흑색종 세포에서 젤라티나아제 활성을 감지하기 위한 젤라틴 자이모그래피(Gelatin Zymography)

금속단백질분해효소(MMP)는 악성 흑색종을 포함한 많은 세포에서 분비됩니다. MMP에 의한 세포외 기질 성분의 절단은 이러한 세포의 침습 가능성을 증가시킵니다. 여기에 제시된 젤라틴 자이모그래피는 폴리아크릴아미드 겔에서 소화된 젤라틴 영역으로 나타나는 젤라티나아제 활성을 연구하기 위한 정량화 방법입니다.

매우 침습적인 특성을 가진 흑색종 세포는 종양 세포에 의해 형성되고 주변 세포외 기질(ECM)의 소화를 담당하는 구조인 침습성(invadopodia)의 형성을 나타냅니다. ECM 단백질을 가수분해하기 위해 세포에서 여러 금속프로테아제(MMP)를 분비합니다. 그들은 주로 invadopodia로 알려진 구조를 통해 분비됩니다. ECM 분해는 혈관으로 향하는 세포가 조밀한 조직을 느슨하게 해야 하기 때문에 전이를 형성하는 동안 종양 세포에 매우 중요합니다.

흑색종 세포에 의해 분비되는 메탈로프로테아제의 한 그룹은 젤라티나제, 즉 메탈로프로테아제 2 및 9를 포함합니다. 젤라티나아제는 젤라틴(변성 콜라겐), 몇 가지 유형의 콜라겐(IV형 포함) 및 피브로넥틴을 분해하며, 이는 ECM의 모든 구조적 구성 요소입니다. 이 논문은 흑색종 세포의 젤라티나제 활성을 분석하기 위한 젤라틴 자이모그래피 분석법을 설명합니다. 이 접근법은 폴리아크릴아미드 겔에 첨가된 기질(젤라틴)의 소화 정도 분석을 기반으로 합니다. 단순성, 감도, 저비용, 밀도 측정에 의한 반정량 분석, 활성 및 비활성 형태의 MMP 검출과 같은 여러 가지 장점으로 인해 이 분석은 가치 있고 널리 사용됩니다.

이 프로토콜은 온전한 부유 세포, 세포 파편 및 세포사멸체가 없는 배지를 농축하는 방법을 설명합니다. 다음으로, 젤라틴을 첨가한 폴리아크릴아미드 겔 제조, 도데실설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 수행, SDS 제거, 겔 염색을 수행하여 흑색종 세포에서 분비되는 젤라티나제의 활성에 해당하는 젤라틴이 없는 밴드를 검출하는 데 중점을 둡니다. 마지막으로, 이 논문은 이 분석의 데이터를 정량적으로 분석하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 형광 젤라틴 분해 분석법, 웨스턴 블롯 또는 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)에 대한 흑색종 세포의 젤라티나아제 활성을 추정하기 위한 좋은 대안입니다.

매트릭스 금속단백분해효소(MMP)는 성장 인자, 세포 수용체, 단백질 분해 효소 및 그 억제제와 같은 다양한 ECM 단백질과 비ECM 단백질을 절단하는 Zn²⁺ 함유 엔도펩티다아제의 계열입니다 1,2,3,4. MMP의 ECM 기질 특이성은 펩타이드 도메인과 모티프, 염기서열의 유사성에 따라 달라지며, 따라서 하위 그룹을 정의합니다. 예를 들어, 다양한 유형의 콜라겐을 소화하는 콜라겐 분해 효소와 젤라틴 및 아그레칸이 있습니다. 젤라틴과 콜라겐을 절단하는 젤라티나제; 다양한 ECM 단백질을 소화하는 모트리리신 또는 MT-MMP⁵.

본 논문은 MMP-2와 MMP-9의 두 가지 젤라티나제에 초점을 맞추고 있는데, 이는 변성 콜라겐(젤라틴)을 단백질 분해 방식으로 소화할 수 있기 때문에 젤라틴 자이모그래피 분석을 사용하여 그 활성을 검출할 수 있기 때문입니다 ^3,6. MMP-2와 MMP-9는 구조적으로 매우 유사하지만 동일한 기질 특이성⁷을 갖지는 않습니다. MMP의 C-말단 헤모펙신 유사 도메인은 기질 염기서열⁸을 인식하는 역할을 합니다. 촉매 영역의 약간의 차이는 MMP-2와 MMP-9의 기질 선택성의 차이에 대한 원인이며, 예를 들어 MMP-2는 MMP-9와 달리 네이티브 I 유형 콜라겐⁹를 절단할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 그들의 단백질 분해 활성은 둘 다 젤라틴 ^3,6을 절단할 수 있기 때문에 젤라틴 zymography로 의심할 여지 없이 결정될 수 있습니다.

