CFBE Hücrelerinde miRNA'nın RISC'ye TGF-β1 Aracılı Alımını İncelemek için Ago2-miRNA-ko-IP Testi

Burada, insan bronşiyal epitel CFBE2o- hücrelerinde TGF-β1 tarafından indüklenen aktif bir spesifik miRNA havuzunu ölçmek için tasarlanmış Ago41-miRNA-co-IP testini açıklıyoruz. Bu tahlil, spesifik miRNA primerleri ve TaqMan hidroliz probları kullanılarak qRT-PCR ile ölçülen, miRNA'nın RNA ile indüklenen susturma kompleksine alınması hakkında fonksiyonel bilgi sağlar.

Mikro(mi)RNA'lar, transkripsiyon sonrası mekanizmalarla RNA girişimine (RNAi) aracılık eden kısa, kodlamayan RNA'lardır. Spesifik miRNA'lar, sitoplazmik RNA ile indüklenen susturma kompleksine (RISC) alınır. RISC'nin önemli bir bileşeni olan Argonaute2 (Ago2), miRNA'nın mRNA üzerindeki hedef bölgeye bağlanmasını ve ardından miRNA-mRNA dupleksinin endonükleaz aktivitesi ile parçalanmasını kolaylaştırır. RNAi'ye, RISC'ye alınan belirli bir miRNA havuzu aracılık eder ve bu nedenle fonksiyonel havuz olarak adlandırılır. Birçok miRNA'nın hücresel seviyeleri, sitokin Dönüştürücü Büyüme Faktörü-β1'den (TGF-β1) etkilenir. Bununla birlikte, TGF-β1'in bu miRNA'ların fonksiyonel havuzlarını etkileyip etkilemediği hakkında çok az şey bilinmektedir. Bu yazıda tartışılan Ago2-miRNA-ko-IP testi, TGF-β1'in miRNA'ların RISC'ye alınması üzerindeki etkilerini incelemek için tasarlanmıştır ve hücresel miRNA seviyelerindeki değişikliklerin RISC ile ilişkili, fonksiyonel havuzlardaki değişikliklerle ilişkili olup olmadığını belirlemeye yardımcı olur. Tahlilin genel prensipleri aşağıdaki gibidir. TGF-β1 veya araç kontrolü ile tedavi edilen kültürlenmiş hücreler parçalanır ve endojen Ago2, immobilize anti-Ago2 antikoru ile immünopresipite edilir ve Ago2 ile komplekslenen aktif miRNA'lar bir RISC immünopresipitasyon (RIP) test kiti ile izole edilir. MiRNA'lar, ters transkripsiyon sırasında miRNA'ya özgü kök halkalı primerler kullanılarak kantitatif ters transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) ile tanımlanır, ardından miRNA'ya özgü ileri ve geri primerler kullanılarak PCR ve TaqMan hidroliz probları ile tanımlanır.

Dönüştürücü Büyüme Faktörü-β1 (TGF-β1), birçok mikro(mi)RNA'nın ^1,2,3 ekspresyonunu değiştirebilen çok işlevli bir sitokindir. Belirli bir miRNA'nın toplam hücresel seviyesi, inhibitör potansiyeli ile ilişkili değildir, çünkü miRNA'nın yalnızca belirli bir kısmı, RNA girişimini (RNAi) gerçekleştirmek için RNA kaynaklı susturma kompleksine (RISC) dahil ^edilir.3. Her miRNA'nın sadece %10 kadarı RISC ile ilişkilidir ve RNAi ^4,5'e katılır. Daha sonra, RNAi işlemi, RISC ile ilişkili miRNA'nın hedef mRNA tanıma dizi(ler)ine bağlanmasını ^içerir.6. RISC ilişkisi, hedef mRNA'nın mevcudiyetinden ve genellikle mRNA^4'ün 3' çevrilmemiş bölgesinde (UTR) bulunan bağlanma bölgesine miRNA tamamlayıcılığından etkilenir. Bu yazıda açıklanan Argonaute2-miRNA-ko-immünopresipitasyon (Ago2-miRNA-ko-IP) testi, TGF-β1 tedavisinden sonra RISC ile ilişkili miRNA'lardaki farklılıkları tespit ederek TGF-β1'in spesifik miRNA'ların RISC'ye alınması üzerindeki etkisini incelemek için tasarlanmıştır, araç kontrolüne kıyasla. Belirli bir miRNA'nın RISC ile ilişkili fonksiyonel havuzunu incelemek, miRNA'nın toplam hücresel seviyesini incelemekten çok daha fazla miRNA etkileri hakkında bilgilendiricidir. RISC, hedef mRNA üzerindeki bağlanma bölgesini tarayan ve miRNA-mRNA dupleksini parçalayan proteinlerden oluşur. Argonaute2 (Ago2), RISC'nin ana bileşenidir. Beş Ago izoformundan (Ago1-Ago5), Ago2, endonükleaz aktivitesine sahip olan ve insan hücrelerinde RNAi'ye katılan^tek izoformdur ^7,8,9,10. Ago2-miRNA-RISC kompleksi, miRNA aracılı transkripsiyon sonrası mRNA baskılanması¹¹ için fonksiyonel birimdir. Ago2 ile ilişkili miRNA, hücre içi veya hücre dışı sinyalleşmeye yanıt olarak miRNA'nın doğal durumunu temsil eder. Bu nedenle, endojen Ago2'nin immünopresipitasyonu, belirli bir miRNA'nın aktif, RISC ile ilişkili fraksiyonunun yanı sıra hedeflerinin fonksiyonel değerlendirmesini tespit etmek için mükemmel bir fırsat sağlar. Bu test, biyotinile nükleik asit moleküllerinin hücresel alımının öngörülemeyen etkinliği ve bunların hedef dışı etkileri nedeniyle, endojen hedef mRNA'nın biyotinile miRNA taklitleri ile aşağı çekilmesinden daha üstündür.

