Zimografía en gelatina para detectar la actividad de la gelatinasa en células de melanoma

Las metaloproteasas (MMP) son secretadas por muchas células, incluido el melanoma maligno. La escisión de los componentes de la matriz extracelular mediada por MMP conduce a un mayor potencial invasivo de estas células. La zimografía en gelatina, presentada aquí, es un método cuantificador para estudiar la actividad de la gelatinasa que se manifiesta como un área de gelatina digerida en un gel de poliacrilamida.

Las células de melanoma, que tienen propiedades altamente invasivas, exhiben la formación de invadopodios, estructuras formadas por células tumorales y responsables de la digestión de la matriz extracelular (MEC) circundante. Varias metaloproteasas (MMP) son secretadas por las células para hidrolizar las proteínas de la MEC. Se secretan principalmente a través de estructuras conocidas como invadopodios. La degradación de la MEC es crucial para las células tumorales mientras forma metástasis, ya que las células que se dirigen hacia los vasos sanguíneos deben aflojar el tejido denso.

Un grupo de metaloproteasas secretadas por las células de melanoma comprende las gelatinasas, es decir, las metaloproteasas 2 y 9. Las gelatinasas escinden la gelatina (colágeno desnaturalizado), algunos tipos de colágeno (incluido el tipo IV) y la fibronectina, todos componentes estructurales de la MEC. En este artículo se describe un ensayo de zimografía en gelatina para analizar la actividad de la gelatinasa en células de melanoma. Este enfoque se basa en analizar el grado de digestión de un sustrato (gelatina) añadido a un gel de poliacrilamida. Varias ventajas, como la simplicidad, la sensibilidad, el bajo costo y el análisis semicuantitativo por densitometría, así como la detección de formas activas e inactivas de MMP, hacen que este ensayo sea valioso y ampliamente utilizado.

Este protocolo describe cómo concentrar el medio desprovisto de células flotantes intactas, restos celulares y cuerpos apoptóticos. A continuación, se centra en la preparación de gel de poliacrilamida con adición de gelatina, la realización de electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE), la eliminación de SDS y la tinción del gel para detectar bandas sin gelatina correspondientes a la actividad de las gelatinasas secretadas por las células de melanoma. Finalmente, el artículo describe cómo analizar cuantitativamente los datos de este ensayo. Este método es una buena alternativa para estimar la actividad de la gelatinasa de las células de melanoma en un ensayo de degradación de gelatina fluorescente, Western blot o ensayos de inmunoabsorción enzimática (ELISA).

Las metaloproteinasas de matriz (MMP) son una familia de endopeptidasas que contienen Zn²⁺ y que escinden varias proteínas de la MEC y proteínas no MEC, como factores de crecimiento, receptores celulares, proteinasas y sus inhibidores 1,2,3,4. La especificidad del sustrato de ECM de las MMP depende de los dominios y motivos peptídicos, así como de las similitudes en sus secuencias, definiendo así sus subgrupos. Existen, por ejemplo, colagenasas que digieren varios tipos de colágenos, así como gelatina y agrecano; gelatinasas que escinden gelatinas y colágenos; y matrilisinas o MT-MMPs que digieren diversas proteínas de la MEC⁵.

Este trabajo se centra en dos gelatinasas: MMP-2 y MMP-9, ya que pueden digerir colágeno desnaturalizado (gelatina) de forma proteolítica, lo que permite detectar su actividad mediante un ensayo de zimografía de gelatina ^3,6. Aunque MMP-2 y MMP-9 tienen una gran semejanza estructural, no tienen una especificidad de sustrato idéntica⁷. Un dominio similar a la hemopexina C-terminal de las MMP es responsable de reconocer la secuencia^{de sustrato 8}. Las ligeras diferencias en sus dominios catalíticos son responsables de las diferencias en la selectividad del sustrato de MMP-2 y MMP-9, por ejemplo, MMP-2, a diferencia de MMP-9, puede escindir colágeno nativo tipo^{I 9}. Sin embargo, sus actividades proteolíticas pueden determinarse incuestionablemente con la zimografía en gelatina, ya que ambas pueden escindir la gelatina ^3,6.

