Il test Ago2-miRNA-co-IP per studiare il reclutamento mediato da TGF-β1 di miRNA nel RISC nelle cellule CFBE

Qui, descriviamo il saggio Ago2-miRNA-co-IP progettato per quantificare un pool attivo di miRNA specifici indotti da TGF-β1 in cellule epiteliali bronchiali umane CFBE41o-. Questo test fornisce informazioni funzionali sul reclutamento di miRNA nel complesso di silenziamento indotto dall'RNA, quantificate mediante qRT-PCR utilizzando specifici primer di miRNA e sonde di idrolisi TaqMan.

I micro(mi)RNA sono brevi RNA non codificanti che mediano l'interferenza dell'RNA (RNAi) attraverso meccanismi post-trascrizionali. Specifici miRNA vengono reclutati nel complesso citoplasmatico di silenziamento indotto dall'RNA (RISC). Argonaute2 (Ago2), un componente essenziale di RISC, facilita il legame del miRNA al sito bersaglio sull'mRNA, seguito dalla scissione del duplex miRNA-mRNA con la sua attività endonucleasica. L'RNAi è mediato da un pool specifico di miRNA reclutati per RISC e quindi viene definito pool funzionale. I livelli cellulari di molti miRNA sono influenzati dalla citochina Transforming Growth Factor-β1 (TGF-β1). Tuttavia, si sa poco sul fatto che il TGF-β1 influenzi i pool funzionali di questi miRNA. Il saggio Ago2-miRNA-co-IP, discusso in questo manoscritto, è progettato per esaminare gli effetti del TGF-β1 sul reclutamento di miRNA in RISC e aiuta a determinare se i cambiamenti nei livelli cellulari di miRNA sono correlati con i cambiamenti nei pool funzionali associati a RISC. I principi generali del test sono i seguenti. Le cellule in coltura trattate con TGF-β1 o con il veicolo di controllo vengono lisate e l'Ago2 endogeno viene immunoprecipitato con l'anticorpo anti-Ago2 immobilizzato, mentre i miRNA attivi complessati con Ago2 vengono isolati con un kit di saggio per immunoprecipitazione RISC (RIP). I miRNA sono identificati con la reazione a catena quantitativa della polimerasi trascrittasi inversa (qRT-PCR) utilizzando primer staminali specifici per miRNA durante la trascrizione inversa, seguita da PCR utilizzando primer diretti e inversi specifici per miRNA e sonde di idrolisi TaqMan.

Il fattore di crescita trasformante-β1 (TGF-β1) è una citochina multifunzionale che può modificare l'espressione di molti micro(mi)RNA ^1,2,3. Il livello cellulare totale di un particolare miRNA non è correlato al suo potenziale inibitorio perché solo una frazione specifica del miRNA è incorporata nel complesso di silenziamento indotto dall'RNA (RISC) per eseguire l'interferenza dell'RNA (RNAi)³. Solo fino al 10% di ciascun miRNA è associato a RISC e partecipa all'RNAi ^4,5. Successivamente, il processo RNAi coinvolge il legame del miRNA associato a RISC alla sequenza o alle sequenze di riconoscimento dell'mRNA ^bersaglio6. L'associazione RISC è influenzata dalla disponibilità dell'mRNA bersaglio e dalla complementarità del miRNA con il sito di legame, solitamente presente nella regione 3' non tradotta (UTR) dell'mRNA⁴. Il saggio Argonaute2-miRNA-co-immunoprecipitazione (Ago2-miRNA-co-IP), descritto in questo manoscritto, è progettato per esaminare l'effetto del TGF-β1 sul reclutamento di specifici miRNA per RISC rilevando differenze nei miRNA associati a RISC dopo il trattamento con TGF-β1, rispetto al controllo del veicolo. L'esame del pool funzionale associato a RISC di uno specifico miRNA è molto più informativo sugli effetti del miRNA rispetto all'esame del livello cellulare totale del miRNA. Il RISC è costituito da proteine che scansionano il sito di legame sull'mRNA bersaglio e fendono il duplex miRNA-mRNA. Argonaute2 (Ago2) è il componente principale di RISC. Delle cinque isoforme di Ago (Ago1-Ago5), Ago2 è l'unica che ha attività endonucleasica e partecipa all'RNAi nelle cellule umane 7,8,9,10. Il complesso Ago2-miRNA-RISC è l'unità funzionale per la repressione post-trascrizionale dell'mRNA mediata da miRNA¹¹. Il miRNA associato ad Ago2 rappresenta lo stato nativo del miRNA in risposta alla segnalazione intracellulare o extracellulare. Pertanto, l'immunoprecipitazione dell'Ago2 endogeno fornisce un'eccellente opportunità per rilevare la frazione attiva associata a RISC di uno specifico miRNA, nonché la valutazione funzionale dei suoi bersagli. Questo test è superiore al pull-down dell'mRNA bersaglio endogeno con miRNA biotinilati a causa dell'efficienza imprevedibile dell'assorbimento cellulare delle molecole di acido nucleico biotinilato e dei loro effetti off-target.

