Gelatine-Zymographie zum Nachweis der Gelatinase-Aktivität in Melanomzellen

Metalloproteasen (MMPs) werden von vielen Zellen sezerniert, einschließlich des malignen Melanoms. Die MMP-vermittelte Spaltung von extrazellulären Matrixkomponenten führt zu einem erhöhten invasiven Potenzial dieser Zellen. Die hier vorgestellte Gelatinezymographie ist eine quantifizierende Methode zur Untersuchung der Gelatinaseaktivität, die sich als verdauter Gelatinebereich auf einem Polyacrylamidgel manifestiert.

Melanomzellen, die hochinvasive Eigenschaften aufweisen, weisen die Bildung von Invadopodien auf – Strukturen, die von Tumorzellen gebildet werden und für die Verdauung der umgebenden extrazellulären Matrix (ECM) verantwortlich sind. Mehrere Metalloproteasen (MMPs) werden von Zellen sezerniert, um EZM-Proteine zu hydrolysieren. Sie werden hauptsächlich über Strukturen sezerniert, die als Invadopodien bekannt sind. Der Abbau der EZM ist für Tumorzellen bei der Bildung von Metastasen von entscheidender Bedeutung, da die Zellen, die zu den Blutgefäßen gelangen, dichtes Gewebe lockern müssen.

Eine Gruppe von Metalloproteasen, die von Melanomzellen sezerniert werden, umfasst die Gelatinasen, d.h. die Metalloproteasen 2 und 9. Gelatinasen spalten Gelatine (denaturiertes Kollagen), einige Arten von Kollagen (einschließlich Typ IV) und Fibronektin, alles strukturelle Bestandteile der EZM. In dieser Arbeit wird ein Gelatine-Zymographie-Assay zur Analyse der Gelatinaseaktivität von Melanomzellen beschrieben. Dieser Ansatz basiert auf der Analyse des Ausmaßes des Aufschlusses eines Substrats (Gelatine), das einem Polyacrylamidgel zugesetzt wird. Mehrere Vorteile, wie z. B. Einfachheit, Sensitivität, niedrige Kosten und semiquantitative Analyse durch Densitometrie sowie der Nachweis sowohl aktiver als auch inaktiver Formen von MMPs, machen diesen Assay wertvoll und weit verbreitet.

Dieses Protokoll beschreibt, wie das Medium ohne intakte schwimmende Zellen, Zelltrümmer und apoptotische Körper konzentriert wird. Als nächstes konzentriert es sich auf die Herstellung von Polyacrylamid-Gel mit Gelatinezusatz, die Durchführung einer Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE), die Entfernung von SDS und die Färbung des Gels, um gelatinefreie Banden zu erkennen, die der Aktivität von Gelatinasen entsprechen, die von Melanomzellen sezerniert werden. Schließlich wird beschrieben, wie die Daten aus diesem Assay quantitativ analysiert werden können. Diese Methode ist eine gute Alternative zur Abschätzung der Gelatinaseaktivität von Melanomzellen mit einem Fluoreszenz-Gelatineabbau-Assay, Western Blot oder Enzyme-Linked Immunosorbent Assays (ELISAs).

Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) sind eine Familie von Zn²⁺-haltigen Endopeptidasen, die verschiedene EZM-Proteine und Nicht-EZM-Proteine spalten, wie z. B. Wachstumsfaktoren, Zellrezeptoren, Proteinasen und deren Inhibitoren 1,2,3,4. Die Spezifität des EZM-Substrats von MMPs hängt von den Peptiddomänen und -motiven sowie von Ähnlichkeiten in ihren Sequenzen ab, wodurch ihre Untergruppen definiert werden. Es gibt zum Beispiel Kollagenasen, die verschiedene Arten von Kollagenen verdauen, sowie Gelatine und Aggrecan; Gelatinasen, die Gelatine und Kollagene spalten; und Matrilysine oder MT-MMPs, die verschiedene EZM-Proteine verdauen⁵.

Diese Arbeit konzentriert sich auf zwei Gelatinasen: MMP-2 und MMP-9, da sie denaturiertes Kollagen (Gelatine) proteolytisch verdauen können, was den Nachweis ihrer Aktivität mit einem Gelatine-Zymographie-Assay^{ermöglicht 3,6}. Obwohl MMP-2 und MMP-9 eine starke strukturelle Ähnlichkeit aufweisen, haben sie keine identische Substratspezifität⁷. Eine C-terminale Hämopexin-ähnliche Domäne von MMPs ist für die Erkennung der Substratsequenz⁸ verantwortlich. Geringfügige Unterschiede in ihren katalytischen Domänen sind für die Unterschiede in der Substratselektivität von MMP-2 und MMP-9 verantwortlich, z.B. kann MMP-2 im Gegensatz zu MMP-9 natives Kollagen^{vom Typ I} 9 spalten. Nichtsdestotrotz können ihre proteolytischen Aktivitäten mit der Gelatinezymographie zweifelsfrei bestimmt werden, da beide Gelatine^{spalten können 3,6}.