MMP는 이미 생리학적 및 병리학적 상태 모두에 관여하는 것으로 알려져 있습니다. 이들은 세포 이동, 침입, 확산 및 부착에 영향을 미쳐 혈관 신생, 염증, 종양 진행 및 전이를 손상시키는 것으로 밝혀졌습니다^{10 , 11 , 12 , 13}. 이들은 다양한 중요한 과정에 참여하기 때문에 높은 치료 또는 진단 잠재력으로 인해 광범위하게 연구된다 14,15,16. MMP-2(젤라티나아제 A)는 72kDa 프로엔자임으로 발생하며, 이 프로도메인은 촉매 부위에서 Zn²⁺와 결합하여 효소 활성을 억제합니다⁹. MMP-2는 MMP-14 (MT1-MMP), 트롬빈 및 활성화 단백질 C ^17,18,19,20에 의한 zymogen의 prodomain 절단을 통해 활성화될 수 있습니다. 따라서 활성 MMP-2의 질량은 더 낮습니다(~64kDa). 대조적으로, MMP-9(젤라티나아제 B)는 ~92 kDa 전구효소로 발현되며 N-말단 도메인의 절단에 의해 활성화되어 83 kDa 단백질을 얻습니다. MMP-9 성숙은 세린 프로테아제(serine protease) 및 기타 MMP에 의한 프로도메인 절단과 산화 스트레스에 대한 반응으로 발생합니다²¹.

흑색종의 진행과 악성 종양은 ECM을 소화하는 종양 세포의 능력에 크게 의존하는데, 이는 ECM이 세포의 진행과 전이 형성을 제한하는 "장벽"이기 때문이다²². 세포는 먼저 기저막(BM)을 관통하여 진피로 들어가 혈관 쪽으로 이동하고 혈관 내피에 부착되어 혈액에 도달해야 합니다. 젤라티나아제 발현은 다른 암에서 증가했으며, 환자의 침입 및 이동 증가 및 예후 악화와 상관관계가 있는 것으로 나타났다^23,24. MMP-2는 흑색종 세포에서 높게 발현되었으며, 활성화 상태는 진행과 상관관계가 있었습니다^25,26. MMP-9는 또한 인간 피부 종양과 흑색종 세포주에 축적되는 것으로 밝혀졌습니다 ^27,28.

MMP의 특성과 흑색종 세포의 침습성 사이의 상관관계가 높기 때문에 MMP의 존재와 활성을 결정하기 위한 간단하고 민감하며 저렴한 기능적 분석법의 가용성은 흑색종의 생물학을 더 잘 이해하고 흑색종 검출을 위한 새로운 진단 기술을 설계하는 데 매우 중요합니다. 이 논문에서는 젤라틴 zymography 기법을 자세히 설명하고 있으며, 이 기술에 가장 적합한 후보로 간주될 수 있습니다. 이 접근법은 젤라틴^29,30의 첨가로 제조된 폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 변성 그러나 환원 조건 하에서 SDS-전기영동을 기반으로 합니다. MMP-2 및 MMP-9를 포함한 단백질은 전기영동 중 SDS의 존재 하에서 변성되지만, Triton X-100을 함유한 완충액에서 세척하면 SDS:Triton X-100 교환³¹의 결과로 재생이 발생합니다.

이러한 재특성화된 MMP는 배양 완충액에서 겔 배양 중에 젤라틴을 소화하며, 이는 최종적으로 Coomassie Blue-stained gel⁵에서 투명한 zymolytic band로 관찰될 수 있습니다. MMP의 젤라티놀 용해 활성에 해당하는 투명 띠로 표시되는 분해된 젤라틴의 양과 면적은 일반적으로 사용되는 애플리케이션과 오픈 소스 애플리케이션인 ImageLab 및 ImageJ^29,32를 사용하여 결정할 수 있습니다. 이 방법에는 많은 장점이 있지만 논의에서 언급한 몇 가지 제한 사항도 있습니다. 서로 다른 흑색종 세포주에 대해 수행된 메모와 주석이 포함된 이 "단계별" 프로토콜은 재현성과 최적화가 대표적인 결과를 얻기에 충분해야 합니다. 그림 1은 설명된 절차의 단계를 보여줍니다.

