CFBE 세포에서 RISC에 대한 miRNA의 TGF-β1 매개 모집을 연구하기 위한 Ago2-miRNA-co-IP 분석

여기에서는 인간 기관지 상피 CFBE41o- 세포에서 TGF-β1에 의해 유도된 특정 miRNA의 활성 풀을 정량화하도록 설계된 Ago2-miRNA-co-IP 분석에 대해 설명합니다. 이 분석은 특정 miRNA 프라이머 및 TaqMan 가수분해 프로브를 사용하여 qRT-PCR로 정량화한 RNA 유도 침묵 복합체에 대한 miRNA 동원에 대한 기능 정보를 제공합니다.

Micro(mi)RNA는 전사 후 메커니즘에 의해 RNA 간섭(RNAi)을 매개하는 짧고 코딩되지 않은 RNA입니다. 특정 miRNA는 세포질 RNA 유도 침묵 복합체(RISC)에 모집됩니다. RISC의 필수 구성 요소인 Argonaute2(Ago2)는 mRNA의 타겟 부위에 miRNA의 결합을 촉진한 다음 miRNA-mRNA 듀플렉스를 엔도뉴클레아제 활성으로 절단합니다. RNAi는 RISC에 모집된 miRNA의 특정 풀에 의해 매개되며, 따라서 기능 풀(functional pool)이라고 합니다. 많은 miRNA의 세포 수준은 사이토카인 형질전환 성장 인자-β1(TGF-β1)의 영향을 받습니다. 그러나 TGF-β1이 이러한 miRNA의 기능적 풀에 영향을 미치는지 여부에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 이 원고에서 논의된 Ago2-miRNA-co-IP 분석은 RISC로의 miRNA 모집에 대한 TGF-β1의 효과를 조사하기 위해 고안되었으며 세포 miRNA 수준의 변화가 RISC 관련 기능 풀의 변화와 상관관계가 있는지 여부를 결정하는 데 도움이 됩니다. 분석의 일반적인 원리는 다음과 같습니다. TGF-β1 또는 vehicle control로 처리된 배양된 세포를 용해하고 내인성 Ago2를 고정화된 anti-Ago2 항체로 면역침전시키며, Ago2와 복합체를 이룬 활성 miRNA를 RISC 면역침전(RIP) 분석 키트로 분리합니다. miRNA는 역전사 중 miRNA 특이적 줄기 루프 프라이머를 사용한 정량적 역전사효소 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR)으로 식별된 후 miRNA 특이적 정방향 및 역방향 프라이머를 사용한 PCR과 TaqMan 가수분해 프로브로 식별됩니다.