Es ist bereits bekannt, dass MMPs sowohl an physiologischen als auch an pathologischen Zuständen beteiligt sind. Es wurde festgestellt, dass sie die Zellmigration, Invasion, Ausbreitung und Adhäsion beeinflussen und somit die Angiogenese, Entzündung, Tumorprogression und Metastasierung beeinträchtigen 10,11,12,13. Da sie an verschiedenen wichtigen Prozessen beteiligt sind, werden sie aufgrund ihres hohen therapeutischen oder diagnostischen Potenzials eingehend untersucht 14,15,16. MMP-2 (Gelatinase A) tritt als 72 kDa-Proenzym auf, dessen Prodomäne Zn²⁺ an der katalytischen Stelle bindet, was zu einer Hemmung der enzymatischen Aktivität führt⁹. MMP-2 kann durch die Spaltung der Prodomäne seines Zymogens durch MMP-14 (MT1-MMP), Thrombin und das aktivierte Protein C 17,18,19,20 aktiviert werden. Daher ist die Masse des aktiven MMP-2 geringer (~64 kDa). Im Gegensatz dazu wird MMP-9 (Gelatinase B) als ~92 kDa-Proenzym exprimiert und durch die Spaltung der N-terminalen Domäne aktiviert, um das 83 kDa-Protein zu erhalten. Die MMP-9-Reifung resultiert aus einer Prodomänenspaltung durch Serinproteasen, andere MMPs und als Reaktion auf den oxidativen Stress²¹.

Das Fortschreiten und die Malignität des Melanoms hängen stark von der Fähigkeit der Tumorzellen ab, EZM zu verdauen, da es sich um eine "Barriere" handelt, die die Zellen an der Progression und Metastasenbildung hindert²². Zellen müssen zuerst die Basalmembran (BM) durchdringen, um in die Dermis einzudringen, zu den Blutgefäßen zu wandern, am Gefäßendothel zu haften und das Blut zu erreichen. Es wurde gezeigt, dass die Gelatinase-Expression bei verschiedenen Krebsarten erhöht war und mit einer erhöhten Invasion und Migration und einer schlechteren Prognose für die Patienten korrelierte^23,24. MMP-2 wurde in Melanomzellen stark exprimiert, wobei sein Aktivierungszustand mit der Progression korrelierte^25,26. Es wurde auch festgestellt, dass sich MMP-9 in menschlichen Hauttumoren und Melanomzelllinien anreichert^27,28.

Aufgrund der hohen Korrelation zwischen den Eigenschaften von MMPs und der Invasivität von Melanomzellen ist die Verfügbarkeit eines einfachen, sensitiven, kostengünstigen, funktionellen Assays zur Bestimmung ihres Vorhandenseins und ihrer Aktivität von entscheidender Bedeutung für ein besseres Verständnis der Biologie des Melanoms und die Entwicklung neuer diagnostischer Techniken für ihren Nachweis. In dieser Arbeit wird die Gelatine-Zymographie-Technik ausführlich beschrieben, da sie als der beste Kandidat für diesen Zweck angesehen werden kann. Dieser Ansatz basiert auf der SDS-Elektrophorese unter denaturierenden, aber nicht reduzierenden Bedingungen unter Verwendung von Polyacrylamidgelen, die unter Zusatz von Gelatine^29,30 hergestellt werden. Obwohl Proteine, einschließlich MMP-2 und MMP-9, in Gegenwart von SDS während der Elektrophorese denaturiert werden, führt das Waschen in Triton X-100 enthaltendem Puffer zu ihrer Renaturierung als Ergebnis eines SDS:Triton X-100-Austauschs³¹.

Diese renaturierten MMPs verdauen Gelatine während der Gelinkubation in einem Inkubationspuffer, die schließlich als klare zymolytische Banden in dem Coomassie Blue-gefärbten Gel⁵ beobachtet werden kann. Die Menge und die Fläche der aufgeschlossenen Gelatine, die als transparente Banden dargestellt werden, entsprechend der gelatinolytischen Aktivität von MMPs, können sowohl mit gängigen als auch mit Open-Source-Anwendungen – ImageLab und ImageJ^29,32 – bestimmt werden. Obwohl diese Methode viele Vorteile hat, weist sie auch einige Einschränkungen auf, die in der Diskussion erwähnt wurden. Dieses "Schritt für Schritt"-Protokoll mit Notizen und Kommentaren, die an den verschiedenen Melanomzelllinien durchgeführt werden, sollte für die Reproduzierbarkeit und Optimierung ausreichen, um repräsentative Ergebnisse zu erhalten. In Abbildung 1 sind die Schritte des beschriebenen Verfahrens dargestellt.