1. 세포 배양 배지 수집 및 농축

1. 흑색종 세포(여기서는 A375, SK-MEL-28, Hs 294T, WM9, WM1341D 세포주)를 완전한 배지[NaHCO₃의 농도가 감소된 Dulbecco의 변형된 독수리 중간 고농도 포도당(1.5g/L), 10%(v/v) 소 태아 혈청(FBS), 1%(v/v) L-글루타민 및 1%(v/v) 항생제-항진균제]에서 75cm² 플라스크에 파종합니다.
2. 표준 조건(5% CO₂, 37 °C)에서 세포를 배양합니다.
3. 세포가 80-90 % confluence에 도달 한 후, 상층액을 흡입 및 폐기하고 무혈청 배지 또는 37 ° C로 예열 된 PBS로 플라스크를 3 회 세척하여 배양 플라스크의 잔류 배지를 제거한다.
   참고: 무혈청 배지를 추가하기 전에 상등액(완전한 배지)을 완전히 제거해야 합니다. FBS에는 다양한 MMP가 포함되어 있어 거짓 양성 결과와 잘못된 데이터 분석 및 해석으로 이어질 수 있습니다²⁹.
4. 10mL의 따뜻한 무혈청 배지를 추가하고 48-72시간 동안 5% CO₂ 의 가습 분위기에서 37°C에서 세포를 배양합니다.
   참고: 무혈청 배지에서의 세포 배양 기간은 세포 생존율과 분비되는 단백질의 양에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 세포주의 유형에 따라 zymography를 수행하기 전에 세포 결핍 기간을 최적화해야 합니다. 비결은 세포가 가장 생존력이 높은 시점을 선택하고 가장 많은 MMP를 분비하는 것입니다. 여기에 사용된 모든 흑색종 세포주는 생존력에 영향을 주지 않고 48시간 동안 무혈청 배지에서 배양되었습니다. 세포의 상태는 위상차 현미경을 사용하여 검증되었지만, XTT 또는 MTT 세포 생존율 분석을 수행할 수 있습니다.
5. 48-72시간 후에 세포 배양에서 배지를 수집하여 15mL 튜브로 옮깁니다. 단백질 분해를 방지하기 위해 매체를 얼음 위에 계속 보관하십시오.
6. 매체를 7,000 × g 에서 4 °C에서 20분 동안 원심분리합니다³³.
   참고: 원심분리는 활성 MMP의 원인이 될 수 있으므로 부유 온전한 세포, 세포 파편 및 세포사멸체를 제거하는 데 중요합니다. 이 단계를 건너뛰면 위양성 결과와 잘못된 데이터 분석 및 해석이 발생할 수 있습니다. 선택적으로, 배지는 0.22μm 필터를 통해 필터링되어 세포사멸체, 큰 미세소포체 및 세포 파편을 제거할 수 있습니다³⁴. 세포의 동결 및 해동으로 인해 세포가 손상되어 세포 내 구성 요소가 방출될 수 있으므로 보관을 위해 -20 °C로 옮기기 전에 배지를 원심분리하는 것이 중요합니다³⁵.
7. 추가 분석 전에 필요한 경우 매체를 -20°C에서 보관하십시오(STOP POINT 1).
8. 유체를 얼음 위에서 해동하고 농축하여 제조업체의 권장 사항에 따라 10kDa 컷오프( 재료 표 참조)가 있는 초원심 필터 장치를 사용하여 원하는 최종 농축량을 달성합니다.
   참고: 여기서, 얻어진 농도 계수는 약 20배였습니다. 검출된 MMP의 분자량은 43-215kDa이므로 NMWL(Nominal Molecular Weight Limit)이 10kDa인 초원심 필터 장치를 사용하는 것이 좋습니다. 더 높은 NMWL(30kDa)을 사용하면 분자량이 더 낮은 MMP 분자(예: 43kDa 콜라겐분해효소 MMP-1)가 손실될 수 있습니다.
9. 농축 매체를 즉시 -80°C로 옮기고 -80°C(정지점 2)에서 보관합니다.
   참고: 신선하거나 해동된 샘플은 단백질 분해를 방지하기 위해 프로토콜의 다음 단계에서 얼음 위에 보관해야 합니다.
10. 예를 들어 제조업체의 권장 사항에 따라 Bradford 또는 BCA 방법을 사용하여 수집 및 농축된 매체의 단백질 농도를 측정합니다(STOP POINT 3).