Transforming Growth Factor-β1 (TGF-β1)은 많은 micro(mi)RNA ^1,2,3의 발현을 변화시킬 수 있는 다기능 사이토카인입니다. 특정 miRNA의 총 세포 수준은 miRNA의 특정 분획만 RNA 유도 침묵 복합체(RISC)에 통합되어 RNA 간섭(RNAi⁾³을 수행하기 때문에 억제 전위와 상관관계가 없습니다. 각 miRNA의 최대 10%만이 RISC와 연관되어 있으며 RNAi ^4,5에 참여합니다. 다음으로, RNAi 프로세스는 RISC 관련 miRNA를 타겟 mRNA 인식 서열에 결합하는 것을 포함합니다⁶. RISC 연관성은 타겟 mRNA의 가용성과 일반적으로 mRNA⁴의 3' 미번역 영역(UTR)에 존재하는 결합 부위에 대한 miRNA 상보성의 영향을 받습니다. 본 원고에 기술된 Argonaute2-miRNA-co-immunoprecipitation (Ago2-miRNA-co-IP) assay는 TGF-β1 처리 후 RISC 관련 miRNA의 차이를 검출하여 비히클 대조군과 비교하여 TGF-β1이 RISC에 특이적 miRNA의 모집에 미치는 영향을 조사하기 위해 고안되었습니다. 특정 miRNA의 RISC 관련 기능 풀을 검사하는 것은 miRNA의 전체 세포 수준을 검사하는 것보다 miRNA 효과에 대해 훨씬 더 많은 정보를 제공합니다. RISC는 타겟 mRNA의 결합 부위를 스캔하고 miRNA-mRNA 듀플렉스를 절단하는 단백질로 구성됩니다. Argonaute2(Ago2)는 RISC의 주성분입니다. 5 개의 Ago 동형 (Ago1-Ago5) 중 Ago2는 엔도뉴클레아제 활성을 가지며 인간 세포에서 RNAi에 참여하는 유일한 것입니다 ^7,8,9,10. Ago2-miRNA-RISC 복합체는 miRNA 매개 전사 후 mRNA 억제를 위한 기능 단위입니다¹¹. Ago2 관련 miRNA는 세포 내 또는 세포 외 신호에 반응하는 miRNA의 고유 상태를 나타냅니다. 따라서 내인성 Ago2의 면역침전은 특정 miRNA의 활성 RISC 관련 분획과 그 표적의 기능 평가를 검출할 수 있는 훌륭한 기회를 제공합니다. 이 분석은 비오틴화된 핵산 분자의 세포 흡수의 예측할 수 없는 효율과 이탈(off-target) 효과로 인해 비오틴화된 miRNA 모방을 사용한 내인성 표적 mRNA의 풀다운(pull-down)보다 우수합니다.

이 원고에서 논의된 Ago2-miRNA-co-IP 분석은 불멸화된 인간 기관지 상피 CFBE41o- 세포에서 miRNA의 RISC 모집에 대한 TGF-β1의 효과를 결정하기 위해 최적화되었습니다³. RIP 분석 키트의 구성 요소는 제조업체에서 제공한 프로토콜을 수정하여 Ago2-miRNA-co-IP 분석을 수행하는 데 사용되었습니다. 분리 방법을 사용하여 작은 RNA와 큰 RNA를 분리했으며, 역전사 중 miRNA 특이적 줄기 루프 프라이머를 사용하여 정량적 역전사 효소 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR)을 통해 miRNA를 정량화한 다음 miRNA 특이적 정방향 및 역방향 프라이머와 TaqMan 가수분해 프로브를 사용한 PCR을 사용하여 miRNA를 정량화했습니다.

