Анализ Ago2-miRNA-co-IP для изучения TGF-β1-опосредованного рекрутинга микроРНК в RISC в клетках CFBE

В данной работе мы описываем анализ Ago2-miRNA-co-IP, предназначенный для количественной оценки активного пула специфических микроРНК, индуцированных TGF-β1 в эпителиальных клетках бронхов человека CFBE41o-. Этот анализ предоставляет функциональную информацию о рекрутировании микроРНК в индуцированный РНК комплекс сайленсинга, количественно оцененный с помощью qRT-PCR с использованием специфических праймеров микроРНК и зондов гидролиза TaqMan.

Микро(ми)РНК — это короткие, некодирующие РНК, которые опосредуют РНК-интерференцию (РНК-интерференцию) с помощью посттранскрипционных механизмов. Специфические микроРНК рекрутируются в индуцированный цитоплазматической РНК сайленсинговый комплекс (RISC). Аргонауте2 (Ago2), важный компонент RISC, способствует связыванию микроРНК с сайтом-мишенью на мРНК с последующим расщеплением дуплекса микроРНК-мРНК с его эндонуклеазной активностью. РНК-интерференция опосредована определенным пулом микроРНК, рекрутируемых в RISC, и поэтому называется функциональным пулом. На клеточные уровни многих микроРНК влияет цитокин, трансформирующий фактор роста-β1 (TGF-β1). Тем не менее, мало что известно о том, влияет ли TGF-β1 на функциональные пулы этих микроРНК. Анализ Ago2-miRNA-co-IP, обсуждаемый в данной рукописи, предназначен для изучения влияния TGF-β1 на рекрутирование микроРНК в RISC и помогает определить, коррелируют ли изменения в уровнях клеточных микроРНК с изменениями в RISC-ассоциированных функциональных пулах. Общие принципы проведения пробы заключаются в следующем. Культивируемые клетки, обработанные TGF-β1 или контролем носителей, лизируют, а эндогенный Ago2 иммунопреципитируют иммобилизованным антителом против Ago2, а активные микроРНК, объединенные с Ago2, выделяют с помощью набора для иммунопреципитации RISC (RIP). МикроРНК идентифицируют с помощью количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой (qRT-PCR) с использованием специфичных для микроРНК стволовых закольцованных праймеров во время обратной транскрипции, за которой следует ПЦР с использованием прямых и обратных праймеров, специфичных для микроРНК, и зондов гидролиза TaqMan.

Трансформирующий фактор роста-β1 (TGF-β1) является многофункциональным цитокином, который может изменять экспрессию многих микро(ми)РНК ^1,2,3. Общий клеточный уровень конкретной микроРНК не коррелирует с ее ингибирующим потенциалом, поскольку только определенная фракция микроРНК включается в индуцированный РНК сайленсинговый комплекс (RISC) для выполнения РНК-интерференции (РНК)³. Только до 10% каждой микроРНК является RISC-ассоциированной и участвует в РНК-интерференции ^4,5. Далее, процесс РНК-интерференции включает связывание RISC-ассоциированной микроРНК с последовательностью (последовательностями) узнавания мРНК6. На ассоциацию RISC влияет доступность мРНК-мишени и комплементарность микроРНК к сайту связывания, обычно присутствующей в 3'-нетранслируемой области (UTR) мРНК⁴. Анализ аргонауте2-микроРНК-ко-иммунопреципитации (Ago2-miRNA-co-IP), описанный в данной рукописи, предназначен для изучения влияния TGF-β1 на рекрутирование специфических микроРНК в RISC путем выявления различий в RISC-ассоциированных микроРНК после лечения TGF-β1 по сравнению с контролем носителя. Изучение RISC-ассоциированного функционального пула конкретной микроРНК гораздо более информативно о микроРНК-эффектах, чем изучение общего клеточного уровня микроРНК. RISC состоит из белков, которые сканируют сайт связывания на целевой мРНК и расщепляют дуплекс микроРНК-мРНК. Argonaute2 (Ago2) является основным компонентом RISC. Из пяти изоформ Ago (Ago1-Ago5) Ago2 является единственной, которая обладает эндонуклеазной активностью и участвует в РНК-интерференции в клетках человека 7,8,9,10. Комплекс Ago2-miRNA-RISC является функциональной единицей для микроРНК-опосредованной посттранскрипционной репрессии мРНК¹¹. Ago2-ассоциированная микроРНК представляет собой нативное состояние микроРНК в ответ на внутриклеточную или внеклеточную сигнализацию. Таким образом, иммунопреципитация эндогенного Ago2 дает прекрасную возможность для обнаружения активной, RISC-ассоциированной фракции специфической микроРНК, а также для функциональной оценки ее мишеней. Этот анализ превосходит вытягивание эндогенных мРНК-мишеней с помощью имитаций биотинилированных микроРНК из-за непредсказуемой эффективности клеточного поглощения молекул биотинилированных нуклеиновых кислот и их побочных эффектов.