2. 젤라틴 zymography를 위한 젤라틴 (1 mg/mL)를 가진 젤을 분리하고 겹쳐 쌓이는 SDS-PAGE의 준비

1. 짧은 플레이트가 있는 스페이서 플레이트를 주조 프레임에 배치하여 카세트를 형성하고 프레임을 주조 스탠드에 놓습니다.
   알림: 0.75-1.5mm 통합 스페이서가 있는 스페이서 플레이트를 사용할 수 있습니다(여기서는 1mm). 작업 표면이 안정적이고 완벽하게 수평을 이루고 있는지 확인하십시오.
2. 적당량의 젤라틴을 계량하여 2.65mg/mL의 젤라틴을 준비하고 용액을 65°C로 가열하여 초순수 또는 멸균 탈이온화 H_2O에 용해시킵니다. 0.22μm 주사기 필터를 사용하여 용액을 살균합니다. 분리 젤을 준비하기 전에 젤라틴 용액을 실온으로 식히십시오.
   참고: 젤라틴 용액은 4°C에서 1주일 동안 보관할 수 있습니다. 장기간 보관하면 박테리아 오염과 박테리아에서 분비되는 단백질 분해 효소의 존재가 발생할 수 있습니다³⁶.
3. 10 mL의 2.65 mg / mL 젤라틴, 3.3 mL의 30 % 아크릴 아미드 / 비스 아크릴 아미드, 2.5 mL의 1.5 M Tris-HCl (pH 8.8), 48 μL의 10 % SDS, 80 μL의 50 % 글리세롤, 70 μL의 H₂O, 48 μL의 10 % APS 및 4.8 μL의 TEMED를 혼합하여 폴리 아크릴아미드 겔 10mL를 준비합니다.
   알림: 주의! 아크릴아미드/비스-아크릴아미드를 취급할 때는 장갑과 고글을 착용하십시오. 겔 준비의 마지막에 APS (활성화제)와 TEMED (겔 중합 촉매)를 첨가해야하며, 그 후에는 빠르고 효율적으로 작업하는 것이 중요합니다. 주의! TEMED는 흄 후드 아래에 추가해야 합니다. 이러한 부피의 분리 겔은 언급된 전기영동 장치에 적합한 1mm 스페이서를 갖는 2개의 분리 겔을 제조하기에 충분합니다( 재료 표 참조). 젤의 더 낮은 퍼센트가 필요한 경우, 젤에서 아크릴아미드의 원하는 퍼센트를 얻기 위해 구성 요소의 부피를 다시 계산하십시오.
4. 기포 대형을 피하는 반전 6 8 시간에 의하여 10% 분리 젤 해결책을 섞고, 짧은 판의 고도의 75%까지 젤 카세트 샌드위치 (단계 2.1)로 해결책을 따르는 것.
   참고: 겔의 두께, 로드된 단백질의 양 및 배양 완충액의 배양 시간(조성은 5.1.3 단계 참조)을 최적화하여 개별 MMP에 대해 완전히 소화된 젤라틴 띠가 분리된 겔 영역을 얻어야 합니다. 궁극적으로 이는 주어진 세포 유형에 의해 분비되는 MMP의 양에 따라 달라집니다.
5. 젤 상단을 70% 에탄올로 겹겹이 쌓습니다.
   참고: 기포를 제거하고 젤이 건조되어 중합에 적합하지 않은 공기와 접촉하는 것을 방지하는 것이 중요합니다.
6. 젤을 실온에서 약 30분 동안 그대로 두십시오. 중합이 완료되고 겔 혼합물과 에탄올 층 사이에 명확한 분리선이 보이면 에탄올 층을 조심스럽게 제거합니다.
7. H₄O 3.05 mL, 30 % 아크릴 아미드 / 비스 아크릴 아미드 0.67 mL, 0.5 M Tris-HCl (pH 6.8) 1.25 mL, 10 % SDS 50 μL, 10 % APS 50 μL 및 TEMED 5 μL를 혼합하여 4 % 스태킹 겔 (5 mL)을 준비합니다. 4% 스태킹 겔 용액을 6-8회 반전으로 혼합합니다.
   참고: 이 부피는 1mm 스페이서로 두 개의 스태킹 젤을 준비하기에 충분합니다.
8. 즉시 젤 샌드위치 카세트 상단에 빗을 삽입하고 스태킹 젤 용액으로 채웁니다.
9. 스태킹 겔을 실온에서 약 30분 동안 배양하여 완전히 중합되도록 합니다.
10. 젤을 촉촉한 종이 타월로 싸서 비닐 봉지에 넣고 젤을 4°C에서 최소 하룻밤 동안 유지하지만 1주일을 넘지 않도록 합니다.
11. 젤 샌드위치 카세트를 전극 어셈블리에 로드하고 탱크로 옮긴 다음 SDS-PAGE 전기영동을 실행하기 전에 1x SDS-PAGE 버퍼[250mM Tris-HCl, 1.92M 글리신, 1%(w/v) SDS]로 채웁니다.
    참고: SDS-PAGE 버퍼는 장기간 4°C에서 보관할 수 있습니다.
12. 젤에서 빗을 제거합니다.