1. 실험 전 준비 사항

1. 세포 파종
   1. MEM(Minimal Essential Medium)에서 10% 콜라겐 I 용액을 준비하고 6웰 플레이트의 각 24mm 세포 배양 필터에 500μL를 추가합니다. 손으로 부드럽게 회전하여 필터의 전체 표면을 덮도록 분배합니다. 실온에서 30분(분) 동안 층류 후드의 자외선 아래에서 필터를 배양한 다음 37°C의 세포 배양 인큐베이터에서 1시간 동안 배양합니다.
   2. 세포 배양 배지(20분 동안 CO₂ 로 가스화된 MEM, 10% 소 태아 혈청(FBS), 50 U/mL 페니실린, 50 U/mL 스트렙토마이신, 2 mM L-글루타민, 0.5 μg/mL 푸로마이신)을 준비합니다.
   3. 인큐베이터에서 콜라겐 코팅 필터(단계 1.1.1)를 가져와 여분의 콜라겐을 흡입합니다. 6-well 플레이트의 기저측 측에 1.5mL의 세포 배양 배지(단계 1.1.2)를 추가하고 0.5mL를 6웰 플레이트의 정점 측(필터에 연결)에 추가합니다.
   4. CFBE41o- 세포¹²의 시드 1 x 10⁶을 세포 배양 배지 500μL에 현탁시킵니다. 플레이트를 손으로 부드럽게 회전하여 세포를 필터에 고르게 분포시키고 37°C의 세포 배양 인큐베이터에서 5% CO₂로 배양합니다.
   5. 세포를 씨를 뿌리기 1 일 후에 정점 측에서 매체를 제거하고 공기 액체 공용영역에 있는 세포 배양을 계속하십시오 (정점 측에 매체 없음). 기저측 배지를 매일 교체하고^8일째 에 실험을 수행합니다.
2. TGF-β1을 이용한 세포 처리 또는 Vehicle Control
   1. FBS가 없는 세포 배양 배지(FBS-free medium)를 준비합니다: 20분 동안 5%_CO2 가 포함된 MEM을 가스화하고 50U/mL 페니실린, 50U/mL 스트렙토마이신 및 2mM L-글루타민을 첨가하고 배지를 필터 멸균합니다.
   2. 차량 제어 준비: 5mL의 이중 증류수(1mg/mL BSA가 있는 4mM HCl)에 1M HCl 20μL와 BSA 5mg을 추가하여 1ng/μL 원액을 얻습니다. 필터는 사용하기 전에 혼합물을 살균하십시오.
   3. TGF-β1 용액 준비: 1 μg의 동결건조된 TGF-β1을 멸균 여과된 비히클 1mL(4 mM HCl 및 1 mg/mL BSA)에 재구성하여 1 ng/μL 원액을 얻습니다. 소량으로 부분 표본을 추출하고 -20 °C에서 보관하십시오.
   4. FBS가 없는 배지 15ng/mL에서 TGF-β1 또는 차량 제어의 작업 농도를 준비합니다(FBS가 없는 배지 mL당 TGF-β1 또는 차량 제어 원액 15μL 추가). 기저측 측에서 세포 배양 배지를 흡입하고 실험 24시간 전에 TGF-β1 또는 비히클 컨트롤 함유 배지를 첨가합니다.
3. 세포 용해 및 면역침전을 위한 완충액 준비
   1. 세포 용해를 위한 mi-Lysis buffer(+)를 준비합니다. 프로테아제 억제제 미니 1정과 10mL 부피당 1M DTT 15μL를 RIP-Assay Kit에 제공된 mi-Lysis buffer에 추가합니다.
   2. 단백질 G 아가로스 비드를 세척하기 위한 mi-Wash 버퍼(+)를 준비합니다. 35mL 부피당 52.5μL의 1M DTT를 RIP-Assay Kit에 제공된 mi-Wash 버퍼에 추가합니다.
4. Anti-Ago2 항체와 단백질 G 아가로스 비드의 접합
   1. 다음 절차를 3회 반복하여 30μL 분취량의 단백질 G 아가로스 비드 슬러리(50%) 2개를 따로 세척합니다: 100μL의 얼음처럼 차가운 PBS를 첨가하고, 부드럽게 혼합한 다음, 2,000 x g 에서 1분 동안 원심분리하고, 200μL 피펫으로 상층액을 흡입합니다.
   2. 100μL의 얼음처럼 차가운 mi-Wash Buffer(+)로 비드를 한 번 세척하고 200μL 피펫으로 상층액을 흡입한 다음 500μL의 mi-Wash Buffer(+)를 비드에 첨가하고 부드럽게 혼합합니다. 튜브를 얼음 위에 두십시오.
   3. 7.5μg의 마우스 단클론(IgG2), 항인간 EIF2C2(Ago2) 항체( 재료 표 참조) 또는 비특이적 마우스 IgG2(음성 대조군)를 mi-Wash 버퍼(+)의 단백질 G 비드 슬러리에 추가합니다.
   4. 튜브를 밤새 배양하고 차가운 방에서 분당 8회전(rpm)으로 회전합니다.