Анализ Ago2-miRNA-co-IP, обсуждаемый в данной рукописи, был оптимизирован для определения влияния TGF-β1 на рекрутирование микроРНК RISC в иммортализированных бронхиальных эпителиальных клетках CFBE41o-клеток бронхов человека3. Компоненты набора для анализа RIP были использованы для проведения анализа Ago2-miRNA-co-IP с изменениями в протоколе, предоставленном производителем. Для выделения малых и больших РНК был использован метод разделения, в котором малые РНК использовались для количественного определения микроРНК с помощью количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой (qRT-PCR) с использованием специфичных для микроРНК стволовых зацикленных праймеров во время обратной транскрипции, с последующей ПЦР с использованием специфичных для микроРНК прямых и обратных праймеров и зондов гидролиза TaqMan.

1. Подготовка к эксперименту

1. Засевающие ячейки
   1. Приготовьте 10% раствор коллагена I в среде Minimal Essential Medium (MEM) и добавьте 500 μL в каждый фильтр клеточных культур диаметром 24 мм в 6-луночном планшете. Распределите, чтобы покрыть всю поверхность фильтра, осторожно вращая рукой. Фильтры инкубируют под воздействием ультрафиолетового излучения в ламинарном проточном колпаке при комнатной температуре в течение 30 минут (мин), а затем инкубируют в инкубаторе для клеточных культур при температуре 37 °C в течение 1 ч.
   2. Приготовьте среду для культивирования клеток (МЭМ, газообразный_СО2 в течение 20 мин, 10% фетальная сыворотка крупного рогатого скота (FBS), 50 ЕД/мл пенициллина, 50 ЕД/мл стрептомицина, 2 мМ L-глутамина, 0,5 мкг/мл пуромицина).
   3. Достаньте из инкубатора фильтры, покрытые коллагеновой оболочкой (шаг 1.1.1) и отсосите излишки коллагена. Добавьте 1,5 мл среды для культивирования клеток (шаг 1.1.2) на базолатеральную сторону и 0,5 мл на апикальную сторону (на фильтр) в 6-луночный планшет.
   4. Семена 1 x 10⁶ CFBE41o-клеток¹² суспендированы в 500 мкл среды для культивирования клеток. Осторожно поверните планшет вручную, чтобы равномерно распределить клетки по фильтрам, и инкубируйте в инкубаторе для клеточных культур при температуре 37 °C с 5%_CO2.
   5. Удалите среду с апикальной стороны через день после посева клеток и продолжайте культивирование клеток на границе воздух-жидкость (без среды на апикальной стороне). Ежедневно меняйте базолатеральную среду и проводите эксперимент на^8-й день.
2. Лечение клеток TGF-β1 или контроль транспортного средства
   1. Приготовьте среду для культивирования клеток, не содержащую FBS (среда без FBS): Газообразьте MEM с 5%_CO2 в течение 20 минут, добавьте 50 Ед/мл пенициллина, 50 Ед/мл стрептомицина и 2 мМ L-глутамина и простерилизуйте среду фильтром.
   2. Приготовьте управление транспортным средством: добавьте 20 мкл 1 М HCl и 5 мг BSA в 5 мл двойной дистиллированной воды (4 мМ HCl с 1 мг/мл BSA) для получения 1 нг/мкл исходного раствора. Фильтруйте, простерилизуйте смесь перед использованием.
   3. Приготовление раствора TGF-β1: Восстановите 1 г лиофилизированного TGF-β1 в 1 мл стерильно отфильтрованного носителя (4 мМ HCl и 1 мг/мл BSA) с получением 1 нг/мкл исходного раствора. Аликвоту в небольших объемах и хранить при температуре -20 °С.
   4. Приготовьте рабочую концентрацию TGF-β1 или vehicle control в концентрации 15 нг/мл среды, не содержащей FBS (добавьте 15 μл раствора TGF-β1 или транспортного средства control stock на мл среды, не содержащей FBS). Отсасывайте среду для культивирования клеток с базолатеральной стороны и добавляйте TGF-β1 или среду, содержащую контрольный носитель, за 24 ч до эксперимента.
3. Приготовление буферов для лизиса клеток и иммунопреципитации
   1. Приготовьте микролизисный буфер (+) для лизиса клеток. Добавьте 1 таблетку ингибитора протеазы мини и 15 мкл 1 М DTT на 10 мл объема в микролизисный буфер, входящий в комплект для анализа RIP.
   2. Приготовьте микробуфер (+) для промывки белка агарозными шариками. Добавьте 52,5 мкл 1 М DTT на 35 мл объема в буфер mi-Wash, входящий в комплект RIP-Assay Kit.
4. Конъюгация антитела Anti-Ago2 с белком агарозы G
   1. Промойте отдельно две аликвоты по 30 мкл суспензии из агарозных гранул белка G (50%), повторив следующую процедуру три раза: добавьте 100 мкл ледяного PBS, аккуратно перемешайте, центрифугируйте при 2000 x g в течение 1 минуты и отсосите надосадочную жидкость пипеткой объемом 200 μл.
   2. Промойте шарики один раз 100 μL ледяного mi-Wash Buffer (+), отсосите надосадочную жидкость пипеткой 200 μL и добавьте 500 μL mi-Wash Buffer (+) в шарики и аккуратно перемешайте. Держите трубки на льду.
   3. Добавьте 7,5 мкг мышиного моноклонального (IgG2) антитела против человеческого EIF2C2 (Ago2) или неспецифического мышиного IgG2 (отрицательный контроль) в суспензию гранул белка G в буфере mi-Wash (+).
   4. Инкубируйте пробирки в течение ночи, вращаясь со скоростью 8 оборотов в минуту (об/мин) в холодном помещении.