3. 총 단백질 함량 측정을 위한 젤 분리 및 스태킹 SDS-PAGE의 준비

참고: 섹션 3의 단계는 젤라틴 자이모그래피를 위한 겔 준비를 설명하는 섹션 2의 단계와 유사합니다. 젤의 구성이 다르다는 점에 유의하십시오. 총 단백질 함량 측정을 위한 젤에는 젤라틴이 포함되어서는 안 되며, Coomassie Brilliant Blue 용액에 의해 염색됩니다.

1. 3.34 mL의 30 % 아크릴 아미드 / 비스 아크릴 아미드, 2.5 mL의 1.5 M Tris-HCl (pH 8.8), 100 μL의 10 % SDS, 3.99 mL의 H₂O, 50 μL의 10 % APS 및 20 μL의 TEMED를 혼합하여 10 mL의 10 % 분리 겔을 준비합니다.
2. 기포 형성을 피하고 반전으로 용액을 혼합하고 용액을 짧은 플레이트 높이의 최대 75%까지 젤 카세트 샌드위치로 이동합니다.
3. 젤 상단을 에탄올로 겹겹이 쌓고 실온에서 약 30분 동안 젤을 그대로 둡니다. 에탄올을 제거하십시오.
4. 5 μL의 30 % 아크릴 아미드 / 비스 - 아크릴 아미드, 1.25 mL의 1.5 M Tris-HCl (pH 8.8), 50 μL의 10 % SDS, 2.99 mL의 H₂O, 25 μL의 10 % APS 및 12.5 μL의 TEMED를 혼합하여 4 % 스태킹 겔 12.5 mL를 준비합니다.
5. 젤 샌드위치 카세트 위에 빗을 놓고 스태킹 젤 용액으로 채웁니다.
6. 젤을 실온에서 약 30분 동안 그대로 두십시오.
   참고: 겔은 SDS-PAGE 전기영동 직전에 준비하거나 4°C에서 며칠 동안 보관할 수 있습니다. 젤 보관을 위해 젤을 젖은 종이 타월로 싸서 비닐 봉지에 넣어 촉촉하게 유지하십시오.
7. 젤이 있는 카세트를 탱크에 넣고 젤 샌드위치 카세트를 전극 어셈블리에 로드하고 SDS-PAGE 전기영동을 실행하기 전에 1x SDS-PAGE 버퍼[250mM Tris-HCl, 1.92M 글리신, 1%(w/v) SDS]가 있는 탱크로 어셈블리를 옮깁니다.
8. 젤에서 빗을 제거합니다.