1. Entnahme und Konzentration von Zellkulturmedien

1. Aussaat der Melanomzellen (hier A375, SK-MEL-28, Hs 294T, WM9, WM1341D Zelllinien) in Gewebekulturen von^{75 cm 2} Kolben in vollständigem Medium [Dulbeccos modifizierte Eagle's mittelhohe Glukose mit reduzierter Konzentration (1,5 g/L) von NaHCO₃, ergänzt mit 10% (v/v) fötalem Rinderserum (FBS), 1% (v/v) L-Glutamin und 1% (v/v) Antibiotikum-Antimykotikum].
2. Kultivieren Sie die Zellen unter Standardbedingungen (5 % CO₂, 37 °C).
3. Nachdem die Zellen eine Konfluenz von 80-90 % erreicht haben, aspirieren und verwerfen Sie den Überstand und waschen Sie die Kolben 3 Mal mit serumfreiem Medium oder PBS, das auf 37 °C erwärmt ist, um das restliche Medium im Kulturkolben zu entfernen.
   HINWEIS: Der Überstand (vollständiges Medium) sollte vollständig entfernt werden, bevor das serumfreie Medium hinzugefügt wird. FBS enthält verschiedene MMPs, die zu falsch-positiven Ergebnissen und falscher Datenanalyse und -interpretation führen können²⁹.
4. Fügen Sie 10 mL warmes serumfreies Medium hinzu und inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO₂ für 48-72 h.
   HINWEIS: Die Dauer der Zellinkubation im serumfreien Medium kann die Lebensfähigkeit der Zellen sowie die Menge der sezernierten Proteine beeinflussen. Daher muss die Dauer des Zellhungers je nach Art der Zelllinie optimiert werden, bevor eine Zymographie durchgeführt wird. Der Trick besteht darin, zu wählen, wann die Zellen am lebensfähigsten sind und die höchste Menge an MMPs absondern. Alle hier verwendeten Melanomzelllinien wurden 48 Stunden lang in einem serumfreien Medium kultiviert, ohne die Lebensfähigkeit zu beeinträchtigen. Der Zustand der Zellen wurde mit einem Phasenkontrastmikroskop überprüft, obwohl ein XTT- oder MTT-Zellviabilitätsassay durchgeführt werden kann.
5. Sammeln Sie das Medium nach 48-72 h aus den Zellkulturen und überführen Sie es in 15 mL Röhrchen. Halten Sie das Medium ständig auf Eis, um einen Proteinabbau zu vermeiden.
6. Das Medium wird 20 min lang bei 7.000 × g bei 4 °C³³ zentrifugiert.
   HINWEIS: Die Zentrifugation ist entscheidend für die Entfernung von schwimmenden intakten Zellen, Zelltrümmern und apoptotischen Körpern, da diese Quellen für aktive MMPs sein können. Das Überspringen dieses Schritts kann zu falsch-positiven Ergebnissen und falscher Datenanalyse und -interpretation führen. Optional können Medien durch 0,22-μm-Filter gefiltert werden, um apoptotische Körper, große Mikrovesikel und Zelltrümmer^{zu entfernen 34}. Es ist wichtig, das Medium zu zentrifugieren, bevor es zur Lagerung auf -20 °C überführt wird, da das Einfrieren und Auftauen der Zellen zu deren Beschädigung führen kann, wodurch intrazelluläre Bestandteile freigesetzt werden³⁵.
7. Lagern Sie das Medium bei Bedarf bei -20 °C, bevor weitere Analysen durchgeführt werden (STOP POINT 1).
8. Tauen Sie die Medien auf Eis auf und konzentrieren Sie sie, um das gewünschte Endkonzentratvolumen mit ultrazentrifugalen Filtereinheiten mit einem Cutoff von 10 kDa (siehe Materialtabelle) gemäß der Empfehlung des Herstellers zu erreichen.
   HINWEIS: Hier betrug der erhaltene Konzentrationsfaktor etwa das 20-fache. Da das Molekulargewicht der detektierten MMPs 43-215 kDa beträgt, wird empfohlen, ultrazentrifugale Filtereinheiten mit einer nominalen Molekulargewichtsgrenze (NMWL) von 10 kDa zu verwenden. Die Verwendung eines höheren NMWL (30 kDa) kann dazu führen, dass MMP-Moleküle mit niedrigerem Molekulargewicht (z. B. 43 kDa Kollagenase MMP-1) verloren gehen.
9. Das konzentrierte Medium sofort auf -80 °C umfüllen und bei -80 °C lagern (STOPPPUNKT 2).
   HINWEIS: Frische oder aufgetaute Proben sollten während der nächsten Schritte des Protokolls auf Eis aufbewahrt werden, um einen Proteinabbau zu vermeiden.
10. Messen Sie die Konzentration von Proteinen in gesammelten und konzentrierten Medien, z. B. mit der Bradford- oder BCA-Methode, gemäß der Empfehlung des Herstellers (STOP POINT 3).

