetta gel fino al 75% dell'altezza della piastra corta.
3. Stratificare la parte superiore del gel con etanolo e lasciare il gel per circa 30 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere l'etanolo.
4. Preparare 5 mL di gel da impilare al 4% mescolando 650 μL di acrilammide/bis-acrilammide al 30%, 1,25 mL di Tris-HCl da 1,5 M (pH 8,8), 50 μL di SDS al 10%, 2,99 mL di H₂O, 25 μL di APS al 10% e 12,5 μL di TEMED.
5. Posiziona un pettine sulla parte superiore della cassetta del sandwich in gel e riempila con la soluzione di gel impilabile.
6. Lasciare il gel per circa 30 minuti a temperatura ambiente.
   NOTA: Il gel può essere preparato poco prima dell'elettroforesi SDS-PAGE o conservato per alcuni giorni a 4 °C. Per la conservazione del gel, avvolgere il gel in un tovagliolo di carta bagnato e metterlo in un sacchetto di plastica per mantenerlo umido.
7. Inserire le cassette con i gel nel serbatoio, caricare la cassetta sandwich di gel in un gruppo di elettrodi e trasferire il gruppo in un serbatoio con 1x tampone SDS-PAGE [250 mM Tris-HCl, 1,92 M glicina, 1% (p/v) SDS] prima di eseguire l'elettroforesi SDS-PAGE.
8. Rimuovere il pettine dal gel.

4. Caricamento del campione ed esecuzione dell'elettroforesi

1. Preparare ciascun campione SDS-PAGE per la zimografia mescolando un rapporto 1:1 di 3-20 μg (qui 10 μg) di terreno concentrato con 2 tamponi di carico non riducenti [10 mM Tris pH 6,8, 1% (p/v) SDS, 10% (v/v) glicerolo, 0,03% (p/v) blu di bromofenolo] in base alla concentrazione stimata di proteine nel terreno.
   NOTA: Il tampone di caricamento deve essere conservato a 4°C. L'uso di β-mercaptoetanolo e ditiotreitolo (DTT) non è raccomandato a causa della loro capacità di distruggere i legami disolfuro tra i residui di cisteina, il che si traduce nell'incapacità della MMP di ripiegarsi dopo l'elettroforesi.
2. Preparare il gel per la determinazione del contenuto proteico totale mescolando i campioni in un rapporto 1:3 con un tampone riducente 4x [40% (v/v) di glicerolo, 240 mM di Tris (pH 6,8), 8% (p/v) di SDS, 0,04% (p/v) di blu di bromofenolo, 5% (v/v) di β-mercaptoetanolo].
   NOTA: ATTENZIONE! Indossare guanti e occhiali protettivi e lavorare sotto la cappa aspirante. Il tampone di caricamento deve essere conservato a -20 °C. La stessa quantità di proteine dovrebbe essere caricata in ogni corsia. Se necessario, i campioni possono essere conservati opzionalmente a -80 °C per alcuni giorni (PUNTO STOP 4).
3. Incubare i campioni per la zimografia con gelatina per 20 minuti a 37 °C prima di eseguire l'elettroforesi.
   NOTA: Non riscaldare i campioni a una temperatura superiore a 37 °C. La denaturazione termica delle proteine può portare all'inattivazione dell'attività della proteasi o impedire il ripiegamento degli enzimi, causando risultati falsi negativi e un'errata interpretazione dei dati³¹.
4. Incubare i campioni per la determinazione del contenuto proteico totale per 10 minuti a 95 °C.
5. Centrifugare i campioni per alcuni secondi in una piccola centrifuga da tavolo e caricarli nei pozzetti dei gel.
6. Facoltativamente, caricare nei pozzetti una scala di peso molecolare e campioni di controllo negativi (campioni che sono stati bolliti per 10 minuti a 95 °C) e positivi (ad esempio, MMP-2 e MMP-9 ricombinanti o una linea cellulare nota per secernere MMP-2 e MMP-9³⁶).
7. Eseguire l'elettroforesi, tenendola in ghiaccio fino a quando il colorante non fuoriesce dal gel per fornire una buona separazione delle bande MMP-9 e MMP-2. Utilizzare le seguenti condizioni di elettroforesi SDS-PAGE: inizialmente, 20 mA per gel, aumentando la potenza a 40 mA per gel quando i campioni entrano nel gel di separazione.
   NOTA: La corrente elettrica massima non deve superare i 130 mA per quattro gel. In caso contrario, il gel si surriscalda durante l'elettroforesi. L'elettroforesi può essere eseguita in una scatola contenente ghiaccio o in una cella frigorifera (4 °C), se disponibile.