2. Иммунопреципитация Ago2

1. Лизис клеток
   1. Принесите планшет с клетками, культивируемыми на фильтрах 24 мм, из инкубатора для клеточных культур и быстро переложите фильтры на тарелку на льду, наполненную ледяным ПБС. Дайте PBS перелиться в апикальную сторону фильтров, чтобы покрыть ячейки.
   2. По одной стороне отсасывайте от PBS и дважды промойте апикальную и базолатеральную стороны ледяным PBS.
   3. Отсасывайте все PBS, добавьте в клетки 300 μл ледяного буфера для микролизиса (+), соскребите клетки и переложите в пробирку объемом 1,5 мл, помеченную для соответствующего состояния обработки (TGF-β1 или контроль транспортного средства).
   4. Добавьте 200 μL микролизисного буфера (+) в каждую пробирку и тщательно перемешайте.
   5. Инкубируйте трубки на льду в течение 15 минут.
   6. Центрифугируйте пробирку при давлении 14 000 x g в течение 10 минут при 4 °C, соберите надосадочную жидкость в виде лизата клеток и держите на льду.
2. Предварительное очищение клеточного лизата неконъюгированным белком G-агарозы
   1. Промойте 30 μL свежего белка G кашицы из агарозных шариков (50%) в пробирке объемом 1,5 мл 3 раза 100 μL PBS (шаг 1.4.1) и удалите излишки PBS.
   2. Один раз промойте шарики 500 μL mi-Wash Buffer (+) и один раз 500 μL mi-Lysis Buffer (+). Удалите лишний буфер.
   3. Добавьте лизат клеток из шага 2.1.6 в пробирки, содержащие неконъюгированные гранулы белка G.
   4. Вращайте (8 об/мин) пробирки в течение 1 часа в холодильной камере, чтобы предварительно очистить клеточные лизаты.
   5. После предварительной очистки центрифугируйте пробирки при давлении 2 000 x g в течение 1 минуты при 4 °C. Соберите предварительно очищенный лизат в качестве надосадочной жидкости в свежие пробирки и держите на льду.
   6. Готовят предиммунопреципитационный лизат цельных клеток (WCL) для обнаружения белка Ago2 методом вестерн-блоттинга. Возьмите 10 μL предварительно очищенных лизатов и добавьте 10 μL буфера для образца (с 10% DTT), нагрейте до 85 °C в течение 4 минут, охладите на стенде и храните при -20 °C.
3. Иммунопреципитация комплексов Ago2 с антителами анти-Ago2, иммобилизованными на гранулах агарозы белка G
   1. Центрифугируют антитело против Ago2, конъюгированное с гранулами белка G, приготовленными на стадии 1.4.4, при 2000 x g в течение 1 мин при 4°С, удаляют надосадочную жидкость и выбрасывают. Промойте шарики один раз 500 μL mi-Lysis Buffer (+), центрифугируйте как раньше и снова выбросьте надосадочную жидкость.
   2. Смешайте 500 мкл предварительно очищенных лизатов клеток с этапа 2.2.6 с антителом против Ago2, конъюгированным с гранулами белка G, и инкубируйте в течение 3 часов вращения (8 об/мин) в холодильной камере.
   3. Перенесите пробирки из холодильной камеры на льду на стол и центрифугируйте при температуре 2 000 x g в течение 1 минуты при температуре 4 °C. Затем удалите и выбросьте надосадочную жидкость.
   4. Промойте шарики агарозы белка G иммобилизованными комплексами анти-Ago2 антитела-Ago2, содержащими ко-иммунопреципитированные микроРНК, 1 мл буфера mi-Wash (+), центрифугируйте при 2000 x g в течение 1 мин при 4 °C и выбросьте надосадочную жидкость. Повторите этот процесс дважды.
   5. Ресуспендируйте гранулы с помощью 1 мл mi-Wash Buffer (+) и возьмите 100 мкл суспензии в новую пробирку для образцов белка после иммунопреципитации для вестерн-блоттинга.
   6. Центрифугируйте пробирки при давлении 2 000 x g в течение 1 минуты при 4 °C и выбросьте надосадочную жидкость.
   7. Добавьте 20 μL буфера для образцов (10% DTT), нагрейте в течение 5 минут при 85 °C, перемешайте и центрифугируйте при 2000 x g в течение 1 минуты при комнатной температуре. Хранить образцы при температуре -20 °C.
   8. Центрифугируйте пробирки с оставшимися 900 мкл иммобилизованных комплексов антител-Ago2-Ago2 с этапа 2.3.5 при 2000 x g в течение 1 мин при 4°С, отсасывайте и выбрасывайте надосадочную жидкость. Храните образцы на льду.