2. Herstellung von SDS-PAGE-Trenn- und Stapelgelen mit Gelatine (1 mg/ml) für die Gelatinezymographie

1. Legen Sie die Distanzplatte mit einer kurzen Platte in einen Gießrahmen, um eine Kassette zu bilden, und platzieren Sie den Rahmen auf dem Gießständer.
   HINWEIS: Es kann die Distanzplatte mit 0,75-1,5 mm integrierten Distanzstücken verwendet werden (hier 1 mm). Stellen Sie sicher, dass die Arbeitsfläche stabil und perfekt nivelliert ist.
2. Bereiten Sie 2,65 mg/ml Gelatine vor, indem Sie die entsprechende Menge Gelatine wiegen und in hochreinem oder sterilem deionisiertem H₂O auflösen, indem Sie die Lösung auf 65 °C erwärmen. Sterilisieren Sie die Lösung mit einem 0,22-μm-Spritzenfilter. Kühlen Sie die Gelatinelösung auf Raumtemperatur ab, bevor Sie das Trenngel zubereiten.
   HINWEIS: Die Gelatinelösung kann 1 Woche bei 4 °C gelagert werden. Eine langfristige Lagerung kann zu einer bakteriellen Kontamination und dem Vorhandensein von proteolytischen Enzymen führen, die von ihnen sezerniert werden³⁶.
3. Bereiten Sie 10 ml 10 % trennendes Polyacrylamidgel vor, indem Sie 3,95 ml 2,65 mg/ml Gelatine, 3,3 ml 30 % Acrylamid/Bis-Acrylamid, 2,5 ml 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8), 48 μl 10 % SDS, 80 μl 50 % Glycerin, 70 μl H₂O, 48 μl 10 % APS und 4,8 μl TEMED mischen.
   HINWEIS: VORSICHT! Tragen Sie Handschuhe und Schutzbrille, wenn Sie mit Acrylamid/Bis-Acrylamid umgehen. APS (ein Aktivator) und TEMED (Katalysator der Gelpolymerisation) müssen am Ende der Gelvorbereitung hinzugefügt werden, danach ist es wichtig, schnell und effizient zu arbeiten. VORSICHT! TEMED muss unter einem Abzug zugegeben werden. Dieses Volumen des Trenngels reicht aus, um zwei Trenngele mit einem 1 mm Abstandshalter herzustellen, der für die referenzierte Elektrophoresevorrichtung geeignet ist (siehe Materialtabelle). Wenn ein geringerer Prozentsatz des Gels erforderlich ist, berechnen Sie die Volumina der Komponenten neu, um den gewünschten Prozentsatz an Acrylamid im Gel zu erhalten.
4. Die 10%ige Trenngellösung durch Inversion sechs- bis achtmal mischen, um Luftblasenbildung zu vermeiden, und die Lösung bis zu 75 % der Höhe der kurzen Platte in das Gelkassettensandwich (Schritt 2.1) gießen.
   HINWEIS: Die Dicke des Gels, die Menge des geladenen Proteins und die Inkubationszeit im Inkubationspuffer (siehe Schritt 5.1.3 zur Zusammensetzung) sollten optimiert werden, um Bereiche des Gels zu erhalten, in denen die vollständig verdauten Gelatinebanden für einzelne MMPs getrennt sind. Letztendlich hängt dies von der Menge an MMPs ab, die von einem bestimmten Zelltyp sezerniert werden.
5. Schichten Sie die Oberseite des Gels mit 70% Ethanol auf.
   HINWEIS: Es ist wichtig, Blasen zu entfernen und zu verhindern, dass das Gel austrocknet und mit Luft in Kontakt kommt, die für die Polymerisation ungeeignet ist.
6. Lassen Sie das Gel ca. 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Wenn die Polymerisation abgeschlossen ist und eine klare Trennlinie zwischen der Gelmischung und der Ethanolschicht sichtbar ist, entfernen Sie die Ethanolschicht vorsichtig.
7. Bereiten Sie 4 % Stapelgel (5 ml) vor, indem Sie 3,05 ml H₂O, 0,67 ml 30 % Acrylamid/Bis-Acrylamid, 1,25 ml 0,5 M Tris-HCl (pH 6,8), 50 μl 10 % SDS, 50 μl 10 % APS und 5 μl TEMED mischen. Mischen Sie die 4%ige Stapelgellösung durch Inversion sechs- bis achtmal.
   HINWEIS: Dieses Volumen reicht aus, um zwei Stapelgele mit einem 1 mm Abstandshalter herzustellen.
8. Führen Sie sofort einen Kamm auf die Oberseite der Gel-Sandwich-Kassette ein und füllen Sie ihn mit der Stapelgellösung.
9. Inkubieren Sie das Stapelgel ca. 30 Minuten lang bei Raumtemperatur, damit es vollständig polymerisieren kann.
10. Wickeln Sie die Gele mit feuchten Papiertüchern ein, legen Sie sie in eine Plastiktüte und bewahren Sie die Gele mindestens über Nacht, aber nicht länger als 1 Woche bei 4 °C auf.
11. Laden Sie die Gel-Sandwich-Kassette in eine Elektrodenanordnung, übertragen Sie sie in den Tank und füllen Sie sie mit 1x SDS-PAGE-Puffer [250 mM Tris-HCl, 1,92 M Glycin, 1% (w/v) SDS], bevor Sie die SDS-PAGE-Elektrophorese durchführen.
    HINWEIS: Der SDS-PAGE-Puffer kann über längere Zeiträume bei 4 °C gelagert werden.
12. Entferne den Kamm aus dem Gel.