Ya se sabe que las MMP están implicadas tanto en condiciones fisiológicas como patológicas. Se descubrió que afectan la migración, invasión, diseminación y adhesión celular, lo que perjudica la angiogénesis, la inflamación, la progresión tumoral y la metástasis 10,11,12,13. Al participar en diversos procesos importantes, son ampliamente estudiados debido a su alto potencial terapéutico o diagnóstico 14,15,16. La MMP-2 (gelatinasa A) se presenta como una proenzima de 72 kDa cuyo prodominio se une al Zn²⁺ en el sitio catalítico, lo que conduce a la inhibición de la actividad enzimática⁹. MMP-2 puede ser activada a través de la escisión del prodominio de su zimógeno por MMP-14 (MT1-MMP), trombina y proteína C activada 17,18,19,20. Por lo tanto, la masa de MMP-2 activa es menor (~64 kDa). Por el contrario, la MMP-9 (gelatinasa B) se expresa como una proenzima de ~92 kDa y se activa por la escisión del dominio N-terminal para obtener la proteína de 83 kDa. La maduración de MMP-9 es el resultado de una escisión del prodominio por serina proteasas, otras MMPs y como respuesta al estrés oxidativo²¹.

La progresión y la malignidad del melanoma dependen en gran medida de la capacidad de las células tumorales para digerir la MEC, ya que es "una barrera" que limita la progresión de las células y la formación de metástasis²². Las células primero deben penetrar en la membrana basal (MO) para entrar en la dermis, migrar hacia los vasos sanguíneos, adherirse al endotelio vascular y llegar a la sangre. Se ha demostrado que la expresión de gelatinasa se incrementó en diferentes cánceres y se correlacionó con un aumento de la invasión y migración y un peor pronóstico para los pacientes^23,24. MMP-2 se expresó altamente en células de melanoma, y su estado de activación se correlacionó con la progresión^25,26. También se encontró que MMP-9 se acumula en tumores de piel humana y líneas celulares de melanoma^27,28.

Debido a la alta correlación entre las propiedades de las MMPs con la invasividad de las células de melanoma, la disponibilidad de un ensayo funcional sencillo, sensible y de bajo coste para determinar su presencia y actividad es crucial para comprender mejor la biología del melanoma y diseñar nuevas técnicas diagnósticas para su detección. En este trabajo se describe en detalle la técnica de zimografía en gelatina, ya que puede considerarse la mejor candidata para este fin. Este enfoque se basa en la electroforesis SDS en condiciones desnaturalizantes pero no reductoras, utilizando geles de poliacrilamida preparados con la adición de gelatina^29,30. Aunque las proteínas, incluidas MMP-2 y MMP-9, se desnaturalizan en presencia de SDS durante la electroforesis, el lavado en tampón que contiene Triton X-100 provoca su renaturalización como resultado de un intercambio SDS:Triton X-100³¹.

Estos MMP renaturalizados digieren la gelatina durante la incubación del gel en un tampón de incubación, que finalmente se puede observar como bandas zimolíticas claras en el gel teñido con azul de Coomassie⁵. La cantidad y el área de gelatina digerida presentada como bandas transparentes correspondientes a la actividad gelatinolítica de las MMP se pueden determinar utilizando aplicaciones de uso común y de código abierto: ImageLab e ImageJ^29,32. Aunque este método tiene muchas ventajas, también posee algunas limitaciones mencionadas en la discusión. Este protocolo "paso a paso" con notas y comentarios realizados sobre las diferentes líneas celulares de melanoma debe ser suficiente para la reproducibilidad y optimización para obtener resultados representativos. En la figura 1 se presentan los pasos del procedimiento descrito.