Bu yazıda tartışılan Ago2-miRNA-ko-IP testi, TGF-β1'in ölümsüzleştirilmiş insan bronşiyal epitel CFBE41o- hücreleri^3'te miRNA'ların RISC alımı üzerindeki etkilerini belirlemek için optimize edilmiştir. RIP tahlil kitinin bileşenleri, üretici tarafından sağlanan protokolde değişikliklerle Ago2-miRNA-co-IP testini gerçekleştirmek için kullanıldı. Küçük ve büyük RNA'yı izole etmek için, ters transkripsiyon sırasında miRNA'ya özgü kök ilmekli primerler kullanılarak kantitatif ters transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) yardımıyla miRNA'yı ölçmek için küçük RNA'nın kullanıldığı bir ayırma yöntemi kullanıldı, ardından miRNA'ya özgü ileri ve geri primerler ve TaqMan hidroliz probları kullanılarak PCR yapıldı.

1. Deney öncesi hazırlık

1. Tohumlama hücreleri
   1. Minimal Esansiyel Ortamda (MEM) %10 kollajen I çözeltisi hazırlayın ve 6 oyuklu bir plakada her 24 mm'lik hücre kültürü filtresine 500 μL ekleyin. Filtrenin tüm yüzeyini kaplayacak şekilde elle hafifçe döndürerek dağıtın. Filtreleri UV ışığı altında laminer akış başlığında oda sıcaklığında 30 dakika (dk) inkübe edin, ardından hücre kültürü inkübatöründe 37 ° C'de 1 saat inkübe edin.
   2. Hücre kültürü ortamı hazırlayın (20 dakika boyunca CO₂ ile gazlanmış MEM,% 10 Fetal Sığır Serumu (FBS), 50 U / mL penisilin, 50 U / mL streptomisin, 2 mM L-glutamin, 0.5 μg / mL puromisin).
   3. Kollajen kaplı filtreleri (adım 1.1.1) inkübatörden çıkarın ve fazla kollajeni emdirin. 6 oyuklu plakada bazolateral tarafa 1.5 mL hücre kültürü ortamı (adım 1.1.2) ve apikal tarafa (filtreye) 0.5 mL ekleyin.
   4. CFBE41o- hücrelerinin¹² 1 x 10⁶ tohumu, 500 μL hücre kültürü ortamında süspanse edilir. Hücreleri filtrelere eşit olarak dağıtmak için plakayı elle hafifçe döndürün ve hücre kültürü inkübatöründe 37 ° C'de% 5 CO₂ ile inkübe edin.
   5. Hücreleri tohumladıktan bir gün sonra apikal taraftan ortamı çıkarın ve hücreleri hava-sıvı arayüzünde kültürlemeye devam edin (apikal tarafta ortam yok). Bazolateral ortamı günlük olarak değiştirin ve deneyi 8. günde^{gerçekleştirin} .
2. Hücrelerin TGF-β1 veya Araç Kontrolü ile Tedavisi
   1. FBS içermeyen hücre kültürü ortamı (FBS içermeyen ortam) hazırlayın:% 5 CO₂ ile MEM'i 20 dakika boyunca gazlayın, 50 U / mL penisilin, 50 U / mL streptomisin ve 2 mM L-glutamin ekleyin ve filtre ortamı sterilize edin.
   2. Araç kontrolünü hazırlayın: 1 ng/μL stok çözeltisi elde etmek için 5 mL çift damıtılmış suya (1 mg/mL BSA ile 4 mM HCl) 20 μL 1 M HCl ve 5 mg BSA ekleyin. Filtre, kullanmadan önce karışımı sterilize eder.
   3. TGF-β1 çözeltisini hazırlayın: 1 ng / μL stok çözeltisi elde etmek için 1 μg liyofilize TGF-β1'i 1 mL steril filtreli araçta (4 mM HCl ve 1 mg / mL BSA) sulandırın. Küçük hacimlerde alikotlayın ve -20 °C'de saklayın.
   4. TGF-β1 veya araç kontrolünün çalışma konsantrasyonunu 15 ng/mL FBS içermeyen ortamda hazırlayın (FBS içermeyen ortamın mL'si başına 15 μL TGF-β1 veya araç kontrol stoğu çözeltisi ekleyin). Hücre kültürü ortamını bazolateral taraftan emin ve deneyden 24 saat önce TGF-β1 veya ortam içeren araç kontrolünü ekleyin.
3. Hücre lizisi ve immünopresipitasyon için tamponların hazırlanması
   1. Hücre lizizi için mi-Lizis tamponunu (+) hazırlayın. RIP-Test Kitinde sağlanan mi-Lizis tamponuna 10 mL hacim başına 1 tablet proteaz inhibitörü mini ve 15 μL 1 M DTT ekleyin.
   2. Protein G agaroz boncuklarını yıkamak için mi-Wash tamponunu (+) hazırlayın. RIP-Test Kitinde sağlanan mi-Wash tamponuna 35 mL hacim başına 52,5 μL 1 M DTT ekleyin.
4. Anti-Ago2 antikorunun protein G agaroz boncukları ile konjugasyonu
   1. Aşağıdaki prosedürü üç kez tekrarlayarak iki adet 30 μL protein G agaroz boncuk bulamacını (% 50) ayrı ayrı yıkayın: 100 μL buz gibi soğuk PBS ekleyin, hafifçe karıştırın, 1 dakika boyunca 2.000 x g'de santrifüjleyin ve süpernatanı 200 μL pipet ile emin.
   2. Boncukları 100 μL buz gibi mi-Yıkama Tamponu (+) ile bir kez yıkayın, süpernatanı 200 μL pipetle emdirin ve boncuklara 500 μL mi-Yıkama Tamponu (+) ekleyin ve hafifçe karıştırın. Tüpleri buz üzerinde tutun.
   3. 7.5 μg fare monoklonal (IgG2) anti-insan EIF2C2 (Ago2) antikoru (Malzeme Tablosuna bakınız) veya spesifik olmayan fare IgG2 (negatif kontrol) mi-Wash Buffer (+) içindeki protein G boncuk bulamacına ekleyin.
   4. Tüpleri soğuk bir odada dakikada 8 devirde (rpm) döndürerek gece boyunca inkübe edin.