3. Herstellung von SDS-PAGE-Trenn- und Stapelgelen zur Bestimmung des Gesamtproteingehalts

HINWEIS: Die Schritte in Abschnitt 3 ähneln den Schritten in Abschnitt 2, in dem die Gelvorbereitung für die Gelatinezymographie beschrieben wird. Beachten Sie, dass die Zusammensetzung der Gele unterschiedlich ist. Ein Gel zur Bestimmung des Gesamtproteingehalts darf keine Gelatine enthalten, da es auch mit Coomassie Brilliant Blue Lösung gefärbt wird.

1. Bereiten Sie 10 ml 10%iges Trenngel vor, indem Sie 3,34 ml 30 % Acrylamid/Bis-Acrylamid, 2,5 ml 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8), 100 μl 10 % SDS, 3,99 ml H₂O, 50 μl 10 % APS und 20 μl TEMED mischen.
2. Mischen Sie die Lösung durch Inversion, um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden, und geben Sie die Lösung bis zu 75 % der Höhe der kurzen Platte auf das Gelkassettensandwich.
3. Schichten Sie die Oberseite des Gels mit Ethanol und lassen Sie das Gel ca. 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Entfernen Sie das Ethanol.
4. Bereiten Sie 5 ml 4%iges Stapelgel vor, indem Sie 650 μl 30 % Acrylamid/Bis-Acrylamid, 1,25 ml 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8), 50 μl 10 % SDS, 2,99 ml H₂O, 25 μl 10 % APS und 12,5 μl TEMED mischen.
5. Legen Sie einen Kamm auf die Oberseite der Gel-Sandwich-Kassette und füllen Sie ihn mit Stapelgellösung.
6. Lassen Sie das Gel ca. 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen.
   HINWEIS: Das Gel kann kurz vor der SDS-PAGE-Elektrophorese hergestellt oder einige Tage bei 4 °C gelagert werden. Wickeln Sie das Gel zur Aufbewahrung in ein feuchtes Papiertuch und legen Sie es in eine Plastiktüte, um es feucht zu halten.
7. Legen Sie die Kassetten mit den Gelen in den Tank, laden Sie die Gel-Sandwich-Kassette in eine Elektrodenanordnung und übertragen Sie die Baugruppe in einen Tank mit 1x SDS-PAGE-Puffer [250 mM Tris-HCl, 1,92 M Glycin, 1% (w/v) SDS], bevor Sie die SDS-PAGE-Elektrophorese durchführen.
8. Entferne den Kamm aus dem Gel.