1. Recolección y concentración del medio de cultivo celular

1. Siembre las células de melanoma (aquí A375, SK-MEL-28, Hs 294T, WM9, WM1341D líneas celulares) en un cultivo de tejidos de⁷⁵ cm2 matraces en medio completo [Dulbecco's Eagle's modificado con glucosa media-alta con concentración reducida (1,5 g/L) de NaHCO₃, suplementado con 10% (v/v) de suero fetal bovino (FBS), 1% (v/v) de L-glutamina y 1% (v/v) antibiótico-antimicótico].
2. Cultivar las células en condiciones estándar (5% CO₂, 37 °C).
3. Una vez que las células alcancen el 80-90% de confluencia, aspire y deseche el sobrenadante y lave los matraces 3 veces con medio sin suero o PBS calentado a 37 °C para eliminar el medio residual en el matraz de cultivo.
   NOTA: El sobrenadante (medio completo) debe eliminarse por completo antes de agregar el medio sin suero. FBS contiene varios MMP, lo que puede conducir a resultados falsos positivos y análisis e interpretación de datos erróneos²⁹.
4. Añadir 10 mL de medio tibio sin suero e incubar las células a 37 °C en una atmósfera humidificada de 5% de CO₂ durante 48-72 h.
   NOTA: La duración de la incubación celular en el medio libre de suero puede afectar la viabilidad celular, así como la cantidad de proteínas secretadas. Por lo tanto, la duración de la inanición celular debe optimizarse antes de realizar la zimografía en función del tipo de línea celular. El truco consiste en elegir cuándo las células son más viables y secretan la mayor cantidad de MMP. Todas las líneas celulares de melanoma utilizadas aquí se cultivaron en un medio libre de suero durante 48 h sin afectar la viabilidad. El estado de las células se verificó utilizando un microscopio de contraste de fase, aunque se puede realizar un ensayo de viabilidad celular XTT o MTT.
5. Recoja los medios de los cultivos celulares después de 48-72 h y transfiéralos a tubos de 15 mL. Mantenga el medio constantemente en hielo para evitar la degradación de proteínas.
6. Centrifugar el medio durante 20 min a 7.000 × g a 4 °C³³.
   NOTA: La centrifugación es crucial para eliminar las células intactas flotantes, los restos celulares y los cuerpos apoptóticos, ya que pueden ser fuentes de MMP activas. Omitir este paso podría dar lugar a resultados falsos positivos y a un análisis e interpretación de datos erróneos. Opcionalmente, los medios se pueden filtrar a través de filtros de 0,22 μm para eliminar cuerpos apoptóticos, microvesículas grandes y restos celulares³⁴. Es importante centrifugar el medio antes de transferirlo a -20 °C para su almacenamiento, ya que la congelación y descongelación de las células puede provocar su daño, liberando así componentes intracelulares³⁵.
7. Almacene el medio a -20 °C si es necesario antes de realizar análisis adicionales (PUNTO DE PARADA 1).
8. Descongele los medios en hielo y concéntrelos para lograr el volumen de concentrado final deseado utilizando unidades de filtro ultracentrífugo con un corte de 10 kDa (consulte la Tabla de materiales), de acuerdo con la recomendación del fabricante.
   NOTA: Aquí, el factor de concentración obtenido fue de aproximadamente 20 veces. Dado que el peso molecular de los MMP detectados es de 43-215 kDa, se recomienda utilizar unidades de filtro ultracentrífugo con un límite de peso molecular nominal (NMWL) de 10 kDa. El uso de NMWL más alto (30 kDa) puede resultar en la pérdida de las moléculas de MMP con menor peso molecular (por ejemplo, 43 kDa colagenasa MMP-1).
9. Transfiera el medio concentrado inmediatamente a -80 °C y almacene a -80 °C (PUNTO DE PARADA 2).
   NOTA: Las muestras frescas o descongeladas deben mantenerse en hielo durante los siguientes pasos del protocolo para evitar la degradación de proteínas.
10. Mida la concentración de proteínas en medios recogidos y concentrados utilizando, por ejemplo, el método Bradford o BCA, de acuerdo con la recomendación del fabricante (STOP POINT 3).