4. 표본 선적과 전기 이동법 달리기

1. 배지의 단백질 예상 농도를 기반으로 3-20μg(여기서는 10μg)의 농축 배지와 2x 환원 로딩 버퍼[10mM Tris pH 6.8, 1%(w/v) SDS, 10%(v/v) 글리세롤, 0.03%(w/v) 브로모페놀 블루]의 1:1 비율을 혼합하여 zymography를 위해 각 SDS-PAGE 샘플을 준비합니다.
   알림: 로딩 버퍼는 4°C에서 보관해야 합니다. β-메르캅토에탄올과 디티오트레이톨(DTT)은 시스테인 잔기 사이의 이황화 결합을 파괴하는 능력으로 인해 권장되지 않으며, 이로 인해 전기영동 후 MMP가 다시 접히지 않습니다.
2. 4x 환원 완충액[40%(v/v) 글리세롤, 240mM Tris(pH 6.8), 8%(w/v) SDS, 0.04%(w/v) 브로모페놀 블루, 5%(v/v) β-메르캅토에탄올]와 1:3 비율로 샘플을 혼합하여 총 단백질 함량 측정을 위해 겔을 준비합니다.
   알림: 주의! 장갑과 고글을 착용하고 흄 후드 아래에서 작업하십시오. 로딩 버퍼는 -20 °C에서 보관해야 합니다. 동일한 양의 단백질을 각 레인에 로드해야 합니다. 필요한 경우 -80 °C에서 며칠 동안 샘플을 선택적으로 보관할 수 있습니다(STOP POINT 4).
3. 전기영동을 실행하기 전에 37°C에서 20분 동안 젤라틴 자이모그래피를 위한 샘플을 배양합니다.
   알림: s를 가열하지 마십시오.amp37°C보다 높은 온도에서. 단백질의 열변성은 프로테아제 활성의 불활성화를 초래하거나 효소의 재접힘을 방해하여 위음성 결과와 잘못된 데이터 해석을 유발할 수 있습니다³¹.
4. 총 단백질 함량 측정을 위해 95°C에서 10분 동안 샘플을 배양합니다.
5. 작은 테이블 원심 분리기에서 몇 초 동안 샘플을 회전시키고 젤의 웰에 로드합니다.
6. 선택적으로 분자량 ladder와 음성(95°C에서 10분 동안 끓인 샘플) 및 양성 대조군 샘플(예: 재조합 MMP-2 및 MMP-9 또는 MMP-2 및 MMP-9³⁶을 분비하는 것으로 알려진 세포주)을 웰에 로드합니다.
7. 염료가 겔 밖으로 흘러나올 때까지 얼음 위에 두면서 전기영동을 실행하여 MMP-9 및 MMP-2 띠를 잘 분리합니다. 다음 SDS-PAGE 전기영동 조건을 사용하십시오: 처음에는 겔당 20mA, 샘플이 분리 겔에 들어갈 때 겔당 40mA로 전력을 증가시킵니다.
   알림: 최대 전류는 4개의 젤에 대해 130mA를 초과해서는 안 됩니다. 그렇지 않으면 전기영동 중에 겔이 과열됩니다. 전기영동은 얼음이 들어 있는 상자 또는 가능한 경우 냉장실(4°C)에서 수행할 수 있습니다.