5. Attivazione, colorazione e decolorazione del gel di poliacrilammide

1. Lavaggio e attivazione del gel
   1. Rimuovere il gel per zimografia tra le piastre corte e distanziatrici e trasferirlo in un contenitore di plastica con tampone di lavaggio [50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 10 mM CaCl₂, 2,5% (v/v) Triton X-100]. Preparare il tampone di lavaggio il giorno della zimografia della gelatina.
      NOTA: Poiché Triton X-100 è molto viscoso, pipettarlo secondo le regole per il pipettaggio di liquidi viscosi per aggiungere lo stesso volume di Triton X-100 ogni volta che si prepara il tampone³⁷.
   2. Incubare il gel due volte nel tampone di lavaggio, ogni volta per 30 minuti con una leggera agitazione per rimuovere la SDS dal gel e sostituirlo con Triton X-100.
   3. Trasferire il gel in un serbatoio di plastica contenente tampone di incubazione (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 10 mM CaCl₂).
      NOTA: Per la conservazione a lungo termine, mantenere il tampone di incubazione a 4 °C. Preparare un tampone fresco se ci sono segni di contaminazione microbica o precipitazione.
   4. Incubare il gel nel tampone di incubazione per 12-20 ore (qui 16 ore) a 37 °C.
      NOTA: Lo spessore del gel e la quantità di proteine caricate influenzano il periodo di incubazione nel tampone di incubazione, che dovrebbe essere ottimizzato per ottenere le aree di gelatina ben digerite nel gel.
2. Colorazione e decolorazione in gel
   1. Preparare la soluzione colorante contenente una soluzione acquosa di 0,5% (p/v) di Coomassie Brilliant Blue R-250, 30% (v/v) di etanolo e 10% (v/v) di acido acetico.
      NOTA: ATTENZIONE! Lavorare sotto la cappa aspirante e indossare i guanti quando si utilizza l'acido acetico. Sciogliere la quantità pesata di Coomassie Blue in acqua, aggiungere etanolo e mescolare la soluzione. Alla fine, aggiungere lentamente acido acetico alla soluzione di etanolo-acqua per evitare una reazione esotermica.
   2. Preparare la soluzione decolorante contenente il 30% (v/v) di etanolo e il 10% (v/v) della soluzione acetica in H₂O.
      NOTA: Mescolare l'etanolo con H₂O. Aggiungere lentamente acido acetico alla soluzione di etanolo-acqua alla fine per evitare una reazione esotermica.
   3. Trasferire il gel in un contenitore di plastica con la soluzione Coomassie Brilliant Blue e colorare il gel per 30 minuti a temperatura ambiente agitando delicatamente.
      NOTA: FastGene Q-Stain può essere utilizzato anche per colorare il gel. Il vantaggio di questo colorante è che è pronto all'uso e che il gel colorato non richiede alcuna fase di decolorazione.
   4. Incubare il gel nel tampone di decolorazione a temperatura ambiente agitando delicatamente per decolorare. Continuare la decolorazione fino a quando non sono visibili bande chiare che rappresentano l'attività della gelatinasi.
      NOTA: Se la colorazione con la soluzione di Blu Brillante Coomassie è molto intensa, sostituire il tampone di decolorazione alcune volte durante l'incubazione.
   5. Mantieni il gel idratato e non lasciarlo asciugare fino alla sua visualizzazione.
      NOTA: Sostituire il tampone di decolorazione con acqua per rallentare il processo di decolorazione fino alla visualizzazione.

6. Visualizzazione delle proteine nei gel di poliacrilammide

NOTA: Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli sul sistema di imaging e sul software utilizzati per visualizzare le proteine nei gel di poliacrilammide (Figura 2A-C). A questo scopo possono essere utilizzati anche altri sistemi di visualizzazione su gel prontamente disponibili (come iBright Imaging Systems, UVP PhotoDoc-It Imaging System, E-Gel Imager e Azure Imagers).

1. Accendere l'apparecchiatura di imaging e aprire il software.
2. Fare clic su File | Nuovo progetto per aprire un nuovo progetto.
3. Scegli il tipo di applicazione facendo clic su Seleziona... | Gel proteici | Blu Coomassie.
4. Trasferire i gel, uno per uno, nel sistema di imaging e controllare la posizione del gel utilizzando il pulsante Posiziona gel.
5. Visualizza il gel facendo clic su Esegui protocollo.
6. Salvare l'immagine in formato .scn per consentire ulteriori analisi utilizzando il software di riferimento.
7. Inoltre, esporta il file come .tif facendo clic su File | Esportazione | Esporta per analisi, che sarà utile per l'analisi utilizzando ImageJ (PUNTO DI ARRESTO 5).