2. Preparación de geles separadores y apiladores SDS-PAGE con gelatina (1 mg/mL) para zimografía en gelatina

1. Coloque la placa espaciadora con una placa corta en un marco de fundición para formar un casete y coloque el marco en el soporte de fundición.
   NOTA: Se puede utilizar la placa espaciadora con espaciadores integrados de 0,75-1,5 mm (en este caso, 1 mm). Asegúrese de que la superficie de trabajo esté estable y perfectamente nivelada.
2. Preparar 2,65 mg/mL de gelatina pesando la cantidad adecuada de gelatina y disolviéndola en H₂O desionizado ultrapuro o estéril calentando la solución a 65 °C. Esterilice la solución con un filtro de jeringa de 0,22 μm. Enfríe la solución de gelatina a temperatura ambiente antes de preparar el gel separador.
   NOTA: La solución de gelatina puede almacenarse durante 1 semana a 4 °C. El almacenamiento a largo plazo puede causar contaminación bacteriana y la presencia de enzimas proteolíticas secretadas por ellas³⁶.
3. Prepare 10 mL de gel de poliacrilamida separador al 10% mezclando 3,95 mL de gelatina de 2,65 mg/mL, 3,3 mL de acrilamida/bis-acrilamida al 30%, 2,5 mL de Tris-HCl 1,5 M (pH 8,8), 48 μL de SDS al 10%, 80 μL de glicerol al 50%, 70 μL de_H2O, 48 μL de APS al 10% y 4,8 μL de TEMED.
   NOTA: ¡ATENCIÓN! Use guantes y gafas protectoras cuando manipule acrilamida/bis-acrilamida. Al final de la preparación del gel, se deben agregar APS (un activador) y TEMED (catalizador de la polimerización en gel), después de lo cual es importante trabajar de manera rápida y eficiente. ¡CAUTELA! TEMED debe agregarse debajo de una campana extractora. Este volumen del gel separador es suficiente para preparar dos geles separadores con un espaciador de 1 mm adecuado para el aparato de electroforesis de referencia (consulte la tabla de materiales). Si se requiere un porcentaje menor del gel, recalcule los volúmenes de los componentes para obtener el porcentaje deseado de acrilamida en el gel.
4. Mezcle la solución de gel separador al 10% por inversión de seis a ocho veces, evitando la formación de burbujas de aire, y vierta la solución en el sándwich de casete de gel (paso 2.1) hasta el 75% de la altura de la placa corta.
   NOTA: El espesor del gel, la cantidad de proteína cargada y el tiempo de incubación en el tampón de incubación (consulte el paso 5.1.3 para la composición) deben optimizarse para obtener áreas del gel con las bandas de gelatina completamente digeridas separadas para MMP individuales. En última instancia, esto depende de la cantidad de MMP secretadas por un tipo de célula dado.
5. Cubre la parte superior del gel con etanol al 70%.
   NOTA: Es fundamental eliminar las burbujas y evitar que el gel se seque y forme contacto con el aire, lo que no es adecuado para la polimerización.
6. Dejar el gel durante aproximadamente 30 min a temperatura ambiente. Cuando se complete la polimerización y se vea una línea de separación clara entre la mezcla de gel y las capas de etanol, retire la capa de etanol con cuidado.
7. Prepare gel de apilamiento al 4% (5 mL) mezclando 3,05 mL de H_2O, 0,67 mL de acrilamida/bis-acrilamida al 30%, 1,25 mL de Tris-HCl 0,5 M (pH 6,8), 50 μL de SDS al 10%, 50 μL de APS al 10% y 5 μL de TEMED. Mezcle la solución de gel apilante al 4% por inversión de seis a ocho veces.
   NOTA: Este volumen es suficiente para preparar dos geles de apilamiento con un espaciador de 1 mm.
8. Inserte un peine en la parte superior del casete sándwich de gel inmediatamente y llénelo con la solución de gel apilable.
9. Incube el gel apilador durante aproximadamente 30 minutos a temperatura ambiente para permitir que se polimerice por completo.
10. Envuelva los geles con toallas de papel húmedas, colóquelos en una bolsa de plástico y mantenga los geles a 4 °C durante al menos toda la noche, pero no más de 1 semana.
11. Cargue el casete sándwich de gel en un conjunto de electrodos, transfiéralo al tanque y llénelo con 1 tampón SDS-PAGE [250 mM de Tris-HCl, 1,92 M de glicina, 1% (p/v) de SDS] antes de ejecutar la electroforesis SDS-PAGE.
    NOTA: El tampón SDS-PAGE se puede almacenar a 4 °C durante períodos prolongados.
12. Retira el peine del gel.