Il saggio Ago2-miRNA-co-IP, discusso in questo manoscritto, è stato ottimizzato per determinare gli effetti del TGF-β1 sul reclutamento RISC dei miRNA nelle cellule CFBE41o- epiteliali bronchiali umane immortalizzate³. I componenti del kit del saggio RIP sono stati utilizzati per eseguire il test Ago2-miRNA-co-IP con modifiche al protocollo fornito dal produttore. È stato utilizzato un metodo di separazione per isolare l'RNA piccolo e grande, in cui l'RNA piccolo è stato utilizzato per quantificare il miRNA con l'aiuto della reazione a catena quantitativa della polimerasi trascrittasi inversa (qRT-PCR) utilizzando primer staminali specifici per miRNA durante la trascrizione inversa, seguita dalla PCR utilizzando primer diretti e inversi specifici per miRNA e sonde di idrolisi TaqMan.

1. Preparazione prima dell'esperimento

1. Cellule di semina
   1. Preparare la soluzione di collagene I al 10% in Minimal Essential Medium (MEM) e aggiungere 500 μl a ciascun filtro per colture cellulari da 24 mm in una piastra a 6 pozzetti. Distribuire fino a coprire tutta la superficie del filtro ruotando delicatamente a mano. Incubare i filtri sotto la luce UV nella cappa a flusso laminare a temperatura ambiente per 30 minuti (min), quindi incubarli in incubatore per colture cellulari a 37 °C per 1 ora.
   2. Preparare il terreno di coltura cellulare (MEM gassato con CO₂ per 20 minuti, 10% di siero fetale bovino (FBS), 50 U/mL di penicillina, 50 U/mL di streptomicina, 2 mM di L-glutammina, 0,5 μg/mL di puromicina).
   3. Estrarre i filtri rivestiti di collagene (passaggio 1.1.1) dall'incubatrice e aspirare il collagene in eccesso. Aggiungere 1,5 mL del terreno di coltura cellulare (fase 1.1.2) sul lato basolaterale e 0,5 mL sul lato apicale (sul filtro) nella piastra a 6 pozzetti.
   4. Seminare 1 x 10⁶ di cellule CFBE41o-¹² sospese in 500 μL del terreno di coltura cellulare. Ruotare delicatamente la piastra a mano per distribuire uniformemente le cellule sui filtri e incubare nell'incubatore per colture cellulari a 37 °C con il 5% di CO₂.
   5. Rimuovere il terreno dal lato apicale un giorno dopo la semina delle cellule e continuare a coltivare le cellule in interfaccia aria-liquido (nessun terreno sul lato apicale). Cambiare il mezzo basolaterale ogni giorno ed eseguire l'esperimento l'8^{° giorno.}
2. Trattamento delle cellule con TGF-β1 o controllo del veicolo
   1. Preparare il terreno di coltura cellulare privo di FBS (terreno privo di FBS): gassare MEM con il 5% di CO₂ per 20 minuti, aggiungere 50 U/mL di penicillina, 50 U/mL di streptomicina e 2 mM di L-glutammina e filtrare sterilizzare il terreno.
   2. Preparare il controllo del veicolo: aggiungere 20 μL di 1 M HCl e 5 mg di BSA a 5 mL di acqua bidistillata (4 mM HCl con 1 mg/mL di BSA) per ottenere 1 ng/μL di soluzione madre. Filtro sterilizzare la miscela prima dell'uso.
   3. Preparare la soluzione di TGF-β1: Ricostituire 1 μg di TGF-β1 liofilizzato in 1 mL di veicolo filtrato sterile (4 mM HCl e 1 mg/mL BSA) per ottenere 1 ng/μL di soluzione madre. Aliquotare in piccole quantità e conservare a -20 °C.
   4. Preparare la concentrazione di lavoro di TGF-β1 o di controllo del veicolo a 15 ng/mL di terreno privo di FBS (aggiungere 15 μL di TGF-β1 o di soluzione stock di controllo del veicolo per mL di terreno privo di FBS). Aspirare il terreno di coltura cellulare dal lato basolaterale e aggiungere il TGF-β1 o il mezzo di controllo del veicolo 24 ore prima dell'esperimento.
3. Preparazione di tamponi per la lisi cellulare e l'immunoprecipitazione
   1. Preparare il tampone di lisi (+) per la lisi cellulare. Aggiungere 1 compressa di inibitore della proteasi mini e 15 μL di DTT da 1 M per 10 mL di volume nel tampone mi-Lysis fornito nel kit RIP-Assay.
   2. Preparare il tampone mi-Wash (+) per il lavaggio delle perle di agarosio proteico G. Aggiungere 52,5 μl di DTT da 1 m per 35 mL di volume nel tampone mi-Wash fornito nel kit RIP-Assay.
4. Coniugazione dell'anticorpo Anti-Ago2 con perle di agarosio di proteina G
   1. Lavare separatamente due aliquote da 30 μl di perle di agarosio di proteina G (50%) ripetendo la seguente procedura tre volte: aggiungere 100 μl di PBS ghiacciato, mescolare delicatamente, centrifugare a 2.000 x g per 1 minuto e aspirare il surnatante con una pipetta da 200 μl.
   2. Lavare una volta le perle con 100 μL di mi-Wash Buffer (+) ghiacciato, aspirare il surnatante con una pipetta da 200 μL e aggiungere 500 μL di mi-Wash Buffer (+) alle microsfere e mescolare delicatamente. Mantieni i tubi sul ghiaccio.
   3. Aggiungere 7,5 μg di anticorpo monoclonale di topo (IgG2) anti-umano EIF2C2 (Ago2) (vedere la Tabella dei materiali) o di IgG2 di topo non specifico (controllo negativo) al liquame di perle di proteina G nel tampone mi-Wash (+).
   4. Incubare le provette durante la notte, ruotandole a 8 rotazioni al minuto (rpm) in una cella frigorifera.