2. Ago2'nin immünopresipitasyonu

1. Hücrelerin parçalanması
   1. 24 mm'lik filtrelerde kültürlenmiş hücreleri içeren plakayı hücre kültürü inkübatöründen getirin ve filtreleri hızlı bir şekilde buz gibi soğuk PBS ile doldurulmuş buz üzerindeki bir plakaya aktarın. Hücreleri kaplamak için PBS'nin filtrelerin apikal tarafına taşmasına izin verin.
   2. Her seferinde bir taraf, PBS'yi emdirin ve apikal ve bazolateral tarafı buz gibi soğuk PBS ile iki kez yıkayın.
   3. Tüm PBS'yi emdirin, hücrelere 300 μL buz gibi mi-Lizis tamponu (+) ekleyin, hücreleri kazıyın ve ilgili tedavi koşulu (TGF-β1 veya araç kontrolü) için işaretlenmiş 1,5 mL tüpe aktarın.
   4. Her tüpe 200 μL mi-Lizis tamponu (+) ekleyin ve iyice girdaplayın.
   5. Tüpleri buz üzerinde 15 dakika inkübe edin.
   6. Tüpü 14.000 x g'da 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin, süpernatanı hücre lizatı olarak toplayın ve buz üzerinde tutun.
2. Konjuge olmayan protein G agaroz boncukları ile hücre lizatının ön temizlenmesi
   1. 30 μL taze protein G agaroz boncuk bulamacını (% 50) 1.5 mL'lik bir tüpte 3 kez 100 μL PBS (adım 1.4.1) ile yıkayın ve fazla PBS'yi çıkarın.
   2. Boncukları 500 μL mi-Yıkama Tamponu (+) ile bir kez ve bir kez 500 μL mi-Lizis Tamponu (+) ile yıkayın. Fazla arabelleği çıkarın.
   3. Adım 2.1.6'dan hücre lizatını konjuge olmayan protein G boncukları içeren tüplere ekleyin.
   4. Hücre lizatlarını önceden temizlemek için tüpleri soğuk odada 1 saat döndürün (8 rpm).
   5. Ön temizlemeden sonra, tüpleri 2.000 x g'da 4 °C'de 1 dakika santrifüjleyin. Önceden temizlenmiş lizatı taze tüplerde süpernatan olarak toplayın ve buz üzerinde tutun.
   6. Ago2 proteininin western blotlama ile tespiti için pre-immünopresipitasyon tam hücre lizatını (WCL) hazırlayın. 10 μL önceden temizlenmiş lizat alın ve 10 μL numune tamponu (%10 DTT ile) ekleyin, 85 °C'de 4 dakika ısıtın, tezgahta soğutun ve -20 °C'de saklayın.
3. Protein G agaroz boncukları üzerinde hareketsiz hale getirilmiş anti-Ago2 antikoru ile Ago2 komplekslerinin immünopresipitasyonu
   1. Adım 1.4.4'te hazırlanan protein G boncuklarına konjuge edilmiş anti-Ago2 antikorunu 2.000 x g'de 4 ° C'de 1 dakika boyunca santrifüjleyin, süpernatanı çıkarın ve atın. Boncukları 500 μL mi-Lizis Tamponu (+) ile bir kez yıkayın, daha önce olduğu gibi santrifüjleyin ve süpernatanı tekrar atın.
   2. Adım 2.2.6'dan önceden temizlenmiş 500 μL hücre lizatlarını, protein G boncukları ile konjuge edilmiş anti-Ago2 antikoru ile karıştırın ve soğuk odada 3 saat döndürme (8 rpm) boyunca inkübe edin.
   3. Tüpleri buz üzerindeki soğuk odadan tezgah üstüne getirin ve 4 °C'de 1 dakika boyunca 2.000 x g'da santrifüjleyin. Ardından süpernatanı çıkarın ve atın.
   4. Protein G agaroz boncuklarını, 1 mL mi-Yıkama tamponu (+) ile birlikte immünopresipite miRNA'ları içeren immobilize anti-Ago2 antikor-Ago2 kompleksleri ile yıkayın, 4 ° C'de 1 dakika boyunca 2.000 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Bu işlemi iki kez tekrarlayın.
   5. Boncukları 1 mL mi-Yıkama Tamponu (+) ile yeniden süspanse edin ve batı lekeleme için immünopresipitasyon sonrası protein örnekleri için bulamacın 100 μL'sini yeni bir tüpe alın.
   6. Tüpleri 2.000 x g'da 4 ° C'de 1 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
   7. 20 μL numune tamponu (%10 DTT) ekleyin, 85 °C'de 5 dakika ısıtın, karıştırın ve oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 2.000 x g'da santrifüjleyin. Numuneleri -20 °C'de saklayın.
   8. Tüpleri, 2.3.5. adımdan itibaren kalan 900 μL immobilize anti-Ago2 antikor-Ago2 kompleksleri ile 2.000 x g'de 4 ° C'de 1 dakika boyunca santrifüjleyin, süpernatanı emdirin ve atın. Numuneleri buz üzerinde tutun.