3. Preparación de geles separadores y apiladores SDS-PAGE para la determinación del contenido total de proteínas

NOTA: Los pasos de la sección 3 son similares a los pasos de la sección 2 que describen la preparación del gel para la zimografía en gelatina. Tenga en cuenta que la composición de los geles es diferente. Un gel para la determinación del contenido total de proteínas no debe contener gelatina, ya que también se teñirá con la solución de Coomassie Brilliant Blue.

1. Prepare 10 mL de gel separador al 10% mezclando 3,34 mL de acrilamida/bis-acrilamida al 30%, 2,5 mL de Tris-HCl al 1,5 M (pH 8,8), 100 μL de SDS al 10%, 3,99 mL de H₂O, 50 μL de APS al 10% y 20 μL de TEMED.
2. Mezcle la solución por inversión, evitando la formación de burbujas de aire, y transfiera la solución al sándwich de casete de gel hasta el 75% de la altura de la placa corta.
3. Cubra la parte superior del gel con etanol y deje el gel durante aproximadamente 30 minutos a temperatura ambiente. Retira el etanol.
4. Prepare 5 mL de gel apilante al 4% mezclando 650 μL de acrilamida/bis-acrilamida al 30%, 1,25 mL de Tris-HCl 1,5 M (pH 8,8), 50 μL de SDS al 10%, 2,99 mL de H₂O, 25 μL de APS al 10% y 12,5 μL de TEMED.
5. Coloque un peine en la parte superior del casete de sándwich de gel y llénelo con una solución de gel apilable.
6. Dejar el gel durante aproximadamente 30 min a temperatura ambiente.
   NOTA: El gel puede prepararse justo antes de la electroforesis SDS-PAGE o almacenarse durante unos días a 4 °C. Para el almacenamiento del gel, envuelva el gel en una toalla de papel húmeda y colóquelo en una bolsa de plástico para mantenerlo húmedo.
7. Coloque los casetes con los geles en el tanque, cargue el casete sándwich de gel en un conjunto de electrodos y transfiera el conjunto a un tanque con 1x tampón SDS-PAGE [250 mM de Tris-HCl, 1,92 M de glicina, 1% (p/v) SDS] antes de ejecutar la electroforesis SDS-PAGE.
8. Retira el peine del gel.