2. Immunoprecipitazione di Ago2

1. Lisi delle cellule
   1. Prelevare la piastra contenente le cellule coltivate su filtri da 24 mm dall'incubatore per colture cellulari e trasferire rapidamente i filtri su una piastra su ghiaccio riempita di PBS ghiacciato. Lasciare che il PBS trabocchi nel lato apicale dei filtri per coprire le celle.
   2. Un lato alla volta, aspirare il PBS e lavare due volte il lato apicale e basolaterale con PBS ghiacciato.
   3. Aspirare tutto il PBS, aggiungere 300 μL di tampone di lisi fredda (+) alle cellule, raschiare le cellule e trasferirle in una provetta da 1,5 mL contrassegnata per la rispettiva condizione di trattamento (TGF-β1 o controllo del veicolo).
   4. Aggiungere 200 μl di tampone mi-Lysis (+) a ciascuna provetta e agitare accuratamente.
   5. Incubare le provette con ghiaccio per 15 minuti.
   6. Centrifugare la provetta a 14.000 x g per 10 minuti a 4 °C, raccogliere il surnatante come lisato cellulare e conservare in ghiaccio.
2. Preclearing del lisato cellulare con perle di agarosio di proteina G non coniugata
   1. Lavare 30 μL di liquame di perle di agarosio di proteine G fresche (50%) in una provetta da 1,5 mL 3 volte con 100 μL di PBS (passaggio 1.4.1) e rimuovere il PBS in eccesso.
   2. Lavare le perle con 500 μL di mi-Wash Buffer (+) una volta e una volta con 500 μL di mi-Lysis Buffer (+). Rimuovere il tampone in eccesso.
   3. Aggiungere il lisato cellulare del passaggio 2.1.6 alle provette contenenti perle di proteina G non coniugate.
   4. Ruotare (8 giri/min) le provette per 1 ora nella cella frigorifera per preeliminare i lisati cellulari.
   5. Dopo la preclearing, centrifugare le provette a 2.000 x g per 1 min a 4 °C. Raccogliere il lisato precleared come surnatante in provette fresche e tenerlo in ghiaccio.
   6. Preparare il lisato di cellule intere (WCL) pre-immunoprecipitazione per la rilevazione della proteina Ago2 mediante western blotting. Prelevare 10 μl di lisati prechiari e aggiungere 10 μl di tampone campione (con il 10% di DTT), riscaldare a 85 °C per 4 minuti, raffreddare sul banco e conservare a -20 °C.
3. Immunoprecipitazione di complessi Ago2 con anticorpi anti-Ago2 immobilizzati su perle di agarosio di proteina G
   1. Centrifugare l'anticorpo anti-Ago2 coniugato alle perle di proteina G preparate al punto 1.4.4 a 2.000 x g per 1 min a 4 °C, rimuovere il surnatante e gettarlo. Lavare le perle una volta con 500 μL di tampone di lisi (+), centrifugare come prima ed eliminare nuovamente il surnatante.
   2. Miscelare 500 μl dei lisati cellulari prechiariti della fase 2.2.6 con l'anticorpo anti-Ago2 coniugato con perle di proteina G e incubare per 3 ore in rotazione (8 giri/min) nella cella frigorifera.
   3. Portare le provette dalla cella frigorifera con ghiaccio al piano di lavoro e centrifugare a 2.000 x g per 1 minuto a 4 °C. Quindi rimuovere e scartare il surnatante.
   4. Lavare le perle di agarosio di proteina G con complessi anticorpi anti-Ago2 immobilizzati contenenti i miRNA co-immunoprecipitati con 1 mL di tampone mi-Wash (+), centrifugare a 2.000 x g per 1 min a 4 °C e scartare il surnatante. Ripeti questo processo due volte.
   5. Risospendere le perle con 1 mL di mi-Wash Buffer (+) e prelevare 100 μL di impasto in una nuova provetta per i campioni di proteine post-immunoprecipitazione per il western blotting.
   6. Centrifugare le provette a 2.000 x g per 1 minuto a 4 °C ed eliminare il surnatante.
   7. Aggiungere 20 μl di tampone campione (10% DTT), riscaldare per 5 minuti a 85 °C, mescolare e centrifugare a 2.000 x g per 1 minuto a temperatura ambiente. Conservare i campioni a -20 °C.
   8. Centrifugare le provette con i restanti 900 μl di complessi anticorpi anti-Ago2 immobilizzati della fase 2.3.5 a 2.000 x g per 1 min a 4 °C, aspirare ed eliminare il surnatante. Mantieni i campioni sul ghiaccio.