2. Ago2의 면역침전

1. 세포의 용해
   1. 세포 배양 인큐베이터에서 24mm 필터에서 배양된 세포가 들어 있는 플레이트를 가져와 얼음처럼 차가운 PBS로 채워진 얼음 위의 플레이트로 필터를 빠르게 옮깁니다. PBS가 세포를 덮기 위해 필터의 정점 쪽으로 넘치도록 합니다.
   2. 한 번에 한 면씩 PBS를 흡입하고 정점과 기저측을 얼음처럼 차가운 PBS로 두 번 씻습니다.
   3. 모든 PBS를 흡입하고, 세포에 300μL의 얼음처럼 차가운 mi-Lysis buffer(+)를 첨가하고, 세포를 긁어내고, 각 처리 조건(TGF-β1 또는 차량 제어)에 대해 표시된 1.5mL 튜브로 옮깁니다.
   4. 각 튜브에 200μL의 mi-Lysis buffer(+)를 추가하고 완전히 와동시킵니다.
   5. 얼음 위에서 튜브를 15분 동안 배양합니다.
   6. 튜브를 14,000 x g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리하고 상층액을 세포 용해물로 수집하고 얼음에 보관합니다.
2. unconjugated protein G agarose bead를 사용한 세포 용해물의 Preclearing
   1. 1.5mL 튜브에 신선한 단백질 G 아가로스 비드 슬러리 30μL(50%)를 100μL의 PBS로 3회 세척하고(단계 1.4.1) 과도한 PBS를 제거합니다.
   2. 500μL의 mi-Wash 버퍼(+)로 비드를 한 번 세척하고 500μL의 mi-Lysis 버퍼(+)로 한 번 세척합니다. 초과 버퍼를 제거합니다.
   3. 2.1.6단계의 세포 용해물을 비접합 단백질 G 비드가 포함된 튜브에 추가합니다.
   4. 냉장실에서 튜브를 8시간 동안 회전(1rpm)하여 세포 용해물을 미리 세척합니다.
   5. 사전 세척 후 2,000 x g 에서 4°C에서 1분 동안 튜브를 원심분리합니다. 미리 세척된 용해물을 새 튜브에 상층액으로 수집하고 얼음에 보관하십시오.
   6. 웨스턴 블로팅(western blotting)에 의한 Ago2 단백질 검출을 위해 면역침전 전세포 용해물(WCL)을 준비합니다. 사전 세정제된 용해물 10μL를 취하고 시료 완충액 10μL(10% DTT 포함)를 첨가한 후 85°C에서 4분 동안 가열한 후 벤치에서 냉각하고 -20°C에서 보관합니다.
3. 단백질 G 아가로스 비드에 고정된 항-Ago2 항체를 가진 Ago2 복합체의 면역침전
   1. 1.4.4 단계에서 준비한 단백질 G 비드에 접합된 항-Ago2 항체를 2,000 x g 에서 4°C에서 1분 동안 원심분리한 후 상등액을 제거하고 폐기합니다. 500 μL의 mi-Lysis Buffer(+)로 비드를 한 번 세척하고 이전과 같이 원심분리기를 사용한 후 상층액을 다시 폐기합니다.
   2. 2.2.6단계에서 사전 세척된 세포 용해물 500μL를 단백질 G 비드와 접합된 항-Ago2 항체와 혼합하고 냉장실에서 3시간 회전(8rpm) 동안 배양합니다.
   3. 얼음이 든 차가운 방에서 튜브를 벤치 탑으로 가져와 2,000 x g 에서 4°C에서 1분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 상층액을 제거하고 버립니다.
   4. co-immunoprecipitated miRNAs를 1mL의 mi-Wash buffer(+)와 함께 포함하는 고정된 anti-Ago2 항체-Ago2 복합체로 단백질 G agarose beads를 세척하고, 4°C에서 1분 동안 2,000 x g 에서 원심분리한 후 상등액을 폐기합니다. 이 과정을 두 번 반복합니다.
   5. 비드를 1mL의 mi-Wash Buffer(+)로 재현탁시키고 100μL의 슬러리를 웨스턴 블로팅을 위한 면역침전 후 단백질 샘플을 위한 새 튜브에 넣습니다.
   6. 2,000 x g 의 튜브를 4°C에서 1분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다.
   7. 20μL의 시료 완충액(10% DTT)을 추가하고 85°C에서 5분 동안 가열한 후 혼합하고 실온에서 1분 동안 2,000 x g 로 원심분리합니다. -20 °C에서 샘플을 보관하십시오.
   8. 2.3.5 단계에서 2.3.5 단계에서 나머지 900 μL의 고정화된 anti-Ago2 항체-Ago2 복합체가 있는 튜브를 4°C에서 1 분 동안 원 심분리한 후 흡입하여 상등액을 버립니다. 샘플을 얼음 위에 보관하십시오.