3. RNA İzolasyonu

1. Sonraki adımlarda küçük RNA ve büyük RNA'nın izolasyonu için numune başına iki adet 1.5 mL tüpü etiketleyin ve adım 3.5 ve 3.8'de kullanılmak üzere her tüpe 2 μL mi-solüsyon IV ekleyin.
2. RIP tahlil kitinden numune başına 10 μL mi-çözelti I ve 240 μL mi-çözelti II ekleyerek ana karışım çözeltisini hazırlayın ve tüpü oda sıcaklığında tutun.
3. İmmobilize edilmiş anti-Ago2 antikor-Ago2 kompleksleri (adım 2.3.8'de hazırlanan), girdap içeren her tüpe 250 μL ana karışım ekleyin ve oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 2.000 x g'da santrifüjleyin.
4. Aynı tüpe 150 μL mi-çözelti III ekleyin ve iyice karıştırın. Daha sonra oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 2.000 x g'da santrifüjleyin. Bu aşamadaki süpernatant, küçük RNA'ya (yani toplam RNA) ek olarak büyük RNA içerir.
5. Süpernatanı, adım 3.1'de hazırlanan 2 μL mi-çözelti IV içeren tüpe dikkatlice aktarın. qRT-PCR'ye müdahale etmek için süpernatanı boncuklarla kirletmekten kaçının.
6. Toplam RNA, girdap, spin down içeren her tüpe 300 μL buz gibi soğuk 2-popanol ekleyin ve büyük RNA'nın optimum çökelmesi için 2 saat boyunca -20 ° C'de inkübe edin.
7. -20 ° C'de inkübasyondan sonra, sırasıyla süpernatant ve pelette bulunan küçük ve büyük RNA'ları ayırmak için numuneleri 4 ° C'de 10 dakika boyunca 12.000 x g'da santrifüjleyin. Peletleri adım 3.11'e kadar buz üzerinde tutun.
8. Süpernatanı küçük RNA'larla adım 3.1'de hazırlanan tüpe aktarın (2 μL mi-çözelti IV içeren) ve 500 μL buz gibi soğuk 2-propanol, girdap ekleyin ve aşağı doğru döndürün.
9. Küçük RNA'ların optimum çökelmesi için süpernatanları gece boyunca -20 °C'de inkübe edin.
10. Ertesi gün, küçük RNA'lar içeren tüpleri -20 °C dondurucudan çıkarın ve 12.000 x g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin. Peleti bozmadan süpernatanı aspire edin ve adım 3.11'i izleyerek küçük RNA'nın çoğunu içeren peleti yıkayın.
11. Büyük RNA (adım 3.7) ve küçük RNA (adım 3.10) içeren peleti, her biri 500 μL buz gibi %70 etanol ile durulayın. Peleti buz gibi %70 etanol ile yavaşça karıştırın ve ardından 12.000 x g'da 4 °C'de 3 dakika santrifüjleyin. Peletleri rahatsız etmeden süpernatanı dikkatlice aspire edin. Yıkama işlemini bir kez daha tekrarlayın.
12. Kalan etanolü daha küçük hacimli (10 μL veya 20 μL) pipetle aspire edin ve RNaz içermeyen ortamda oda sıcaklığında 30 dakika kurumaya bırakın.
13. 50 μL nükleaz içermeyen su ekleyerek ve 65 °C'de 5 dakika ısıtarak küçük RNA'yı ve büyük RNA peletlerini sulandırın. Daha sonra RNA'yı nanodrop ile RNA'nın kalitesini ve konsantrasyonunu kontrol ettikten sonra daha sonraki kullanıma kadar -80 °C'de saklayın.