3. Выделение РНК

1. Пометьте две пробирки объемом 1,5 мл на образец для выделения малых и крупных РНК на следующих этапах и добавьте 2 мкл микрораствора внутривенно в каждую пробирку, чтобы использовать их на этапах 3.5 и 3.8.
2. Приготовьте исходный раствор смеси, добавив 10 мкл mi-раствора I и 240 мкл mi-раствора II из набора для RIP-анализа на образец в пробирку объемом 1,5 мл и держите пробирку при комнатной температуре.
3. Добавьте 250 мкл исходной смеси в каждую пробирку, содержащую иммобилизованные комплексы антител-Ago2-Ago2 (приготовленные на стадии 2.3.8), вортекс и центрифугируйте при 2000 x g в течение 1 мин при комнатной температуре.
4. Добавьте в ту же пробирку 150 μL mi-solution III и хорошо перемешайте. Затем центрифугируйте при 2000 х г в течение 2 минут при комнатной температуре. Надосадочная жидкость на этой стадии содержит большую РНК в дополнение к малой РНК (т.е. общей РНК).
5. Осторожно перенесите надосадочную жидкость в пробирку, содержащую 2 мкл микрораствора в/в, приготовленного на шаге 3.1. Избегайте загрязнения надосадочной жидкости шариками, которые могут помешать qRT-PCR.
6. Добавьте 300 μL ледяного 2-попанола в каждую пробирку, содержащую общую РНК, вортекс, спин вниз и инкубируйте при -20 °C в течение 2 ч для оптимального осаждения больших РНК.
7. После инкубации при -20 °C образцы центрифугируют при 12 000 x g в течение 10 мин при 4 °C для разделения малых и крупных РНК, содержащихся в надосадочной жидкости и грануле соответственно. Держите гранулы на льду до шага 3.11.
8. Перенесите надосадочную жидкость с малыми РНК в пробирку, приготовленную на шаге 3.1 (содержащую 2 мкл микрораствора внутривенно) и добавьте 500 мкл ледяного 2-пропанола, вихря и уменьшите температуру.
9. Инкубируйте надосадочную жидкость в течение ночи при температуре -20 °C для оптимального осаждения малых РНК.
10. На следующий день достаньте пробирки, содержащие малые РНК, из морозильной камеры при температуре -20 °C и центрифугируйте при 12 000 x g в течение 10 минут при 4 °C. Аспирируйте надосадочную жидкость, не повреждая гранулу, и промойте гранулу, содержащую большую часть малой РНК, следуя шагу 3.11.
11. Промойте гранулу, содержащую крупную РНК (шаг 3.7) и малую РНК (шаг 3.10) с 500 μл ледяного 70% этанола каждая. Медленно смешайте гранулу с ледяным 70% этанолом, а затем центрифугируйте при 12 000 x g в течение 3 минут при 4 °C. Осторожно отсасывайте надосадочную жидкость, не нарушая гранулы. Повторите процесс стирки еще раз.
12. Отсадите оставшийся этанол с помощью пипетки меньшего объема (10 мкл или 20 мкл) и дайте высохнуть на воздухе в течение 30 минут при комнатной температуре в среде, свободной от РНКазы.
13. Восстановите малую РНК и крупные гранулы РНК, добавив 50 мкл воды, свободной от нуклеаз, и нагревая при 65 °C в течение 5 минут. Затем храните РНК при температуре -80 °C до дальнейшего использования после проверки качества и концентрации РНК с помощью нанокапель.