4. Probenbeladung und Elektrophorese läuft

1. Bereiten Sie jede SDS-PAGE-Probe für die Zymographie vor, indem Sie ein 1:1-Verhältnis von 3-20 μg (hier 10 μg) konzentriertem Medium mit 2x nicht reduzierendem Ladepuffer [10 mM Tris pH 6,8, 1 % (w/v) SDS, 10 % (v/v) Glycerin, 0,03 % (w/v) Bromphenolblau] basierend auf der geschätzten Proteinkonzentration im Medium mischen.
   HINWEIS: Der Ladepuffer sollte bei 4 °C gelagert werden. Die Verwendung von β-Mercaptoethanol und Dithiothreitol (DTT) wird nicht empfohlen, da sie Disulfidbindungen zwischen Cysteinresten zerstören können, was dazu führt, dass das MMP nach der Elektrophorese nicht mehr zurückfalten kann.
2. Bereiten Sie das Gel für die Bestimmung des Gesamtproteingehalts vor, indem Sie die Proben im Verhältnis 1:3 mit 4x Reduktionspuffer mischen [40 % (v/v) Glycerin, 240 mM Tris (pH 6,8), 8 % (w/v) SDS, 0,04 % (w/v) Bromphenolblau, 5 % (v/v) β-Mercaptoethanol].
   HINWEIS: VORSICHT! Tragen Sie Handschuhe und eine Schutzbrille und arbeiten Sie unter dem Abzug. Der Ladepuffer sollte bei -20 °C gelagert werden. In jede Bahn sollte die gleiche Menge an Protein geladen werden. Die Proben können optional bei Bedarf einige Tage bei -80 °C gelagert werden (STOP POINT 4).
3. Inkubieren Sie die Proben für die Gelatinezymographie 20 Minuten lang bei 37 °C, bevor Sie die Elektrophorese durchführen.
   HINWEIS: Erhitzen Sie die Proben nicht auf eine Temperatur über 37 °C. Die thermische Denaturierung von Proteinen kann zur Inaktivierung der Proteaseaktivität führen oder die Rückfaltung der Enzyme verhindern, was zu falsch-negativen Ergebnissen und falscher Dateninterpretation führt³¹.
4. Die Proben zur Bestimmung des Gesamtproteingehalts werden 10 Minuten lang bei 95 °C inkubiert.
5. Schleudern Sie die Proben für einige Sekunden in einer kleinen Tischzentrifuge und laden Sie sie in die Vertiefungen der Gele.
6. Legen Sie optional eine Molekulargewichtsleiter und negative (Proben, die 10 Minuten lang bei 95 °C gekocht wurden) und positive Kontrollproben (z. B. rekombinante MMP-2 und MMP-9 oder eine Zelllinie, von der bekannt ist, dass sie MMP-2 und MMP-9³⁶ sezerniert) in die Vertiefungen.
7. Führen Sie die Elektrophorese durch und halten Sie es auf Eis, bis der Farbstoff aus dem Gel fließt, um eine gute MMP-9- und MMP-2-Bandentrennung zu gewährleisten. Verwenden Sie die folgenden SDS-PAGE-Elektrophoresebedingungen: zunächst 20 mA pro Gel, wobei die Leistung auf 40 mA pro Gel erhöht wird, wenn die Proben in das Trenngel gelangen.
   HINWEIS: Der maximale elektrische Strom sollte 130 mA für vier Gele nicht überschreiten. Andernfalls wird das Gel während der Elektrophorese überhitzt. Die Elektrophorese kann in einer Box mit Eis oder in einem Kühlraum (4 °C) durchgeführt werden, falls verfügbar.