3. Isolamento dell'RNA

1. Etichettare due provette da 1,5 mL per campione per isolare l'RNA piccolo e l'RNA grande nelle fasi successive e aggiungere 2 μL di soluzione endovenosa per via endovenosa a ciascuna provetta, da utilizzare nelle fasi 3.5 e 3.8.
2. Preparare la soluzione di miscelazione master aggiungendo 10 μL di mi-solution I e 240 μl di mi-solution II dal kit RIP-assay, per campione, a una provetta da 1,5 mL e mantenere la provetta a temperatura ambiente.
3. Aggiungere 250 μl della miscela master a ciascuna provetta contenente complessi anticorpi anti-Ago2 immobilizzati e Ago2 (preparati al punto 2.3.8), vortice e centrifugare a 2.000 x g per 1 minuto a temperatura ambiente.
4. Aggiungere 150 μl di mi-solution III nella stessa provetta e mescolare bene. Quindi centrifugare a 2.000 x g per 2 minuti a temperatura ambiente. Il surnatante in questa fase contiene RNA grande oltre all'RNA piccolo (cioè RNA totale).
5. Trasferire con cautela il surnatante nella provetta contenente 2 μl di mi-soluzione IV, preparata al punto 3.1. Evitare di contaminare il surnatante con perle che interferiscono con la qRT-PCR.
6. Aggiungere 300 μl di 2-popanolo ghiacciato a ciascuna provetta contenente RNA totale, vortex, spin down e incubare a -20 °C per 2 ore per una precipitazione ottimale di RNA di grandi dimensioni.
7. Dopo l'incubazione a -20 °C, centrifugare i campioni a 12.000 x g per 10 minuti a 4 °C per separare gli RNA piccoli e grandi, contenuti rispettivamente nel surnatante e nel pellet. Mantenere i pellet sul ghiaccio fino al passaggio 3.11.
8. Trasferire il surnatante con piccoli RNA nella provetta preparata al punto 3.1 (contenente 2 μL di soluzione di mi IV) e aggiungere 500 μL di 2-propanolo ghiacciato, vortex e spin down.
9. Incubare i surnatanti durante la notte a -20 °C per una precipitazione ottimale di piccoli RNA.
10. Il giorno successivo, estrarre le provette contenenti piccoli RNA dal congelatore a -20 °C e centrifugare a 12.000 x g per 10 minuti a 4 °C. Aspirare il surnatante, senza disturbare il pellet, e lavare il pellet contenente la maggior parte del piccolo RNA seguendo il passaggio 3.11.
11. Sciacquare il pellet contenente RNA grande (passaggio 3.7) e RNA piccolo (passaggio 3.10) con 500 μL di etanolo ghiacciato al 70%, ciascuno. Mescolare lentamente il pellet con etanolo ghiacciato al 70% e centrifugare a 12.000 x g per 3 minuti a 4 °C. Aspirare con cura il surnatante, senza disturbare il pellet. Ripetere nuovamente il processo di lavaggio.
12. Aspirare l'etanolo rimanente con una pipetta di volumi più piccoli (10 μL o 20 μL) e lasciarlo asciugare all'aria per 30 minuti a temperatura ambiente in un ambiente privo di RNasi.
13. Ricostituire i pellet di RNA piccolo e grande aggiungendo 50 μL di acqua priva di nucleasi e riscaldando a 65 °C per 5 minuti. Quindi conservare l'RNA a -80 °C fino a nuovo utilizzo dopo aver controllato la qualità e la concentrazione dell'RNA mediante nanodrop.