5. polyacrylamide 젤의 활성화, 얼룩이 지고, 및 destaining

1. 젤 세척 및 활성화
   1. 쇼트 플레이트와 스페이서 플레이트 사이에서 자이모그래피 젤을 제거하고 세척 버퍼[50mM Tris pH 7.5, 150mM NaCl, 10mM CaCl₂, 2.5%(v/v) Triton X-100]가 있는 플라스틱 용기에 옮깁니다. 젤라틴 zymography 당일에 세척 완충액을 준비하십시오.
      참고: Triton X-100은 점성이 매우 높으므로 점성 액체를 피펫팅하는 규칙에 따라 버퍼를 준비할 때마다 동일한 부피의 Triton X-100을 첨가합니다³⁷.
   2. 세척 버퍼에 젤을 두 번 배양하고 매번 30분 동안 부드럽게 저어 젤에서 SDS를 제거하고 Triton X-100으로 교체합니다.
   3. 겔을 배양 완충액(50mM Tris pH 7.5, 150mM NaCl, 10mM CaCl₂)이 들어 있는 플라스틱 탱크로 옮깁니다.
      알림: 장기 보관을 위해 배양 버퍼를 4°C로 유지하십시오. 미생물 오염 또는 침전의 징후가 있는 경우 새 완충액을 준비합니다.
   4. 37°C에서 12-20시간(여기서는 16시간) 동안 배양 완충액에 겔을 배양합니다.
      참고: 겔의 두께와 로드된 단백질의 양은 배양 완충액의 배양 기간에 영향을 미치며, 이는 겔에서 잘 소화된 젤라틴 영역을 얻기 위해 최적화되어야 합니다.
2. 젤 염색 및 탈staining
   1. 0.5%(w/v) Coomassie Brilliant Blue R-250, 30%(v/v) 에탄올 및 10%(v/v)의 아세트산 수용액을 포함하는 염색 용액을 준비합니다.
      알림: 주의! 흄 후드 아래에서 작업하고 아세트산을 사용할 때는 장갑을 착용하십시오. 계량된 양의 Coomassie Blue를 물에 녹이고 에탄올을 넣고 용액을 섞습니다. 결국, 발열 반응을 피하기 위해 에탄올-물 용액에 아세트산을 천천히 첨가하십시오.
   2. _H2O에 에탄올 30%(v/v)와 아세트산 용액 10%(v/v)를 함유하는 탈염 용액을 준비합니다.
      참고 : 에탄올을 H₂O와 혼합하십시오.발열 반응을 피하기 위해 끝에 에탄올-물 용액에 아세트산을 천천히 첨가하십시오.
   3. 젤을 Coomassie Brilliant Blue 용액이 담긴 플라스틱 용기에 옮기고 실온에서 30분 동안 부드럽게 저어주면서 젤을 염색합니다.
      참고: FastGene Q-Stain은 겔 염색에도 사용할 수 있습니다. 이 염료의 장점은 바로 사용할 수 있고 염색된 젤에 염색 단계가 필요하지 않다는 것입니다.
   4. 탈염 완충액에 겔을 실온에서 부드럽게 교반하여 배양하여 탈색합니다. 젤라티나제 활성을 나타내는 투명한 띠가 보일 때까지 염색을 계속합니다.
      알림: Coomassie Brilliant Blue 용액으로 염색이 매우 강하면 배양 중에 탈염 버퍼를 몇 번 교체하십시오.
   5. 젤을 촉촉하게 유지하고 시각화될 때까지 건조되지 않도록 하십시오.
      참고: 탈염 버퍼를 물로 교체하여 시각화될 때까지 탈염 과정을 늦춥니다.

6. 폴리아크릴아미드 겔에서 단백질의 시각화

참고: 폴리아크릴아미드 겔에서 단백질을 시각화하는 데 사용되는 이미징 시스템 및 소프트웨어에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오(그림 2A-C). 쉽게 구할 수 있는 다른 겔 시각화 시스템(예: iBright 이미징 시스템, UVP PhotoDoc-It 이미징 시스템, E-Gel Imager 및 Azure Imagers)도 이러한 목적으로 사용할 수 있습니다.

1. 이미징 장비를 켜고 소프트웨어를 엽니다.
2. File(파일) | 새 프로젝트 - 새 프로젝트를 엽니다.
3. Select(선택)를 클릭하여 응용 프로그램 유형을 선택합니다 ... | 단백질 겔 | 쿠마시 블루.
4. 겔을 하나씩 이미징 시스템으로 옮기고 Position Gel 버튼을 사용하여 겔 위치를 확인합니다.
5. Run protocol을 클릭하여 겔을 시각화합니다.
6. 참조된 소프트웨어를 사용하여 추가 분석할 수 있도록 이미지를 .scn으로 저장합니다.
7. .tif또한 File(파일) | 내보내기 | 해석을 위해 내보내기: ImageJ(STOP POINT 5)를 사용한 해석에 유용합니다.