4. MiRNA'nın kantitatif ters transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) ile miktar tayini

1. miRNA'ya Özgü Kök Halkalı Primerler ile miRNA'nın Ters Transkripsiyonu Yoluyla cDNA Hazırlama
   NOT: Standart qRT-PCR ile RNA tespiti, her biri yaklaşık 20 nükleotid uzunluğunda, ileri veya geri primerin uzunluğunun en az iki katı uzunluğunda bir şablon gerektirir. Bu nedenle, minimum uzunluk en az 40 nükleotittir, bu da küçük RNA'ları tespit edilemeyecek kadar kısa yapar. Protokol, hedef cDNA'yı uzatan oldukça kararlı kök döngü yapısı içeren miRNA'ya özgü RT-primerleri (Malzeme Tablosu) tanımlar. İleri PCR astarı, erime sıcaklığını optimize eden ve test özgüllüğünü artıran nükleotidlerle ek uzunluk ekler. Ters astar, gövde halkasını¹³ bozar. Aşağıdaki protokol, miRNA ters transkripsiyon Kitini (Malzeme Tablosu) kullanarak miR-145-5p, miR-143-5p ve miR-154-5p için RNA'nın cDNA'ya RT'sini açıklar.
   1. 100 mM dNTP (0.3 μL), Ters Transkriptaz (2 μL), 10x RT tamponu (3 μL), RNaz İnhibitörü (0.38 μL), miRNA'ya özgü döngülü primer (6 μL) ve nükleaz içermeyen su (8.32 μL) ekleyerek her miRNA için bir ana karışım hazırlayın. Ana karışımın birleşik hacmi 20 μL'dir.
   2. miR-145-5p, miR-143-5p ve miR-154-5p'nin her cDNA'sı için üç ayrı 200 μL'lik tüpe adım 3.13'ten (50-100 ng) 10 μL küçük RNA ekleyin.
   3. Ana karışımı küçük RNA'ya ekleyin, hafifçe karıştırın ve tüplerin dibine döndürün. Termal döngüleyiciye yüklenene kadar tüpleri buz üzerinde tutun.
   4. Programı tek döngü için termal döngüleyicide 16 °C'de 30 dakika, 42 °C'de 30 dakika, 85 °C'de 5 dakika ve 4 °C'de tutun şeklinde ayarlayın. Reaksiyon hacmini 30.0 μL'ye ayarlayın. Bkz. adım 4.1.6.1.
   5. Reaksiyon tüplerini termal döngüleyiciye yükleyin. RT çalıştırmasını başlatın. Bkz. adım 4.1.6.2.
   6. Termal döngüleyiciyi AÇIN ve tüpleri tepsiye yerleştirin. "Sistem önyükleniyor, lütfen bekleyin" mesajını gösterecektir. Gözat/Yeni Yöntemler'e tıklayın. Yöntemi kaydedin ve menüye göz atarak başka bir deneyde kullanın. Daha önce kaydedilen yöntemler listesinden seçim yapın ve çalıştırmayı başlatın veya "yeni" yöntem oluşturun. "Çalıştırmayı düzenle" yöntemi veya "yeni" yöntem ekranı görünecektir.
      1. Sıcaklığı ve döngüleri adım 4.1.4'te belirtildiği gibi düzenleyin. Belirli bir aşamaya veya adıma tıklayarak ve ardından ekle veya sil düğmesine tıklayarak aşamaları ve adımları ekleyin veya kaldırın. Kaydet'e tıklayın veya doğrudan programı çalıştırın. Çalıştırma Yöntemini Kaydet'te, "çalıştır" yöntemini adlandırın, reaksiyon hacmini (30 μL) ayarlayın, kapak sıcaklığını 105 °C'ye ayarlayın, kaydedin ve çıkın.
      2. "Çalıştırma yöntemine gözat" ekranı görüntülendiğinde, "çalıştırma yöntemi" listesinden kaydedilen yöntemi seçin. Çalıştırmayı Başlat'a tıklayın ve reaksiyon hacmini ve kapak sıcaklığını tekrar onaylayın. Şimdi Çalıştırmayı Başlat'a tıklayın. Ekran, numune sıcaklığını, kapak sıcaklığını ve kalan süreyi gösterecektir. Tamamlandıktan sonra başlatma ve durdurma zamanını kaydedin ve tüpleri termal döngüleyiciden çıkarın.
         NOT: cDNA içeren tüpler, miRNA'nın qPCR'si için daha fazla kullanılana kadar -20 °C'de saklanabilir.
2. miRNA'ya özgü ileri/geri primerler ve hidroliz probları ile qPCR
   NOT: Aşağıdaki protokol, adım 4.1'de hazırlanan miRNA'ya özgü cDNA'ları kullanan miR-145-5p, miR-143-5p ve miR-154-5p'nin qPCR'si içindir. Tek tüplü miRNA Testi (20x), miRNA'ya özgü ileri/geri primerler ve hidroliz probu içerir (Malzeme Tablosu). Ön astar, uzunluğu artırmak ve erime sıcaklığını optimize etmek için nükleotid eklerken, ters astar cDNA^13'ün kök döngüsünü bozar. Universal PCR Master Mix (Malzeme Tablosu), qPCR için gerekli ek bileşenleri sağlar. Reaksiyon (20 μL), her miRNA için üç kopya halinde yapılır.
   1. miR-145-5p, miR-143-5p ve miR-154-5p için ilgili miRNA testi (20x) (1 μL), 2x Universal PCR Master Mix (AmpErase UNG Yok; 10 μL) ve nükleaz içermeyen su (7.5 μL) kullanarak üç kopya halinde ayrı ana karışım hazırlayın. Bir reaksiyon için toplam hacim 18.5 μL'dir.
   2. 4.1'de hazırlanan miRNA'ya özgü cDNA'yı (1.5 μL) PCR plakasının her bir oyuğuna üç kopya halinde ekleyin.
   3. Adım 4.2.1'de hazırlanan miRNA'ya özgü ana karışımı (18.5 μL), ilgili cDNA (1.5 μL) içeren PCR plakasının kuyucuklarına ekleyin.
   4. Plakayı uygun kapatıcı ile kapatın ve bir qPCR termodöngüleyici üzerinde 45 döngü boyunca qPCR'yi çalıştırın (Malzeme Tablosu). Döngü sıcaklığını 95 °C'de 10 dakika bekletin, ardından 15 saniye (s) boyunca 95 °C'lik 45 tekrar ve 60 s boyunca 60 °C'de tutun. Bkz. adım 4.2.6.
   5. qPCR eğrisi taban çizgilerini plaka başına manuel olarak ayarlayın ve tüm qPCR çalışmaları için standartlaştırılmış eşikleri, amplifikasyonun tüm numuneler için logaritmik hale geldiği bir noktada ayarlayın.
   6. Termal döngüleyiciyi AÇIN ve PCR plakasını tepsiye yerleştirin. Termal döngüleyici makinesi, beraberindeki bilgisayarda yüklü olan yazılımla çalışır. Sistem yazılımının simgesine tıklayın.
      1. Yeni Belge Oluştur veya Mevcut Belgeyi Aç'a tıklayın (önceden kaydedilmiş bir belge varsa). Yeni belge sihirbazı görünecektir. Tahlil "standart eğri (Mutlak niceleme)" olacaktır. İleri'ye tıklayın.
      2. Yeni bir algılayıcı ekleyin. Algılayıcıyı miR-143, miR-145 ve miR-154 olarak adlandırın ve Başka Bir Tane Oluştur'a tıklayın. Muhabir boyasını tümü için "FAM" olarak seçin ve Tamam'a tıklayın. Ardından adı miR-143, miR-145 ve miR-154 olarak bulun ve Ekle'ye tıklayarak bunları dedektörün belgesine ekleyin. Ardından İleri'ye tıklayın.
      3. "Numune plakasını ayarla" görünecektir. Bir dedektör için kuyuları seçin ve ardından ilgili dedektörü seçmek için Kullan'a tıklayın. Ardından Bitir'e tıklayın. Sistem başlatılıyor görünecektir.
      4. Cihaza gidin ve adım 4.2.4'te belirtildiği gibi sözü, sıcaklığı ve zamanı ayarlayın. Örnek hacmini 20 μL'ye ayarlayın. Ardından Başlat'a tıklayarak çalıştırmayı başlatın. Ardından plakayı istediğiniz yere bir adla kaydedin. Tahmini süre, başlat düğmesinin yanındaki ekranda gösterilecektir. Zamanı not edin.
      5. Tamamlandıktan sonra şuraya gidin: Dosya | İhracat | Sonuçlar ve sonuçları istenen yerde CT değerleri olarak kaydedin. CT değerleri .csv dosyalarında olacaktır. Açın ve değerleri bir elektronik tablo dosyasına kopyalayın.
   7. ΔCt'yi hesaplamak için araç kontrolü ile muamele edilen numunelerin üçlü eşik döngüsünün (Ct) ortalamasını TGF-β1 ile muamele edilen numunelerin ortalama Ct'sinden çıkarın. Son olarak, formül ^2-ΔCt'yi kullanarak miRNA seviyelerinin kat değişimini (FC) hesaplayın. FC değerinin log2 dönüşümü grafiksel gösterim için kullanılabilir.