4. Количественное определение микроРНК методом количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой (qRT-PCR)

1. Получение кДНК путем обратной транскрипции микроРНК с помощью специфичных для микроРНК стволовых закольцованных праймеров
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для детектирования РНК с помощью стандартной qRT-PCR требуется матрица, длина которой не менее чем в два раза превышает длину прямого или обратного праймера, длина каждого из которых составляет примерно 20 нуклеотидов. Таким образом, минимальная длина составляет не менее 40 нуклеотидов, что делает малые РНК слишком короткими для обнаружения. Протокол описывает специфичные для микроРНК ОТ-праймеры (Таблица материалов), содержащие высокостабильную структуру стволовой петли, которая удлиняет целевую кДНК. Праймер для прямой ПЦР увеличивает длину с нуклеотидами, что оптимизирует температуру плавления и повышает специфичность анализа. Обратный капсюль нарушает петлю штока¹³. В приведенном ниже протоколе описывается ОТ РНК к кДНК для miR-145-5p, miR-143-5p и miR-154-5p с использованием набора для обратной транскрипции микроРНК (Таблица материалов).
   1. Приготовьте мастер-смесь для каждой микроРНК, добавив 100 мМ dNTP (0,3 мкл), обратную транскриптазу (2 мкл), 10x RT-буфер (3 мкл), ингибитор РНКазы (0,38 мкл), специфичный для микроРНК петлевой праймер (6 мкл) и свободную от нуклеазы воду (8,32 мкл). Общий объем мастер-смеси составляет 20 μл.
   2. Добавьте 10 мкл малой РНК с шага 3.13 (50-100 нг) в три отдельные пробирки по 200 мкл для каждой кДНК miR-145-5p, miR-143-5p и miR-154-5p.
   3. Добавьте мастер-смесь к мелкой РНК, аккуратно перемешайте и открутите на дно пробирок. Держите трубки на льду до загрузки в термоамплификатор.
   4. Установите программу в термоамплификаторе для одного цикла: удерживайте при 16 °C в течение 30 минут, держите при 42 °C в течение 30 минут, держите при 85 °C в течение 5 минут и держите при 4 °C. Установите реакционный объем на 30,0 μл. Смотрите шаг 4.1.6.1.
   5. Загрузите реакционные трубки в термоамплификатор. Запустите прогон RT. Смотрите шаг 4.1.6.2.
   6. Включите термоамплификатор и поместите пробирки в лоток. Он покажет, что "Система загружается, пожалуйста, подождите". Нажмите на кнопку Обзор/Новые методы. Сохраните метод и используйте его в другом эксперименте, просмотрев меню. Либо выберите из списка сохраненных ранее методов и запустите запуск, либо создайте "новый" метод. Появится экран метода "edit run" или "new" method.
      1. Отредактируйте температуру и циклы, как указано в шаге 4.1.4. Добавляйте или удаляйте этапы и шаги, нажимая на определенный этап или шаг, а затем нажимая на кнопку «Добавить или удалить». Нажмите « Сохранить » или напрямую запустите программу. В поле Save Run Method укажите метод "run", установите объем реакции (30 μL), установите температуру крышки на 105 °C, сохраните и выйдите.
      2. Когда появится экран "Обзор метода выполнения", выберите сохраненный метод из списка "Метод выполнения". Нажмите Start Run и снова подтвердите объем реакции и температуру покрытия. Нажмите « Начать запуск сейчас». На экране будет отображаться температура образца, температура покрытия и оставшееся время. Запишите время запуска и остановки после завершения и снимите трубки с термоамплификатора.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Пробирки, содержащие кДНК, могут храниться при температуре -20 °C до их дальнейшего использования для количественной ПЦР микроРНК.
2. кПЦР с помощью специфичных для микроРНК прямых/обратных праймеров и зондов гидролиза
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол предназначен для количественной ПЦР miR-145-5p, miR-143-5p и miR-154-5p с использованием микроРНК-специфичных кДНК, полученных на шаге 4.1. Анализ микроРНК в одной пробирке (20x) содержит специфичные для микроРНК прямые/обратные праймеры и зонд гидролиза (Таблица материалов). Прямой праймер добавляет нуклеотид для увеличения длины и оптимизации температуры плавления, в то время как обратный праймер разрушает стволовую петлю кДНК¹³. Универсальная смесь для ПЦР (Таблица материалов) содержит дополнительные компоненты, необходимые для количественной ПЦР. Реакцию (20 мкл) проводят в трех экземплярах для каждой микроРНК.
   1. Приготовьте отдельную мастер-смесь для miR-145-5p, miR-143-5p и miR-154-5p в трех экземплярах с использованием соответствующего анализа микроРНК (20x) (1 μL), 2x Universal PCR Master Mix (No AmpErase UNG; 10 μL) и воды, не содержащей нуклеазы (7,5 μL). Общий объем для одной реакции составляет 18,5 мкл.
   2. Добавьте микроРНК-специфичную кДНК (1,5 мкл), приготовленную в 4,1 раза, в каждую лунку ПЦР-планшета в трех экземплярах.
   3. Добавьте специфичную для микроРНК мастер-смесь (18,5 мкл), приготовленную на шаге 4.2.1, в лунки ПЦР-планшета, содержащие соответствующую кДНК (1,5 мкл).
   4. Запечатайте пластину с помощью соответствующего герметика и запустите qPCR в течение 45 циклов на термоамплификаторе qPCR (Таблица материалов). Установите температуру цикла на уровне 95 °C в течение 10 минут, а затем 45 повторов при температуре 95 °C в течение 15 секунд (с) и при 60 °C в течение 60 секунд. Смотрите шаг 4.2.6.
   5. Установите базовые линии кривой количественной ПЦР вручную для каждого планшета и стандартизированные пороговые значения для всех прогонов количественной ПЦР в точке, в которой амплификация становится логарифмической для всех образцов.
   6. Включите термоамплификатор и поместите ПЦР-планшет в лоток. Термоамплификатор работает с программным обеспечением, установленным на прилагаемом компьютере. Нажмите на иконку системного программного обеспечения.
      1. Нажмите « Создать новый документ» или «Открыть существующий документ » (если есть ранее сохраненный документ). Появится новый мастер документов. Тест будет проводиться по принципу «стандартная кривая (абсолютная количественная оценка)». Нажмите на кнопку «Далее».
      2. Добавьте новый детектор. Назовите детектор как miR-143, miR-145 и miR-154 один за другим, нажав кнопку Создать другой. Выберите репортерский краситель как "FAM" для всех и нажмите Ok. Затем найдите названия miR-143, miR-145 и miR-154 и добавьте их в документ детектора, нажав кнопку Добавить. Затем нажмите «Далее».
      3. Появится надпись «Настроить образец пластины». Выберите скважины для детектора, а затем нажмите « Использовать », чтобы выбрать соответствующий детектор. Затем нажмите « Готово». Появится инициализация системы.
      4. Перейдите в раздел Instrument (Прибор ) и установите стадию, температуру и время, как указано в шаге 4.2.4. Установите объем образца на 20 μл. Затем запустите прогон, нажав кнопку «Старт». Затем сохраните табличку с именем в нужном месте. Расчетное время будет отображаться на экране рядом с кнопкой запуска. Запишите время.
      5. После завершения перейдите в раздел Файл | Экспорт | Результаты и сохраните результаты в виде значений CT в нужном месте. Значения CT будут находиться в .csv файлах. Откройте его и скопируйте значения в файл электронной таблицы.
   7. Для расчета ΔCt вычтите среднее значение тройного порогового цикла (Ct) образцов, обработанных контрольным транспортным средством, из среднего значения Ct образцов, обработанных TGF-β1. Наконец, рассчитают кратное изменение (FC) уровней микроРНК по формуле ^2-ΔCt. Преобразование log2 значения FC может быть использовано для графического представления.