5. Aktivierung, Färbung und Entfärbung des Polyacrylamid-Gels

1. Gelwaschung und -aktivierung
   1. Entfernen Sie das Zymographie-Gel zwischen der kurzen und der Abstandsplatte und geben Sie es in einen Kunststoffbehälter mit Waschpuffer [50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 10 mM CaCl₂, 2,5% (v/v) Triton X-100]. Bereiten Sie den Waschpuffer am Tag der Gelatine-Zymographie vor.
      HINWEIS: Da Triton X-100 sehr viskos ist, pipettieren Sie es gemäß den Regeln für das Pipettieren viskoser Flüssigkeiten, um bei jeder Herstellung des Puffers das gleiche Volumen Triton X-100 hinzuzufügen³⁷.
   2. Inkubieren Sie das Gel zweimal im Waschpuffer, jeweils 30 Minuten lang unter leichtem Rühren, um SDS aus dem Gel zu entfernen und es durch Triton X-100 zu ersetzen.
   3. Füllen Sie das Gel in einen Kunststofftank mit Inkubationspuffer (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 10 mM CaCl₂).
      HINWEIS: Für eine Langzeitlagerung halten Sie den Inkubationspuffer bei 4 °C. Bereiten Sie frischen Puffer vor, falls es Anzeichen einer mikrobiellen Kontamination oder Ausfällung gibt.
   4. Inkubieren Sie das Gel im Inkubationspuffer für 12-20 h (hier 16 h) bei 37 °C.
      HINWEIS: Die Dicke des Gels und die Menge des geladenen Proteins beeinflussen die Inkubationszeit im Inkubationspuffer, die optimiert werden sollte, um die Bereiche mit gut verdauter Gelatine im Gel zu erhalten.
2. Gelfärbung und Entfärbung
   1. Bereiten Sie die Färbelösung vor, die eine wässrige Lösung aus 0,5 % (w/v) Coomassie Brilliant Blue R-250, 30 % (v/v) Ethanol und 10 % (v/v) Essigsäure enthält.
      HINWEIS: VORSICHT! Arbeiten Sie unter dem Abzug und tragen Sie Handschuhe, wenn Sie Essigsäure verwenden. Lösen Sie die gewogene Menge Coomassie Blue in Wasser auf, fügen Sie Ethanol hinzu und mischen Sie die Lösung. Zum Schluss wird der Ethanol-Wasser-Lösung langsam Essigsäure zugesetzt, um eine exotherme Reaktion zu vermeiden.
   2. Die Entfärbungslösung wird hergestellt, die 30 % (v/v) Ethanol und 10 % (v/v) der Essigsäure in H₂O enthält.
      HINWEIS: Ethanol mit H₂O mischen. Am Ende langsam Essigsäure zur Ethanol-Wasser-Lösung geben, um eine exotherme Reaktion zu vermeiden.
   3. Füllen Sie das Gel in einen Plastikbehälter mit Coomassie Brilliant Blue Lösung und färben Sie das Gel 30 Minuten lang bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren.
      HINWEIS: FastGene Q-Stain kann auch zum Färben des Gels verwendet werden. Der Vorteil dieses Farbstoffs ist, dass er gebrauchsfertig ist und dass das gefärbte Gel keinen Entfärbungsschritt erfordert.
   4. Inkubieren Sie das Gel im Entfärbungspuffer bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren, um die Färbung zu entfernen. Fahren Sie mit der Entfärbung fort, bis klare Banden, die die Gelatinaseaktivität darstellen, sichtbar sind.
      HINWEIS: Wenn die Färbung mit Coomassie Brilliant Blue Lösung sehr intensiv ist, wechseln Sie den Entfärbungspuffer während der Inkubation einige Male.
   5. Halten Sie das Gel mit Feuchtigkeit versorgt und lassen Sie es nicht austrocknen, bis es sichtbar ist.
      HINWEIS: Ersetzen Sie den Entfärbungspuffer durch Wasser, um den Entfärbungsprozess bis zur Visualisierung zu verlangsamen.

6. Visualisierung von Proteinen in Polyacrylamid-Gelen

HINWEIS: In der Materialtabelle finden Sie Einzelheiten zum Bildgebungssystem und zur Software, die zur Visualisierung von Proteinen in Polyacrylamid-Gelen verwendet werden (Abbildung 2A-C). Zu diesem Zweck können auch andere leicht verfügbare Gel-Visualisierungssysteme (z. B. iBright Imaging Systems, UVP PhotoDoc-It Imaging System, E-Gel Imager und Azure Imagers) verwendet werden.

1. Schalten Sie das bildgebende Gerät ein und öffnen Sie die Software.
2. Klicken Sie auf Datei | Neues Projekt , um ein neues Projekt zu öffnen.
3. Wählen Sie den Anwendungstyp aus, indem Sie auf Auswählen... | Protein-Gele | Coomassie blau.
4. Übertragen Sie die Gele nacheinander in das Bildgebungssystem und überprüfen Sie die Gelposition mit der Taste Gel positionieren.
5. Visualisieren Sie das Gel, indem Sie auf Protokoll ausführen klicken.
6. Speichern Sie das Bild als .scn, um eine weitere Analyse mit der referenzierten Software zu ermöglichen.
7. Darüber hinaus können Sie die Datei als .tif exportieren, indem Sie auf Datei | Exportieren | Exportieren zur Analyse, was für die Analyse mit ImageJ (STOP POINT 5) nützlich ist.