TGF-β1'in CFBE41o- hücrelerinde miR-145-5p, miR-143-5p ve miR-154-5p miRNA'larının toplam hücresel seviyelerini arttırdığını daha önce göstermiştik³. Daha sonra, TGF-β2'in bu miRNA'lar üzerindeki fonksiyonel etkilerini aydınlatmak için Ago1-miRNA-co-IP testini kullandık. miR-145-5p, miR-143-5p ve miR-154-5p'nin RISC alımı, vahşi tip (WT)-kistik fibroz transmembran iletkenlik regülatörünü (CFTR) veya mutant CFTR'yi stabil bir şekilde eksprese eden CFBE41o- hücrelerinde incelenmiştir. WT veya F508del-CFBE41o- hücrelerinin hava-sıvı arayüz kültürleri, 24 saat boyunca TGF-β1 veya araç ile muamele edildi. Hücreler parçalandı ve endojen Ago2 immünopresipite edildi ve 1:3000 dilüsyonda primer fare monoklonal anti-Ago2 antikoru ile western blotlama ve ardından anti-fare yaban turpu peroksidaz sekonder antikoru ile tespit edildi. Ago2 immünopresipitasyonunun miktar tayini, filmin doğrusal dinamik aralığı içindeki maruziyetlerle ImageJ kullanılarak dansitometri ile gerçekleştirildi. İmmün çökelmiş Ago2'nin bolluğu, arka plan çıkarıldıktan ve WCL Ago2'ye normalleştirildikten sonra hesaplandı. miR-145-5p, miR-143-5p ve miR-154-5p'nin Ago2 ile ko-immünopresipitasyonu, cDNA hazırlığı için miRNA'ya özgü kök döngülü primerler kullanılarak qRT-PCR ile tespit edildi, ardından miRNA'ya özgü ileri ve geri primerler ve TaqMan hidroliz probları ile PCR izledi. Gruplar arasındaki ortalamalar iki kuyruklu öğrenci t-testi ile hesaplanmıştır. Veriler ortalama ± S.E.M. olarak sunulmuştur. Ago2 protein bolluğu ve immünopresipitasyon etkinliği, TGF-β1 veya araçla tedavi edilen hücre hatlarında benzerdi (Şekil 1A-1C). miR-145-5p ve miR-143-5p, WT- ve F508del-CFTR eksprese eden hücrelerde Ago2 ile birlikte immünopresipite edilmiş komplekslerde mevcuttu (Şekil 1, D-1E). TGF-β1, araç kontrolüne kıyasla her iki hücre hattında Ago2 ile miR-145-5p ve miR-143-5p'nin ko-immünopresipitasyonunu arttırdı. miR-154-5p, Ago2 ile birlikte immünopresipe edildi, ancak TGF-β1, araç kontrolüne kıyasla aktif miR-154-5p havuzunun bolluğunu etkilemedi (Şekil 1F). Birlikte ele alındığında, yukarıdaki sonuçlar TGF-β1'in fonksiyonel havuzunu etkilemeden toplam hücresel miRNA seviyesini artırabildiğini göstermektedir. Ago2-miRNA-ko-IP testi, TGF-β1'in miRNA'lar üzerindeki belirgin etkilerini anlamamızı artırdı.