Ранее мы показали, что TGF-β1 увеличивает общий клеточный уровень микроРНК miR-145-5p, miR-143-5p и miR-154-5p в клетках CFBE41o-3. Затем мы использовали анализ Ago2-miRNA-co-IP для выяснения функциональных эффектов TGF-β1 на эти микроРНК. Рекрутирование RISC miR-145-5p, miR-143-5p и miR-154-5p изучалось в клетках CFBE41o-, стабильно экспрессирующих трансмембранный регулятор проводимости (CFTR) дикого типа (WT)-муковисцидоз или мутантный CFTR с делецией фенилаланина в позиции 508 (F508del)-CFTR^14,15. Культуры воздушно-жидкостных границ раздела клеток WT- или F508del-CFBE41o-обрабатывали TGF-β1 или носителем в течение 24 ч. Клетки лизировали, а эндогенный Ago2 иммунопреципитировали и обнаруживали методом вестерн-блоттинга первичным мышиным моноклональным антителом против Ago2 в разведении 1:3000 с последующим добавлением вторичного антитела против пероксидазы хрена у мыши. Количественное определение иммунопреципитации Ago2 проводили методом денситометрии с использованием ImageJ с экспозицией в линейном динамическом диапазоне пленки. Обилие иммунопреципитированного Ago2 рассчитывали после вычитания фона и нормализации до WCL Ago2. Ко-иммунопреципитация miR-145-5p, miR-143-5p и miR-154-5p с Ago2 определяли с помощью qRT-PCR с использованием микроРНК-специфичных стволовых петлевых праймеров для получения кДНК с последующей ПЦР с прямыми и обратными праймерами, специфичными для miRNA, и зондами гидролиза TaqMan. Средние значения между группами рассчитывали с помощью двустороннего t-критерия Стьюдента. Данные представлены в виде среднего значения ± S.E.M. Распространенность белка Ago2 и его эффективность иммунопреципитации были сходными в клеточных линиях TGF-β1 или клеточных линиях, обработанных носителями (рис. 1A–1C). miR-145-5p и miR-143-5p присутствовали в комплексах, ко-иммунопреципитированных с Ago2 в клетках, экспрессирующих WT- и F508del-CFTR (рис. 1, D-1E). TGF-β1 увеличивал ко-иммунопреципитацию miR-145-5p и miR-143-5p с Ago2 в обеих клеточных линиях по сравнению с контролем носителя. miR-154-5p ко-иммунопреципитированный с Ago2, но TGF-β1 не влиял на содержание активного пула miR-154-5p по сравнению с контрольным автомобилем (рис. 1F). В совокупности вышеуказанные результаты демонстрируют, что TGF-β1 может увеличивать общий уровень клеточной микроРНК без влияния на ее функциональный пул. Анализ Ago2-miRNA-co-IP расширил наше понимание различных эффектов TGF-β1 на микроРНК.