7. Datenanalyse

1. Gelanalyse mit der Bildgebungssoftware
   1. Öffnen Sie die Bildgebungssoftware und die Bilder des Zymogramms und des Gels, die den Gesamtproteingehalt darstellen.
   2. Invertieren Sie das Bild, um schwarze Streifen auf weißem Hintergrund zu erhalten. Klicken Sie unter Gehen Sie zur Einstellung Bildtransformation auf Bildanzeige umkehren.
   3. Wählen Sie Linien und Bänder im Zymogramm aus, die MMP-2 und MMP-9 darstellen, manuell oder automatisch mit der Analysis Tool Box | Abschnitt "Lane and Bands". Erstellen Sie eine Bande pro Linie und passen Sie ihre Größe so an, dass sie die gesamte Linienfläche für die Bestimmung des Gesamtproteingehalts auf dem Gel umfasst, die den Gesamtproteingehalt darstellt.
   4. Passen Sie die Linien und Bänder mit den Werkzeugen an, die im Abschnitt "Spur und Band " verfügbar sind (Abbildung 2A'-C').
   5. Gehen Sie zur Analysetabelle und kopieren Sie das Volumen (Intensität) und das Molekulargewicht jeder Spur und Bande (Abbildung 2A"-C").
   6. Teilen Sie das Volumen jeder Lane durch das Volumen der ausgewählten Kontrolllane (hier A375), um den Gesamtproteingehalt zwischen den Lanes zu vergleichen (Abbildung 2A).
   7. Dividieren Sie das Volumen jeder Bande durch den Wert der entsprechenden Spur (aus Schritt 7.6), um das Volumen der MMP-Aktivität auf den Gesamtproteingehalt zu normalisieren (Abbildung 2B",C").
   8. Um die Aktivität von Gelatinasen zwischen Linien zu vergleichen, dividieren Sie das normierte Volumen der untersuchten Linie/untersuchten Bedingung durch das normalisierte Volumen der Kontrolllinie/Standardbedingung (hier A375) (Abbildung 2B",C").
2. Alternative Gelanalyse mit der ImageJ-Software
   1. Öffnen Sie die ImageJ-Software und öffnen Sie das invertierte Gelbild (schwarze Streifen auf weißem Hintergrund).
   2. Umrande die erste Bahn mit gelatineverdauten Bändern mit dem Rechteck-Werkzeug .
   3. Wählen Sie Analysieren | Gele | Wählen Sie in der Symbolleiste ImageJ die Option Erste Spur aus, um die erste Spur auszuwählen und zu markieren.
   4. Übertragen Sie die erste umrandete Auswahl (gelbes Rechteck) in die nächste Spur und klicken Sie auf Analysieren | Gele | Wählen Sie Nächste Lane aus, um die nächste Lane auszuwählen und zu markieren.
   5. Wählen Sie alle auf dem Gel dargestellten Lanes auf die gleiche Weise aus (Abbildung 3A-C).
   6. Gehen Sie zu Analysieren | Gele | Plotten Sie Lanes , um das Lane-Profil zu plotten (Abbildung 3A'-C').
   7. Trennen Sie mit dem Werkzeug "Gerade " Bänder mit vertikalen Linien an den Rändern der einzelnen Spitzen und zeichnen Sie dann horizontale Linien, um ihren Bereich zu "schließen" (Abbildung 3A'-C'; gelbe Linien).
   8. Messen Sie die Größe jedes Peaks mit dem Tracking-Tool. Klicken Sie in den Bereich jedes Peaks, um ihn auszuwählen, und warten Sie, bis die Peaks gelb umrandet sind.
   9. Suchen Sie in der Ergebnistabelle nach der Größe jedes ausgewählten Peaks (Abbildung 3A"-C").
   10. Normisieren Sie die Daten auf den Gesamtproteingehalt, wie in Schritt 7.1 beschrieben.
   11. Teilen Sie die "Fläche" der untersuchten Linie/Bedingung durch die "Fläche" der Kontrolllinie/Standardbedingung (Abbildung 3A"-C").
3. Präsentation der Daten
   1. Zeigen Sie die mit der Bildgebungssoftware erhaltenen Ergebnisse als normalisierte MMP-Aktivität auf den Gesamtproteingehalt und die Kontrolllinie (Abbildung 4A, B).
   2. Präsentieren Sie die mit ImageJ erhaltenen Ergebnisse als die MMP-Aktivität, normiert auf den Gesamtproteingehalt und die Kontrolllinie (Abbildung 4C,D).

In diesem Protokoll beschreiben wir das Verfahren für die Gelatine-Zymographie (Abbildung 1) unter Verwendung von Medien, die aus fünf Melanomzelllinien (A375, SK-MEL-28, Hs-294T, WM9, WM1341D) als Proben gewonnen wurden. Der hier gezeigte Zymographie-Ansatz umfasst zwei separate SDS-PAGE-Elektrophoresen. Eine SDS-PAGE-Elektrophorese führt zu dem Coomassie Blue-gefärbten Gel, das den Gesamtproteingehalt darstellt, der in jeder Linie geladen ist (

Trotz des hier ausgearbeiteten "Schritt für Schritt"-Protokolls erfordert die Gelatine-Zymographie eine Optimierung in Abhängigkeit von den zu analysierenden Proben/Zelllinien. Unterschiedliche Zelltypen und Zelllinien (hier gezeigte Melanomzelllinien) können beide Formen (pro- und aktiv) von MMP-2 und MMP-9 sezernieren, jedoch mit unterschiedlicher Gelatinase-Aktivität. Die Optimierung des Verfahrens umfasst hauptsächlich die Dauer des Zellhungers, die Dicke des Polyacrylamid-Gels,...

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

Diese Arbeit wurde vom National Center for Science, Polen unterstützt (Projekt #2016/22/E/NZ3/00654, bewilligt an AJM).