4. Quantificazione di miRNA mediante reazione a catena quantitativa della polimerasi trascrittasi inversa (qRT-PCR)

1. Preparazione del cDNA attraverso la trascrizione inversa di miRNA con primer specifici per miRNA con anse a stelo
   NOTA: La rilevazione dell'RNA mediante qRT-PCR standard richiede un modello di almeno due volte la lunghezza del primer diretto o inverso, ciascuno lungo circa 20 nucleotidi. Pertanto, la lunghezza minima è di almeno 40 nucleotidi, rendendo i piccoli RNA troppo corti per il rilevamento. Il protocollo descrive i primer RT (Table of Materials) specifici per i miRNA contenenti una struttura stem-loop altamente stabile che allunga il cDNA bersaglio. Il primer per PCR in avanti aggiunge ulteriore lunghezza con nucleotidi che ottimizzano la sua temperatura di fusione e migliorano la specificità del test. L'innesco inverso interrompe l'anello dello stelo¹³. Il seguente protocollo descrive la RT dell'RNA in cDNA per miR-145-5p, miR-143-5p e miR-154-5p utilizzando il kit di trascrizione inversa del miRNA (Tabella dei materiali).
   1. Preparare una miscela master per ciascun miRNA aggiungendo 100 mM di dNTP (0,3 μL), trascrittasi inversa (2 μL), 10x tampone RT (3 μL), inibitore della RNasi (0,38 μL), primer ad anello specifico per miRNA (6 μL) e acqua priva di nucleasi (8,32 μL). Il volume combinato della miscela master è di 20 μl.
   2. Aggiungere 10 μL di small RNA dal passaggio 3.13 (50-100 ng) a tre provette separate da 200 μL per ciascun cDNA di miR-145-5p, miR-143-5p e miR-154-5p.
   3. Aggiungere la miscela master al piccolo RNA, mescolare delicatamente e centrifugare sul fondo delle provette. Tenere i tubi sul ghiaccio fino al caricamento nel termociclatore.
   4. Impostare il programma nel termociclatore per ciclo singolo come tenere premuto a 16 °C per 30 min, tenere premuto a 42 °C per 30 min, tenere premuto a 85 °C per 5 min e tenere premuto a 4 °C. Impostare il volume di reazione su 30,0 μl. Vedere il passaggio 4.1.6.1.
   5. Caricare i tubi di reazione nel termociclatore. Avviare l'esecuzione RT. Vedere il passaggio 4.1.6.2.
   6. Accendere il termociclatore e posizionare le provette nel vassoio. Mostrerà che "Il sistema si sta avviando, attendere". Fare clic su Sfoglia/Nuovi metodi. Salva il metodo e usalo in un altro esperimento sfogliando il menu. Selezionare dall'elenco dei metodi salvati in precedenza e avviare l'esecuzione o creare un "nuovo" metodo. Apparirà la schermata del metodo "modifica esecuzione" o "nuovo" metodo.
      1. Modificare la temperatura e i cicli come indicato al punto 4.1.4. Aggiungi o rimuovi fasi e passaggi facendo clic su una fase o un passaggio specifico e quindi facendo clic sul pulsante Aggiungi o Elimina. Fare clic su Salva o eseguire direttamente il programma. In Save Run Method, assegnare un nome al metodo "run", impostare il volume di reazione (30 μL), impostare la temperatura del coperchio su 105 °C, salvare ed uscire.
      2. Quando viene visualizzata la schermata "sfoglia metodo di esecuzione", selezionare il metodo salvato dall'elenco "metodo di esecuzione". Fare clic su Avvia esecuzione e confermare nuovamente il volume di reazione e la temperatura del coperchio. Fare clic su Avvia esecuzione ora. Lo schermo mostrerà sample temperatura, temperatura di copertura e tempo rimanente. Registrare l'ora di inizio e di fine dopo il completamento e rimuovere i tubi dal termociclatore.
         NOTA: Le provette contenenti cDNA possono essere conservate a -20 °C fino al loro ulteriore utilizzo per la qPCR dei miRNA.
2. qPCR con i primer forward/reverse specifici per miRNA e le sonde di idrolisi
   NOTA: Il seguente protocollo è per la qPCR di miR-145-5p, miR-143-5p e miR-154-5p utilizzando cDNA specifici per miRNA preparati nel passaggio 4.1. Il test per miRNA in provetta singola (20x) contiene primer forward/reverse specifici per miRNA e una sonda per idrolisi (Tabella dei materiali). Il primer diretto aggiunge nucleotide per aumentare la lunghezza e ottimizzare la temperatura di fusione, mentre il primer inverso interrompe il ciclo dello stelo del cDNA¹³. L'Universal PCR Master Mix (Table of Materials) fornisce i componenti aggiuntivi necessari per la qPCR. La reazione (20 μL) avviene in triplicato per ogni miRNA.
   1. Preparare una master mix separata per miR-145-5p, miR-143-5p e miR-154-5p in triplati utilizzando il rispettivo saggio di miRNA (20x) (1 μL), 2x Universal PCR Master Mix (No AmpErase UNG; 10 μL) e acqua priva di nucleasi (7,5 μL). Il volume totale per una reazione è di 18,5 μl.
   2. Aggiungere il cDNA specifico del miRNA (1,5 μL) preparato in 4.1 a ciascun pozzetto della piastra PCR in triplicati.
   3. Aggiungere la master mix specifica per miRNA (18,5 μL) preparata al punto 4.2.1 ai pozzetti della piastra PCR contenente il rispettivo cDNA (1,5 μL).
   4. Sigillare la piastra con il sigillante appropriato ed eseguire la qPCR per 45 cicli su un termociclatore qPCR (Tabella dei materiali). Impostare la temperatura del ciclo come mantenimento a 95 °C per 10 min, seguita da 45 ripetizioni di 95 °C per 15 secondi (s) e 60 °C per 60 s. Vedere il passaggio 4.2.6.
   5. Impostare manualmente le linee di base della curva qPCR per piastra e le soglie standardizzate per tutte le esecuzioni qPCR in un punto in cui l'amplificazione diventa logaritmica per tutti i campioni.
   6. Accendere il termociclatore e posizionare la piastra PCR nel vassoio. La macchina termociclatrice funziona con il software installato sul computer in dotazione. Fare clic sull'icona del software di sistema.
      1. Fare clic su Crea nuovo documento o Apri documento esistente (se è presente un documento salvato in precedenza). Verrà visualizzata la procedura guidata Nuovo documento. Il saggio sarà "curva standard (quantificazione assoluta)". Fare clic su Avanti.
      2. Aggiungere un nuovo rilevatore. Assegna un nome al rilevatore come miR-143, miR-145 e miR-154 uno per uno facendo clic su Crea un altro. Seleziona la tintura del reporter come "FAM" per tutti e fai clic su Ok. Quindi trova il nome come miR-143, miR-145 e miR-154 e aggiungili nel documento del rilevatore facendo clic su Aggiungi. Quindi fare clic su Avanti.
      3. Apparirà "Set up sample plate". Selezionare i pozzetti per un rivelatore e quindi fare clic su Usa per selezionare il rivelatore corrispondente. Quindi fare clic su Fine. Apparirà l'inizializzazione del sistema.
      4. Vai allo strumento e imposta stage, temperatura e tempo come indicato al punto 4.2.4. Impostare il volume del campione su 20 μl. Avviare quindi l'esecuzione facendo clic su Avvia. Quindi salvare la targa con un nome nella posizione desiderata. Il tempo stimato verrà visualizzato sullo schermo vicino al pulsante di avvio. Annota l'ora.
      5. Al termine, vai su File | Esportazione | Risultati e salvare i risultati come valori CT nella posizione desiderata. I valori CT saranno in .csv file. Aprilo e copia i valori in un foglio di calcolo.
   7. Sottrarre la media del ciclo di soglia triplicato (Ct) dei campioni trattati con controllo del veicolo dal Ct medio dei campioni trattati con TGF-β1 per calcolare il ΔCt. Infine, calcolare la variazione di piega (FC) dei livelli di miRNA utilizzando la formula ^2-ΔCt. La trasformazione log2 del valore FC può essere utilizzata per la rappresentazione grafica.