Şekil 1. TGF-β1'in WT- ve F508del-CFBE41o- hücrelerinde spesifik miRNA'ların RISC'ye seçici alımına aracılık ettiğini gösteren Ago2-miRNA-co-IP testinin özeti. (A) Endojen Ago2, anti-Ago2 antikoru veya immün olmayan IgG2 (negatif bir kontrol) ile WT- veya F508del-CFTR'yi eksprese eden CFBE41o- hücrelerinin tüm hücre lizatlarından (IP) immünopresipite edildi (IP) ve western blotlama (WB) ile tespit edildi. Gösterilen, WT-CFTR eksprese eden hücrelerden temsili WB'dir. IP örneklerindeki spesifik olmayan bant bir yıldızla işaretlenmiştir. TGF-β1'in WCL'deki Ago2 bolluğu üzerinde hiçbir etkisi olmadığını ve Ago2 IP'nin verimliliğini değiştirmediğini gösteren temsili WB görüntüleri (B) ve veri özeti (C). (DF) miRNA'ların endojen Ago2 ile ko-IP'sini gösteren qRT-PCR verileri. Araçla tedavi edilen hücrelerdeki miR-145'in (miR-145-5p) Ct değerleri, ΔCt'ler oluşturmak için TGF-β1 ile tedavi edilen hücrelerdeki miR-145'in Ct değerlerinden çıkarıldı. Numuneler arasındaki miR-145 seviyesindeki kıvrım değişimi (FC), 2^−ΔCt denklemi kullanılarak belirlendi ve araca karşı Log2 FC olarak ifade edildi. TGF-β1, WT- ve F508del-CFBE41o- hücrelerinde miR-145 (D) ve miR-143 (miR-143-5p) (E) ko-IP'sini arttırdı ve miR-154'ün (miR-154-5p) (F) ko-IP'sini etkilemedi. Hata çubukları, S.E.M. N = 10/grup. * P < 0.05. (Bu, daha önce yayınlanmış bir el yazmasından^uyarlanan temsili bir figürdür 3). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ago2-miRNA-co-IP testi, TGF-β1 tedavisine yanıt olarak aktif miRNA havuzunu araştırmak için tasarlanmıştır. Aktif veya RISC ile ilişkili miRNA'lar, hedef mRNA⁴ için inhibitör potansiyellerini anlamak için önemlidir. Panshin ve ark. son zamanlarda Ago2 ve miRNA'ların immünopresipitasyon etkinliğinin^{protokol 16'ya} bağlı olabileceğini göstermiştir. Buradaki protokol ile yukarıda yayınlanan veriler arasında birkaç fark vardır. Buradaki protokol CFBE41o- hücreleri için optimize edilmiştir. Buna karşılık, Panshin ve ark. insan plazmasında veya HEK293 hücrelerinde Ago2 IP'yi inceledi. Ago2'yi fare monoklonal, anti-insan Ago2 antikoru, alt sınıf IgG2 ile protein G agaroz boncukları ile konjuge ettik. Panshin ve ark. immünopresipite miRNA havuzları¹⁶ arasında değişkenliği indükleyebilen protein A agaroz boncukları ile konjuge poliklonal anti-Ago2 antikoru kullandı. Protein A boncukları, tüm insan IgG alt sınıflarına Protein G¹⁷ kadar verimli bir şekilde bağlanmaz. Anti-Ago2 antikorunun IgG2 alt sınıfını nonspesifik IgG2 negatif kontrol kullanarak kontrol ettik. Aynı IP protokolünü kullanarak, RISC ile ilişkili miRNA havuzu üzerindeki TGF-β1 etkilerini inceledik.