7. 데이터 분석

1. 이미징 소프트웨어를 사용한 겔 분석
   1. 이미징 소프트웨어와 zymogram의 이미지, 그리고 총 단백질 함량을 나타내는 겔을 엽니다.
   2. 이미지를 반전시켜 흰색 배경에 검은색 띠를 만듭니다. Go to the Image transform(이미지 변환 설정으로 이동)에서 Invert image display(이미지 표시 반전)를 클릭합니다.
   3. Analysis Tool Box를 사용하여 MMP-2 및 MMP-9를 나타내는 자이모그램에서 수동 또는 자동으로 선과 밴드를 선택합니다 . 레인 및 밴드 섹션. 라인당 하나의 밴드를 만들고 총 단백질 함량을 나타내는 겔의 총 단백질 함량 측정을 위한 전체 라인 영역을 포함하도록 크기를 조정합니다.
   4. Lane and Band 섹션에서 사용할 수 있는 도구를 사용하여 선과 밴드를 조정합니다(그림 2A'-C').
   5. Analysis Table(분석 표)로 이동하여 각 레인 및 밴드의 부피(강도)와 분자량을 복사합니다(그림 2A"-C").
   6. 선택한 control lane(여기서는 A375)의 Volume당 각 lane의 Volume을 나누어 lane 간의 총 단백질 함량을 비교합니다(그림 2A").
   7. 각 밴드의 부피를 해당 레인의 값별로 나누고(7.6단계부터) MMP 활성의 부피를 총 단백질 함량으로 정규화합니다(그림 2B",C").
   8. 라인 간 젤라티나제의 활성을 비교하려면 제어 라인/표준 조건의 정규화된 볼륨(여기서는 A375)에 따라 연구된 라인/연구된 조건의 정규화된 부피를 나눕니다(그림 2B",C").
2. ImageJ 소프트웨어를 사용한 대체 겔 분석
   1. ImageJ 소프트웨어를 열고 반전된 젤 이미지(흰색 배경에 검은색 띠)를 엽니다.
   2. 사각형 도구를 사용하여 젤라틴으로 소화된 밴드로 첫 번째 줄의 윤곽을 그립니다.
   3. Analyze(분석) | 젤 | ImageJ 도구 모음에서 첫 번째 차선을 선택하여 첫 번째 차선을 선택하고 표시합니다.
   4. 첫 번째 윤곽선 선택 항목(노란색 사각형)을 다음 레인으로 전송하고 Analyze(분석) | 젤 | 다음 차선을 선택하여 다음 차선을 선택하고 표시합니다.
   5. 동일한 방식으로 겔에 표시된 모든 lane을 선택합니다(그림 3A-C).
   6. Analyze(분석) | 젤 | 차선을 플롯하여 차선 프로파일을 플롯합니다(그림 3A'-C').
   7. Straight 도구를 사용하여 각 피크의 가장자리에서 수직선으로 밴드를 분리한 다음 수평선을 그려 해당 영역을 "닫음"합니다(그림 3A'-C', 노란색 선).
   8. 추적 도구를 사용하여 각 피크의 크기를 측정합니다. 각 피크의 영역을 클릭하여 선택하고 피크가 노란색 윤곽선으로 표시될 때까지 기다립니다.
   9. 결과 표에서 선택한 각 피크의 크기를 찾습니다(그림 3A"-C").
   10. 7.1단계에서 설명한 대로 데이터를 총 단백질 함량으로 정규화합니다.
   11. 연구된 라인/조건의 "영역"을 제어 라인/표준 조건의 "영역"으로 나눕니다(그림 3A"-C").
3. 데이터 프레젠테이션
   1. 이미징 소프트웨어로 얻은 결과를 총 단백질 함량 및 대조선으로 정규화된 MMP 활성으로 표시합니다(그림 4A, B).
   2. ImageJ로 얻은 결과를 총 단백질 함량 및 대조선으로 정규화된 MMP 활성으로 제시합니다(그림 4C, D).

이 프로토콜에서는 5개의 흑색종 세포주(A375, SK-MEL-28, Hs-294T, WM9, WM1341D)에서 얻은 배지를 샘플로 사용하여 젤라틴 자이모그래피(그림 1)를 수행하는 절차를 설명합니다. 여기에 표시된 자이모그래피 접근법에는 두 개의 별도 SDS-PAGE 전기영동이 포함됩니다. 하나의 SDS-PAGE 전기영동은 각 라인에 로드된 총 단백질 함량을 나타내는 Coomassie Blue-stained gel을...

여기에 자세히 설명된 "단계별" 프로토콜에도 불구하고 젤라틴 자이모그래피는 분석되는 샘플/세포주에 따라 최적화가 필요합니다. 서로 다른 세포 유형과 세포주(여기에 표시된 흑색종 세포주)는 MMP-2 및 MMP-9의 두 가지 형태(전능성 및 활성)를 모두 분비할 수 있지만 젤라티나아제 활성은 다릅니다. 절차의 최적화에는 주로 세포 결핍 기간, 폴리아크릴아미드 겔의 두께, ...

저자는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없다고 선언합니다.

이 작업은 폴란드 국립과학센터(National Center for Science)의 지원을 받았습니다(프로젝트 #2016/22/E/NZ3/00654, AJM에 부여).