Abbiamo precedentemente dimostrato che il TGF-β1 aumenta i livelli cellulari totali di miR-145-5p, miR-143-5p e miR-154-5p nelle cellule CFBE41o-³. Successivamente, abbiamo impiegato il saggio Ago2-miRNA-co-IP per chiarire gli effetti funzionali del TGF-β1 su questi miRNA. Il reclutamento RISC di miR-145-5p, miR-143-5p e miR-154-5p è stato studiato in cellule CFBE41o- che esprimono stabilmente il regolatore della conduttanza transmembrana della fibrosi cistica (WT) o CFTR mutante con la delezione della fenilalanina in posizione 508 (F508del)-CFTR^14,15. Le colture di interfaccia aria-liquido delle cellule WT- o F508del-CFBE41o- sono state trattate con TGF-β1 o veicolo per 24 ore. Le cellule sono state lisate e l'Ago2 endogeno è stato immunoprecipitato e rilevato mediante western blotting con l'anticorpo monoclonale primario di topo anti-Ago2 alla diluizione di 1:3000 seguito dall'anticorpo secondario anti-perossidasi di rafano di topo. La quantificazione dell'immunoprecipitazione di Ago2 è stata eseguita mediante densitometria utilizzando ImageJ con esposizioni all'interno dell'intervallo dinamico lineare del film. L'abbondanza di Ago2 immunoprecipitato è stata calcolata dopo aver sottratto il fondo e normalizzato in WCL Ago2. La co-immunoprecipitazione di miR-145-5p, miR-143-5p e miR-154-5p con Ago2 è stata rilevata mediante qRT-PCR utilizzando primer staminali specifici per miRNA per la preparazione del cDNA, seguita dalla PCR con i primer diretti e inversi specifici per miRNA e sonde di idrolisi TaqMan. Le medie tra i gruppi sono state calcolate mediante il test t di studente a due code. I dati sono presentati come media ± S.E.M. L'abbondanza della proteina Ago2 e la sua efficienza di immunoprecipitazione erano simili nelle linee cellulari trattate con TGF-β1 o con veicolo (Figura 1A-1C). miR-145-5p e miR-143-5p erano presenti nei complessi co-immunoprecipitati con Ago2 nelle cellule che esprimono WT- e F508del-CFTR (Figura 1D-1E). Il TGF-β1 ha aumentato la co-immunoprecipitazione di miR-145-5p e miR-143-5p con Ago2 in entrambe le linee cellulari, rispetto al controllo del veicolo. miR-154-5p co-immunoprecipitato con Ago2 ma TGF-β1 non ha influenzato l'abbondanza del pool attivo di miR-154-5p, rispetto al controllo del veicolo (Figura 1F). Nel loro insieme, i risultati di cui sopra dimostrano che il TGF-β1 può aumentare il livello totale di miRNA cellulari senza influenzare il suo pool funzionale. Il test Ago2-miRNA-co-IP ha aumentato la nostra comprensione degli effetti distinti del TGF-β1 sui miRNA.