MiRNA'ların TGF-β1 ile indüklenen RISC alımını incelemek için immünopresipitasyon ve RNA izolasyonunu optimize etmek için RIP test kitinde çeşitli modifikasyonlar yaptık. İlk olarak, protein G agaroz boncuğunun tamamen yıkanması için daha büyük bir hacimde PBS kullandık. İkinci olarak, maliyeti düşürmek için anti-Ago2 antikoru miktarını ve yıkama tamponunu %50 oranında azalttık. Üçüncüsü, tüm adımları birleşik soğuk sıcaklıkta gerçekleştirdik ve doğrudan hücrelere soğuk lizis tamponu ekledik. Dördüncüsü, miRNA kantifikasyonu için immünopresipitasyon öncesi RNA'yı izole etmedik çünkü CFBE41o- hücreleri^3'ün tüm hücre lizatında miRNA ekspresyonu hakkındaki verileri zaten yayınladık. mRNA'yı incelemek için manyetik boncuk bazlı RNA bağlayıcı protein immünopresipitasyonu gibi diğer yöntemler kullanılabilir. Bununla birlikte, manyetik boncuk tabanlı yöntemler, RISC bileşenini spesifik olarak hedefleyemez ve bu nedenle aktif miRNA havuzunu değerlendirmek için uygun olmayabilir.

Ago2-miRNA-co-IP testinin başarısı için kritik olan birkaç koşulu vurgulamak istiyoruz. Anti-Ago2 antikorunun protein G agaroz boncukları ile etkili konjugasyonu ilk kritik adımdır. Daha sonra, Ago2'nin hareketsizleştirilmiş anti-Ago2 antikoru ile WCL'den verimli bir şekilde aşağı çekilmesi bir sonraki adımdır. Parçalanmış hücreler, Ago2 pull-down ile etkileşimi önlemek için santrifüjleme yoluyla verimli bir şekilde çıkarılması gereken kalıntılar içerir. Süpernatan içeren hücre lizatı toplanırken, hücresel kalıntı içeren peletin yerinden çıkmaması ve süpernatan ile karışmaması için dikkatli olunmalıdır. İmmünopresipitasyondan önceki ön temizleme adımı, proteinlerin boş boncuklara (antikorla konjuge edilmemiş boncuklar) spesifik olmayan bağını gidermek için de gereklidir. İmmünopresipitasyon öncesi RNA izolasyonu seçimi deneye göre belirlenmelidir. İmmünopresipitasyon öncesi RNA'nın izolasyonu ihmal edildi ve burada TGF-β1'in miRNA'ların RISC alımı üzerindeki etkisini inceledik. Araç kontrolüne karşı TGF-β1 ile tedaviden sonra ko-immünopresipe miRNA FC, miRNA'ların TGF-β1'in RISC'ye alınması için ikna edici kanıtlar sağlar. Çalışma sıcaklığının çok önemli bir rolü vardır ve Ago2'nin immünopresipitasyonu sırasındaki tüm adımlar, RISC ile ilişkili proteinlerin ve RNA'nın bozulmasını veya denatürasyonunu önlemek için buz üzerinde veya 4 ° C'de gerçekleştirilmelidir. Boncuklardan RNA'nın elüsiyonunu içeren diğer tüm adımlar benzer sıcaklıkta gerçekleştirilmelidir, çünkü her yerde bulunan ve hızlı RNA bozunmasından sorumlu bir enzim olan RNaz'ın aktivitesi oda sıcaklığında optimaldir. Ekipman, uçlar, tüpler, pipetler ve tezgah üstü dahil olmak üzere RNaz içermeyen ortamın kullanılması şiddetle tavsiye edilir. Sık sık değiştirilen RNase içermeyen, pudrasız nitril eldivenlerin giyilmesi her adımda uygulanmalıdır. Elüsyondan hemen sonra RNA'nın -80 °C'de saklanması önerilir. Agaroz boncukları ile kontaminasyon, cDNA hazırlığı sırasında sorunlara neden olabilir ve qRT-PCR sırasında miRNA veya mRNA'nın nispi miktar tayinini etkileyebilir. Hücre kültürü özel dikkat gerektirir ve dikkatle izlenmelidir. Doku kültürü kapları, hücre aderansını artırmak ve epitel hücre farklılaşmasını teşvik etmek için kollajen ile kaplanmalıdır. Ago2-miRNA-co-IP testini CFBE41o- hücre modelinde gerçekleştirdik.

Protokolün sınırlaması, kullanılan hücre sayısındaki değişikliklere karşı çok hassas olmasıdır. Hücre sayısı hassas bir şekilde kontrol edilmeli ve immünopresipitasyona uğramış Ago2'nin miRNA'larla doygunluğunu önlemek için Ago2 immünopresipitasyonu hücre girişine göre optimize edilmelidir. Gelecekte, tahlil, gen yıkımı ve farklı hastalık modellerinde aktif miRNA havuzunu incelemek gibi çeşitli deneysel ortamlarda uygulanabilir. Test, birincil hücreler veya hayvan modelleri dahil olmak üzere diğer epitelyal ve epitel olmayan hücre modelleriyle kullanım için optimize edilebilir.

Yazarlar, rekabet eden hiçbir mali çıkarları olmadığını ve açıklayacak hiçbir şeyleri olmadığını beyan ederler.

CFBE41o- hücrelerini üreten Tranzyme, Inc.'den (Birmingham, AL) John Wakefield'a ve hücreleri sağlayan CFFT'den J.P. Clancy'ye teşekkür ederiz. Bu araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüleri hibeleri R01HL144539 ve R56HL127202 (AS-U.'ya) ve Kistik Fibrozis Vakfı hibe SWIATE18G0 tarafından finanse edilmiştir.