Рисунок 1. Резюме анализа Ago2-miRNA-co-IP, показывающее, что TGF-β1 опосредует селективный рекрутинг специфических микроРНК в RISC в клетках WT- и F508del-CFBE41o-. (A) Эндогенный Ago2 иммунопреципитировался (IP) из цельноклеточных лизатов (WCL) клеток CFBE41o-, экспрессирующих либо WT- или F508del-CFTR с антителом против Ago2, либо неиммунным IgG2 (отрицательный контроль) и обнаруживался с помощью вестерн-блоттинга (WB). Показаны репрезентативные WB из клеток, экспрессирующих WT-CFTR. Неспецифическая полоса в образцах IP помечена звездочкой. Репрезентативные изображения WB (B) и сводка данных (C), показывающие, что TGF-β1 не оказывает влияния на содержание Ago2 в WCL и не изменяет эффективность Ago2 IP. (D-F) данные кОТ-ПЦР, показывающие со-IP микроРНК с эндогенным Ago2. Значения Ct miR-145 (miR-145-5p) в клетках, обработанных носителями, были вычтены из значений Ct miR-145 в клетках, обработанных TGF-β1, для получения ΔCts. Кратное изменение (FC) уровня miR-145 между образцами определяли с помощью уравнения 2^−ΔCt и выражали как Log2 FC в зависимости от носителя. TGF-β1 увеличивал со-IP miR-145 (D) и miR-143 (miR-143-5p) (E) с Ago2 в клетках WT- и F508del-CFBE41o-и не влиял на со-IP miR-154 (miR-154-5p) (F). Погрешности, S.E.M. N = 10/группа. * p < 0,05. (Это репрезентативная цифра, адаптированная из ранее опубликованной рукописи³). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Анализ Ago2-miRNA-co-IP предназначен для исследования активного пула микроРНК в ответ на лечение TGF-β1. Активные или RISC-ассоциированные микроРНК важны для понимания их ингибиторного потенциала для целевой мРНК⁴. Panshin et al. недавно показали, что эффективность иммунопреципитации Ago2 и микроРНК может зависеть от протокола¹⁶. Существует несколько отличий между приведенным здесь протоколом и вышеуказанными опубликованными данными. Протокол здесь был оптимизирован для CFBE41o-элементов. В отличие от них, Паньшин и др. изучали Ago2 IP в плазме крови человека или клетках HEK293. Мы иммунопреципитировали Ago2 мышиным моноклональным, античеловеческим антителом Ago2, подкласса IgG2, конъюгированным с белком агарозы G. Panshin et al. использовали поликлональные антитела против Ago2, конъюгированные с шариками агарозы белка А, которые могут индуцировать вариабельность между пулами иммунопреципитированных микроРНК¹⁶. Гранулы белка А не связываются со всеми подклассами IgG человека так же эффективно, как белок G¹⁷. Мы контролировали подкласс IgG2 антитела против Ago2 с использованием неспецифического отрицательного контроля IgG2. Используя тот же протокол IP, мы изучили эффекты TGF-β1 на пул микроРНК, ассоциированный с RISC.