3. RNA 분리

1. 향후 단계에서 small RNA와 large RNA를 분리하기 위해 샘플당 2개의 1.5mL 튜브에 라벨을 부착하고 3.5단계 및 3.8단계에서 사용할 2μL의 mi-solution IV를 각 튜브에 추가합니다.
2. 샘플당 RIP-assay 키트의 10μL의 mi-solution I과 240μL의 mi-solution II를 1.5mL 튜브에 첨가하여 마스터 믹스 용액을 준비하고 튜브를 실온으로 유지합니다.
3. 고정화된 anti-Ago2 항체-Ago2 복합체(단계 2.3.8에서 준비), 와류 및 실온에서 1분 동안 2,000 x g 의 원심분리를 포함하는 각 튜브에 마스터 믹스 250μL를 추가합니다.
4. 동일한 튜브에 150μL의 mi-solution III을 넣고 잘 섞습니다. 그런 다음 실온에서 2,000 x g 에서 2분 동안 원심분리합니다. 이 단계에서 상등액은 작은 RNA(즉, 전체 RNA) 외에도 큰 RNA를 포함합니다.
5. 3.1단계에서 준비한 2μL의 mi-solution IV가 들어 있는 튜브에 상등액을 조심스럽게 옮깁니다. qRT-PCR을 방해하기 위해 상층액을 비드로 오염시키지 마십시오.
6. 총 RNA, 와류, 스핀 다운을 포함하는 각 튜브에 300μL의 얼음처럼 차가운 2-포판올을 추가하고 큰 RNA의 최적 침전을 위해 -20°C에서 2시간 동안 배양합니다.
7. -20 °C에서 배양 후 12,000 x g 에서 4 °C에서 10 분 동안 샘플을 원심 분리하여 상층액과 펠릿에 각각 포함 된 작은 RNA와 큰 RNA를 분리합니다. 3.11단계까지 펠릿을 얼음 위에 두십시오.
8. 작은 RNA가 있는 상등액을 3.1단계에서 준비한 튜브(2μL의 mi-solution IV 함유)로 옮기고 500μL의 얼음처럼 차가운 2-프로판올, 와류 및 스핀 다운을 추가합니다.
9. 작은 RNA의 최적 침전을 위해 -20 °C에서 밤새 상등액을 배양합니다.
10. 다음 날, -20 °C 냉동고에서 작은 RNA가 들어있는 튜브를 꺼내 12,000 x g 에서 4 °C에서 10분 동안 원심분리합니다. 펠릿을 방해하지 않고 상등액을 흡입하고 3.11 단계에 따라 대부분의 작은 RNA를 포함하는 펠렛을 세척합니다.
11. 큰 RNA(3.7단계)와 작은 RNA(3.10단계)가 포함된 펠릿을 각각 500μL의 얼음처럼 차가운 70% 에탄올로 헹굽니다. 펠릿을 얼음처럼 차가운 70% 에탄올과 천천히 혼합한 다음 12,000 x g 에서 4°C에서 3분 동안 원심분리합니다. 펠릿을 방해하지 않고 상등액을 조심스럽게 흡인합니다. 세탁 과정을 다시 한 번 반복하십시오.
12. 더 작은 부피(10 μL 또는 20 μL)의 피펫으로 잔류 에탄올을 흡입하고 RNase가 없는 환경에서 실온에서 30분 동안 자연 건조합니다.
13. 50μL의 뉴클레아제가 없는 물을 첨가하고 65°C에서 5분 동안 가열하여 작은 RNA와 큰 RNA 펠릿을 재구성합니다. 그런 다음 나노 드롭으로 RNA의 품질과 농도를 확인한 후 더 사용할 때까지 RNA를 -80 °C에서 보관하십시오.