Figura 1. Riassunto del saggio Ago2-miRNA-co-IP che mostra che il TGF-β1 ha mediato il reclutamento selettivo di specifici miRNA per RISC nelle cellule WT- e F508del-CFBE41o-. (A) L'Ago2 endogeno è stato immunoprecipitato (IP) da lisati di cellule intere (WCL) di cellule CFBE41o- che esprimono WT- o F508del-CFTR con l'anticorpo anti-Ago2 o IgG2 non immune (un controllo negativo) e rilevato mediante western blotting (WB). Sono mostrati WB rappresentativi di cellule che esprimono WT-CFTR. La banda non specifica nei campioni IP è contrassegnata da un asterisco. Immagini rappresentative del WB (B) e riassunto dei dati (C) che mostrano che il TGF-β1 non ha avuto alcun effetto sull'abbondanza di Ago2 in WCL e non ha modificato l'efficienza di Ago2 IP. (D-F) dati qRT-PCR che mostrano il co-IP di miRNA con Ago2 endogeno. I valori Ct di miR-145 (miR-145-5p) nelle cellule trattate con veicolo sono stati sottratti dai valori Ct di miR-145 nelle cellule trattate con TGF-β1 per generare ΔCts. La variazione di piega (FC) nel livello di miR-145 tra i campioni è stata determinata utilizzando l'equazione 2^−ΔCt ed espressa come Log2 FC rispetto al veicolo. Il TGF-β1 ha aumentato il co-IP del miR-145 (D) e del miR-143 (miR-143-5p) (E) con Ago2 nelle cellule WT- e F508del-CFBE41o- e non ha influenzato il co-IP del miR-154 (miR-154-5p) (F). Barre di errore, S.E.M. N = 10/gruppo. * p < 0,05. (Questa è una figura rappresentativa adattata da un manoscritto 3 precedentemente^pubblicato). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Il test Ago2-miRNA-co-IP è progettato per studiare il pool attivo di miRNA in risposta al trattamento con TGF-β1. I miRNA attivi o associati a RISC sono importanti per comprendere il loro potenziale inibitorio per l'mRNA^{bersaglio 4}. Panshin et al. hanno recentemente dimostrato che l'efficienza dell'immunoprecipitazione di Ago2 e dei miRNA può dipendere dal protocollo¹⁶. Ci sono diverse differenze tra il protocollo qui e i dati sopra pubblicati. Il protocollo qui è stato ottimizzato per le celle CFBE41o. Al contrario, Panshin et al. hanno studiato l'IP Ago2 nel plasma umano o nelle cellule HEK293. Abbiamo immunoprecipitato Ago2 con anticorpi monoclonali di topo, anticorpi Ago2 umani, sottoclasse IgG2, coniugati con perle di agarosio di proteina G. Panshin et al. hanno utilizzato anticorpi policlonali anti-Ago2 coniugati con perle di agarosio di proteina A, che possono indurre variabilità tra i pool di miRNA immunoprecipitati¹⁶. Le perle di proteina A non si legano a tutte le sottoclassi di IgG umane con la stessa efficienza della proteina G¹⁷. Abbiamo controllato la sottoclasse IgG2 dell'anticorpo anti-Ago2 utilizzando il controllo IgG2 negativo non specifico. Utilizzando lo stesso protocollo IP, abbiamo esaminato gli effetti del TGF-β1 sul pool di miRNA associati a RISC.