7. Analisi dei dati

1. Analisi del gel con il software di imaging
   1. Apri il software di imaging e le immagini dello zimogramma e del gel che rappresentano il contenuto proteico totale.
   2. Inverti l'immagine per ottenere bande nere su sfondo bianco. In Vai all'impostazione Trasformazione immagine, fare clic su Inverti visualizzazione immagine.
   3. Selezionare le linee e le bande sullo zimogramma che rappresentano MMP-2 e MMP-9 manualmente o automaticamente utilizzando la casella degli strumenti di analisi | Sezione Lane e Bande. Crea una banda per linea e regolane le dimensioni per includere l'intera area della linea per la determinazione del contenuto proteico totale sul gel che rappresenta il contenuto proteico totale.
   4. Regolare le linee e le bande utilizzando gli strumenti disponibili nella sezione Lane and Band (Figura 2A'-C').
   5. Vai alla tabella di analisi e copia il volume (intensità) e il peso molecolare di ogni corsia e banda (Figura 2A"-C").
   6. Dividi il volume di ciascuna corsia per il volume della corsia di controllo selezionata (qui A375) per confrontare il contenuto proteico totale tra le corsie (Figura 2A).
   7. Dividere il volume di ciascuna banda per il valore della corsia corrispondente (dal passaggio 7.6) per normalizzare il volume dell'attività MMP al contenuto proteico totale (Figura 2B",C").
   8. Per confrontare l'attività delle gelatinasi tra le linee, dividere il volume normalizzato della linea studiata/condizione studiata per il volume normalizzato della linea di controllo/condizione standard (qui A375) (Figura 2B",C").
2. Analisi alternativa dei gel con il software ImageJ
   1. Aprire il software ImageJ e aprire l'immagine del gel invertito (bande nere su sfondo bianco).
   2. Delinea la prima corsia con bande digerite con gelatina usando lo strumento rettangolo .
   3. Scegli Analizza | Gel | Selezionare Prima corsia nella barra degli strumenti ImageJ per selezionare e contrassegnare la prima corsia.
   4. Trasferire la prima selezione con contorno (rettangolo giallo) nella corsia successiva e fare clic su Analizza | Gel | Selezionare Corsia successiva per selezionare e contrassegnare la corsia successiva.
   5. Selezionare tutte le corsie presentate sul gel allo stesso modo (Figura 3A-C).
   6. Vai su Seleziona Analizza | Gel | Tracciare le corsie per creare i grafici del profilo della corsia (Figura 3A'-C').
   7. Utilizzando lo strumento Dritto , separare le bande con linee verticali ai bordi di ciascun picco e quindi disegnare linee orizzontali per "chiudere" la loro area (Figura 3A'-C'; linee gialle).
   8. Misura la dimensione di ogni picco utilizzando lo strumento di tracciamento . Fare clic nell'area di ogni picco per selezionarlo e attendere che i picchi vengano delineati in giallo.
   9. Cerca la dimensione di ogni picco selezionato nella tabella dei risultati (Figura 3A"-C").
   10. Normalizzare i dati al contenuto proteico totale come descritto al punto 7.1.
   11. Dividi l'"area" della linea/condizione studiata per "area" della linea di controllo/condizione standard (Figura 3A"-C").
3. Presentazione dei dati
   1. Mostra i risultati ottenuti con il software di imaging come l'attività MMP normalizzata al contenuto proteico totale e alla linea di controllo (Figura 4A, B).
   2. Presentare i risultati ottenuti con ImageJ come attività MMP normalizzata al contenuto proteico totale e alla linea di controllo (Figura 4C, D).

In questo protocollo, descriviamo la procedura per la zimografia su gelatina (Figura 1) utilizzando come campioni terreni ottenuti da cinque linee cellulari di melanoma (A375, SK-MEL-28, Hs-294T, WM9, WM1341D). L'approccio zimografico mostrato qui include due elettroforesi SDS-PAGE separate. Un'elettroforesi SDS-PAGE risulta nel gel colorato con blu di Coomassie, che rappresenta il contenuto proteico totale caricato in ciascuna linea (Fi...

Nonostante il protocollo "passo dopo passo" qui elaborato, la zimografia della gelatina richiede un'ottimizzazione a seconda dei campioni/linee cellulari analizzati. Diversi tipi di cellule e linee cellulari (linee cellulari di melanoma mostrate qui) possono secernere entrambe le forme (pro- e attive) di MMP-2 e MMP-9 ma con diversa attività della gelatinasi. L'ottimizzazione della procedura include principalmente la durata della fame cellulare, lo spessore del gel di poliacrilammide, l...

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Center for Science, Polonia (progetto #2016/22/E/NZ3/00654, concesso ad AJM).