4. Carga de muestras y ejecución de electroforesis

1. Prepare cada muestra de SDS-PAGE para la zimografía mezclando una proporción de 1:1 de 3-20 μg (en este caso, 10 μg) de medio concentrado con 2 tampones de carga no reductor [10 mM Tris pH 6,8, 1% (p/v) de SDS, 10% (v/v) glicerol, 0,03% (p/v) azul de bromofenol] en función de la concentración estimada de proteína en el medio.
   NOTA: El tampón de carga debe almacenarse a 4 °C. No se recomienda el uso de β-mercaptoetanol y ditiotreitol (DTT) debido a su capacidad para destruir los enlaces disulfuro entre los residuos de cisteína, lo que resulta en la incapacidad de la MMP para volver a plegarse después de la electroforesis.
2. Prepare el gel para la determinación del contenido total de proteínas mezclando muestras en una proporción de 1:3 con tampón reductor 4x [40% (v/v) glicerol, 240 mM Tris (pH 6,8), 8% (p/v) SDS, 0,04% (p/v) azul de bromofenol, 5% (v/v) β-mercaptoetanol].
   NOTA: ¡ATENCIÓN! Use guantes y gafas, y trabaje debajo de la campana extractora. El tampón de carga debe almacenarse a -20 °C. Se debe cargar la misma cantidad de proteína en cada carril. Las muestras pueden almacenarse opcionalmente a -80 °C durante unos días si es necesario (PUNTO DE PARADA 4).
3. Incubar las muestras para la zimografía en gelatina durante 20 minutos a 37 °C antes de realizar la electroforesis.
   NOTA: No caliente las muestras a una temperatura superior a 37 °C. La desnaturalización térmica de las proteínas puede conducir a la inactivación de la actividad de la proteasa o impedir el repliegue de las enzimas, lo que provoca resultados falsos negativos y una interpretación incorrecta de los datos³¹.
4. Incubar las muestras para determinar el contenido total de proteínas durante 10 min a 95 °C.
5. Gire las muestras durante unos segundos en una pequeña centrífuga de mesa y cárguelas en los pocillos de los geles.
6. Opcionalmente, cargue una escala de peso molecular y muestras de control negativas (que se han hervido durante 10 minutos a 95 °C) y positivas (por ejemplo, MMP-2 y MMP-9 recombinantes o una línea celular conocida por secretar MMP-2 y MMP-9³⁶) en los pocillos.
7. Realice la electroforesis, manteniéndolo en hielo hasta que el tinte fluya fuera del gel para proporcionar una buena separación de bandas de MMP-9 y MMP-2. Utilice las siguientes condiciones de electroforesis SDS-PAGE: inicialmente, 20 mA por gel, aumentando la potencia a 40 mA por gel cuando las muestras ingresan al gel separador.
   NOTA: La corriente eléctrica máxima no debe exceder los 130 mA para cuatro geles. De lo contrario, el gel se sobrecalentará durante la electroforesis. La electroforesis puede realizarse en una caja que contenga hielo o en una cámara frigorífica (4 °C), si está disponible.