Abbiamo introdotto diverse modifiche al kit del saggio RIP per ottimizzare l'immunoprecipitazione e l'isolamento dell'RNA per studiare il reclutamento dei miRNA indotto dal TGF-β1 nel RISC. In primo luogo, abbiamo utilizzato un volume maggiore di PBS per il lavaggio completo della perla di agarosio proteica G. In secondo luogo, abbiamo ridotto del 50% la quantità di anticorpi anti-Ago2 e il tampone di lavaggio per ridurre i costi. In terzo luogo, abbiamo eseguito tutte le fasi a una temperatura fredda unificata e abbiamo aggiunto un tampone di lisi a freddo direttamente sulle celle. In quarto luogo, non abbiamo isolato l'RNA pre-immunoprecipitazione per la quantificazione dei miRNA perché abbiamo già pubblicato i dati sull'espressione dei miRNA nel lisato di cellule intere di CFBE41o-³. Altri metodi, come l'immunoprecipitazione della proteina legante l'RNA basata su biglie magnetiche, possono essere utilizzati per esaminare l'mRNA. Tuttavia, i metodi basati su biglie magnetiche non possono mirare specificamente al componente di RISC e quindi potrebbero non essere appropriati per valutare il pool attivo di miRNA.

Vorremmo evidenziare diverse condizioni critiche per il successo del saggio Ago2-miRNA-co-IP. L'efficiente coniugazione dell'anticorpo anti-Ago2 con le perle di agarosio della proteina G è il primo passo critico. Successivamente, l'efficiente pull-down di Ago2 da WCL con l'anticorpo anti-Ago2 immobilizzato è il passo successivo. Le celle lisate contengono detriti, che devono essere rimossi in modo efficiente attraverso la centrifugazione per evitare interferenze con il pull-down Ago2. Durante la raccolta del surnatante contenente lisato cellulare si deve prestare attenzione in modo che il pellet contenente detriti cellulari non si stacchi e si mescoli con il surnatante. La fase di pre-clearing prima dell'immunoprecipitazione è necessaria anche per rimuovere qualsiasi legame non specifico delle proteine alle perle vuote (perle non coniugate con l'anticorpo). La scelta dell'isolamento dell'RNA pre-immunoprecipitazione dovrebbe essere determinata in base all'esperimento. L'isolamento dell'RNA pre-immunoprecipitazione è stato omesso e qui abbiamo esaminato l'effetto del TGF-β1 sul reclutamento RISC dei miRNA. Il miRNA FC co-immunoprecipitato dopo il trattamento con TGF-β1 rispetto al controllo del veicolo fornisce prove convincenti del reclutamento di miRNA da parte del TGF-β1 in RISC. La temperatura di lavoro ha un ruolo cruciale e tutte le fasi durante l'immunoprecipitazione di Ago2 devono essere eseguite su ghiaccio o a 4 °C per evitare la degradazione o la denaturazione delle proteine e dell'RNA associati a RISC. Tutte le ulteriori fasi che coinvolgono l'eluizione dell'RNA dalle perle devono essere eseguite a una temperatura simile perché l'attività della RNasi, un enzima ubiquitario e responsabile della rapida degradazione dell'RNA, è ottimale a temperatura ambiente. Si consiglia vivamente l'uso di un ambiente privo di RNasi, comprese le apparecchiature, i puntali, le provette, le pipette e il piano di lavoro. Indossare i guanti in nitrile privi di RNasi, senza polvere, cambiati frequentemente, dovrebbe essere praticato durante ogni passo. Si raccomanda di conservare immediatamente l'RNA a -80 °C dopo l'eluizione. La contaminazione con perle di agarosio può causare problemi durante la preparazione del cDNA e può influenzare la quantificazione relativa di miRNA o mRNA durante la qRT-PCR. La coltura cellulare richiede un'attenzione particolare e deve essere monitorata attentamente. Le piastre di coltura tissutale devono essere rivestite con collagene per aumentare l'aderenza cellulare e promuovere la differenziazione delle cellule epiteliali. Abbiamo eseguito il saggio Ago2-miRNA-co-IP nel modello cellulare CFBE41o-.

Il limite del protocollo è che è molto sensibile alla variazione del numero di cellule utilizzate. Il numero di cellule deve essere controllato con precisione e l'immunoprecipitazione di Ago2 deve essere ottimizzata in base all'input cellulare per prevenire la saturazione dell'Ago2 immunoprecipitato con miRNA. In futuro, il test potrebbe essere applicabile in diversi contesti sperimentali, come il knockdown genico e per esaminare il pool attivo di miRNA in diversi modelli di malattia. Il test può essere ottimizzato per l'uso con altri modelli cellulari epiteliali e non epiteliali, comprese le cellule primarie o i modelli animali.

Gli autori dichiarano di non avere alcun interesse finanziario in competizione e di non avere nulla da rivelare.

Ringraziamo John Wakefield di Tranzyme, Inc. (Birmingham, AL) che ha generato le celle CFBE41o- e J.P. Clancy di CFFT che ha fornito le celle. Questa ricerca è stata finanziata dal National Institutes of Health R01HL144539 e R56HL127202 (ad AS-U) e dalla Cystic Fibrosis Foundation grant SWIATE18G0.