Мы внесли несколько модификаций в набор для анализа RIP для оптимизации иммунопреципитации и выделения РНК для изучения индуцированного TGF-β1 набора RISC микроРНК. Во-первых, мы использовали больший объем PBS для полной промывки белка G агарозного шарика. Во-вторых, мы уменьшили количество антител против Ago2 и буфера для промывки на 50%, чтобы снизить стоимость. В-третьих, мы выполнили все этапы при единой холодной температуре и добавили буфер для холодного лизиса непосредственно на клетки. В-четвертых, мы не выделили преиммунопреципитацию РНК для количественного определения микроРНК, поскольку мы уже опубликовали данные об экспрессии микроРНК в лизате целых клеток CFBE41o-3^. Для исследования мРНК можно использовать и другие методы, такие как иммунопреципитация белка, связывающего РНК на основе магнитных шариков. Тем не менее, методы, основанные на магнитных шариках, не могут быть специфически нацелены на компонент RISC и, таким образом, могут быть неподходящими для оценки активного пула микроРНК.

Мы хотели бы выделить несколько условий, имеющих решающее значение для успеха анализа Ago2-miRNA-co-IP. Эффективная конъюгация антитела против Ago2 с белком агарозы G является первым важным шагом. Следующим шагом является эффективное извлечение Ago2 из WCL с помощью иммобилизованного антитела к Ago2. Лизированные клетки содержат мусор, который должен быть эффективно удален с помощью центрифугирования, чтобы предотвратить вмешательство в вытягивание Ago2. При сборе надосадочной жидкости, содержащей клеточный лизат, необходимо соблюдать осторожность, чтобы гранула, содержащая клеточный мусор, не вытеснялась и не смешивалась с надосадочной жидкостью. Стадия предварительного очищения перед иммунопреципитацией также необходима для удаления любого неспецифического связывания белков с пустыми шариками (гранулами, не конъюгированными с антителом). Выбор выделения РНК перед иммунопреципитацией должен быть определен в соответствии с экспериментом. Выделение РНК пре-иммунопреципитации было опущено, и здесь мы рассмотрели влияние TGF-β1 на рекрутирование микроРНК в RISC. Ко-иммунопреципитированная микроРНК ФК после лечения TGF-β1 по сравнению с контролем носителя дает убедительные доказательства рекрутирования микроРНК TGF-β1 в RISC. Рабочая температура играет решающую роль, и все этапы иммунопреципитации Ago2 должны выполняться на льду или при 4 °C, чтобы избежать деградации или денатурации RISC-ассоциированных белков и РНК. Все дальнейшие шаги, связанные с элюированием РНК из гранул, должны выполняться при одинаковой температуре, поскольку активность РНКазы, фермента, распространенного повсеместно и ответственного за быструю деградацию РНК, оптимальна при комнатной температуре. Настоятельно рекомендуется использовать среду, свободную от РНКазы, включая оборудование, наконечники, трубки, пипетки и настольные приборы. Ношение нитриловых перчаток без РНКазы, опухрения, часто меняемых, следует практиковать на каждом этапе. Рекомендуется сразу после элюирования хранить РНК при температуре -80 °C. Контаминация шариками агарозы может вызвать проблемы во время подготовки кДНК и может повлиять на относительную количественную оценку микроРНК или мРНК во время кОТ-ПЦР. Культура клеток требует особого внимания и должна тщательно контролироваться. Чашки для культивирования тканей должны быть покрыты коллагеном для повышения адгезии клеток и стимулирования дифференцировки эпителиальных клеток. Мы провели анализ Ago2-miRNA-co-IP в модели CFBE41o-клеток.

Ограничением протокола является то, что он очень чувствителен к изменению количества используемых клеток. Количество клеток должно быть точно контролируемо, а иммунопреципитация Ago2 должна быть оптимизирована в соответствии с входом клеток, чтобы предотвратить насыщение иммунопреципитированного Ago2 микроРНК. В будущем этот анализ может быть применим в нескольких экспериментальных условиях, таких как нокдаун генов и изучение активного пула микроРНК в различных моделях заболеваний. Анализ может быть оптимизирован для использования с другими моделями эпителиальных и неэпителиальных клеток, включая первичные клетки или животные модели.

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов, и им нечего раскрывать.

Мы благодарим Джона Уэйкфилда из компании Tranzyme, Inc. (Бирмингем, штат Алабама), который создал элементы CFBE41o-, и Дж.. Клэнси из компании CFFT, предоставившего клетки. Это исследование финансировалось грантами Национальных институтов здравоохранения R01HL144539 и R56HL127202 (для A.S.-U.) и грантом Фонда муковисцидоза SWIATE18G0.