5. Activación, tinción y decoloración del gel de poliacrilamida

1. Lavado y activación del gel
   1. Retire el gel de zimografía de entre las placas cortas y espaciadoras y transfiéralo a un recipiente de plástico con tampón de lavado [50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 10 mM CaCl₂, 2.5% (v/v) Triton X-100]. Prepare el tampón de lavado el día de la zimografía de gelatina.
      NOTA: Como Triton X-100 es muy viscoso, pipetelo de acuerdo con las reglas para pipetear líquidos viscosos para agregar el mismo volumen de Triton X-100 cada vez que se prepare el tampón³⁷.
   2. Incube el gel dos veces en el tampón de lavado, cada vez durante 30 minutos con una agitación suave para eliminar el SDS del gel y reemplazarlo con Triton X-100.
   3. Transfiera el gel a un tanque de plástico que contenga tampón de incubación (50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 10 mM CaCl₂).
      NOTA: Para el almacenamiento a largo plazo, mantenga el tampón de incubación a 4 °C. Prepare un tampón fresco si hay signos de contaminación microbiana o precipitación.
   4. Incubar el gel en el tampón de incubación durante 12-20 h (en este caso 16 h) a 37 °C.
      NOTA: El espesor del gel y la cantidad de proteína cargada influyen en el período de incubación en el tampón de incubación, que debe optimizarse para obtener las áreas de gelatina bien digerida en el gel.
2. Tinción y decoloración en gel
   1. Prepare la solución de tinción que contenga una solución acuosa de 0,5% (p/v) de Coomassie Brilliant Blue R-250, 30% (v/v) de etanol y 10% (v/v) de ácido acético.
      NOTA: ¡ATENCIÓN! Trabaje debajo de la campana extractora y use guantes cuando use ácido acético. Disuelva la cantidad pesada de Coomassie Blue en agua, agregue etanol y mezcle la solución. Al final, agregue lentamente ácido acético a la solución de etanol y agua para evitar una reacción exotérmica.
   2. Prepare la solución decolorante que contenga 30% (v/v) de etanol y 10% (v/v) de la solución acética en_H2O.
      NOTA: Mezcle etanol con_H2O. Agregue ácido acético lentamente a la solución de etanol-agua al final para evitar una reacción exotérmica.
   3. Transfiera el gel a un recipiente de plástico con la solución Coomassie Brilliant Blue y tiña el gel durante 30 minutos a temperatura ambiente con una agitación suave.
      NOTA: FastGene Q-Stain también se puede utilizar para teñir el gel. La ventaja de este tinte es que está listo para usar y que el gel manchado no requiere ningún paso de decoloración.
   4. Incubar el gel en el tampón decolorante a temperatura ambiente con una agitación suave para eliminar la tinción. Continúe la decoloración hasta que se vean bandas claras que representan la actividad de la gelatinasa.
      NOTA: Si la tinción con la solución de Coomassie Brilliant Blue es muy intensa, cambie el tampón decolorante varias veces durante la incubación.
   5. Mantén el gel hidratado y no permitas que se seque hasta su visualización.
      NOTA: Reemplace el tampón de decoloración con agua para ralentizar el proceso de decoloración hasta la visualización.

6. Visualización de proteínas en geles de poliacrilamida

NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre el sistema de imágenes y el software utilizado para visualizar proteínas en geles de poliacrilamida (Figura 2A-C). También se pueden utilizar otros sistemas de visualización en gel fácilmente disponibles (como iBright Imaging Systems, UVP PhotoDoc-It Imaging System, E-Gel Imager y Azure Imagers) para este propósito.

1. Encienda el equipo de imágenes y abra el software.
2. Haga clic en Archivo | Nuevo proyecto para abrir un nuevo proyecto.
3. Elija el tipo de aplicación haciendo clic en Seleccionar... | Geles de proteínas | Coomassie azul.
4. Transfiera los geles, uno por uno, al sistema de imágenes y verifique la posición del gel con el botón Position Gel.
5. Visualice el gel haciendo clic en Ejecutar protocolo.
6. Guarde la imagen como .scn para permitir un análisis posterior utilizando el software al que se hace referencia.
7. Además, exporte el archivo como .tif haciendo clic en Archivo | Exportación | Exportar para análisis, que será útil para el análisis utilizando ImageJ (PUNTO DE PARADA 5).

7. Análisis de datos

1. Análisis de gel mediante el software de imágenes
   1. Abra el software de imágenes y las imágenes del zimograma y el gel que representan el contenido total de proteínas.
   2. Invierta la imagen para obtener bandas negras sobre un fondo blanco. En Ir a la configuración de transformación de imagen, haga clic en la pantalla Invertir imagen.
   3. Seleccione líneas y bandas en el zimograma que representan MMP-2 y MMP-9 de forma manual o automática utilizando la caja de herramientas de análisis | Sección de Carriles y Bandas. Cree una banda por línea y ajuste su tamaño para incluir toda el área de la línea para la determinación del contenido total de proteínas en el gel que representa el contenido total de proteínas.
   4. Ajuste las líneas y bandas utilizando las herramientas disponibles en la sección Carril y banda (Figura 2A'-C').
   5. Vaya a la Tabla de Análisis y copie el Volumen (intensidad) y el peso molecular de cada carril y banda (Figura 2A"-C").
   6. Divida el volumen de cada carril por el volumen del carril de control seleccionado (aquí A375) para comparar el contenido total de proteínas entre carriles (Figura 2A).
   7. Divida el volumen de cada banda por el valor del carril correspondiente (del paso 7.6) para normalizar el volumen de la actividad de MMP al contenido total de proteínas (Figura 2B, C).
   8. Para comparar la actividad de las gelatinasas entre líneas, divida el volumen normalizado de la línea estudiada/condición estudiada por el volumen normalizado de la línea de control/condición estándar (aquí A375) (Figura 2B, C").
2. Análisis de gel alternativo con el software ImageJ
   1. Abra el software ImageJ y abra la imagen de gel invertido (bandas negras sobre fondo blanco).
   2. Delinea el primer carril con bandas digeridas en gelatina con la herramienta de rectángulo .
   3. Elija Analizar | Geles | Seleccione Primer carril en la barra de herramientas de ImageJ para seleccionar y marcar el primer carril.
   4. Transfiera la primera selección delineada (rectángulo amarillo) al siguiente carril y haga clic en Analizar | Geles | Seleccione Siguiente carril para seleccionar y marcar el siguiente carril.
   5. Seleccione todos los carriles presentados en el gel de la misma manera (Figura 3A-C).
   6. Vaya a Seleccionar Analizar | Geles | Trazar carriles para hacer los trazados de perfil de carril (Figura 3A'-C').
   7. Con la herramienta Recta , separe las bandas con líneas verticales en los bordes de cada pico y luego dibuje líneas horizontales para "cerrar" su área (Figura 3A'-C'; líneas amarillas).
   8. Mida el tamaño de cada pico con la herramienta Seguimiento . Haga clic en el área de cada pico para seleccionarlo y espere a que los picos se delineen en amarillo.
   9. Busque el tamaño de cada pico seleccionado en la tabla de resultados (Figura 3A"-C").
   10. Normaize los datos hasta el contenido total de proteína, tal como se describe en el paso 7.1.
   11. Divida el "área" de la línea/condición estudiada por el "área" de la línea de control/condición estándar (Figura 3A"-C").
3. Presentación de datos
   1. Mostrar los resultados obtenidos con el software de imagen como la actividad de MMP normalizada al contenido total de proteínas y la línea de control (Figura 4A,B).
   2. Presentar los resultados obtenidos con ImageJ como la actividad de MMP normalizada al contenido total de proteína y línea de control (Figura 4C,D).

En este protocolo, describimos el procedimiento para la zimografía en gelatina (Figura 1) utilizando medios obtenidos de cinco líneas celulares de melanoma (A375, SK-MEL-28, Hs-294T, WM9, WM1341D) como muestras. El enfoque de zimografía que se muestra aquí incluye dos electroforesis SDS-PAGE separadas. Una electroforesis SDS-PAGE da como resultado el gel teñido con azul de Coomassie, que representa el contenido total de proteínas cargado en cada línea...

A pesar del protocolo "paso a paso" elaborado aquí, la zimografía en gelatina requiere optimización en función de las muestras/líneas celulares que se analizan. Diferentes tipos de células y líneas celulares (aquí se muestran líneas celulares de melanoma) pueden secretar ambas formas (pro- y activas) de MMP-2 y MMP-9, pero con diferente actividad de gelatinasa. La optimización del procedimiento incluye principalmente la duración de la inanición celular, el grosor del gel de p...

Los autores declaran no tener intereses financieros contrapuestos.

Este trabajo fue apoyado por el Centro Nacional para la Ciencia, Polonia (proyecto #2016/22/E/NZ3/00654, otorgado a AJM).