4. 정량적 역전사효소 중합효소연쇄반응(qRT-PCR)에 의한 miRNA 정량화

1. miRNA 특이적 줄기 루프 프라이머를 사용한 miRNA의 역전사를 통한 cDNA 준비
   참고: 표준 qRT-PCR에 의한 RNA 검출에는 정방향 또는 역방향 프라이머 길이의 최소 2배의 템플릿이 필요하며, 각 프라이머는 약 20개의 뉴클레오티드 길이입니다. 따라서 최소 길이는 최소 40개의 뉴클레오티드이며, 이로 인해 작은 RNA는 검출하기에 너무 짧습니다. 이 프로토콜은 타겟 cDNA를 연장하는 매우 안정적인 줄기-루프 구조를 포함하는 miRNA 특이적 RT-프라이머(Table of Materials)를 설명합니다. forward PCR 프라이머는 용융 온도를 최적화하고 분석 특이성을 향상시키는 뉴클레오티드로 길이를 추가합니다. 리버스 프라이머는 스템 루프¹³을 방해합니다. 다음 프로토콜은 miRNA 역전사 키트(Table of Materials)를 사용하여 miR-145-5p, miR-143-5p 및 miR-154-5p에 대한 RNA에서 cDNA로의 RT를 설명합니다.
   1. 100 mM dNTPs(0.3 μL), 역전사 효소(2 μL), 10x RT 완충액(3 μL), RNase 억제제(0.38 μL), miRNA 특이적 루프 프라이머(6 μL) 및 뉴클레아제 자유 수(8.32 μL)를 추가하여 각 miRNA에 대한 마스터 믹스를 준비합니다. 마스터 믹스의 총 부피는 20μL입니다.
   2. 3.13단계(50-100ng)의 small RNA 10μL를 miR-145-5p, miR-143-5p 및 miR-154-5p의 각 cDNA에 대해 3개의 별도 200μL 튜브에 추가합니다.
   3. 마스터 믹스를 작은 RNA에 넣고 부드럽게 혼합한 다음 튜브 바닥으로 돌립니다. 열 순환기에 넣을 때까지 튜브를 얼음 위에 두십시오.
   4. 단일 사이클에 대한 열 순환기에서 프로그램을 16°C에서 30분 동안 유지, 42°C에서 30분 동안 유지, 85°C에서 5분 동안 유지, 4°C에서 유지로 설정합니다. 반응 부피를 30.0 μL로 설정합니다. 4.1.6.1단계를 참조하십시오.
   5. 반응 튜브를 열 순환기에 로드합니다. RT 실행을 시작합니다. 4.1.6.2단계를 참조하십시오.
   6. 열 순환기를 켜고 튜브를 트레이에 넣습니다. "시스템이 부팅 중입니다, 잠시 기다려 주십시오"라는 메시지가 표시됩니다. Browse/New Methods(찾아보기/새 방법)를 클릭합니다. Method를 저장하고 메뉴를 탐색하여 다른 실험에 사용하십시오. 이전에 저장된 메서드 목록에서 선택하고 실행을 시작하거나 "새" 메서드를 만듭니다. "edit run" 방법 또는 "new" 방법 화면이 나타납니다.
      1. 4.1.4단계에서 설명한 대로 온도와 주기를 편집합니다. 특정 단계 또는 단계를 클릭한 다음 추가 또는 삭제 버튼을 클릭하여 단계 및 단계를 추가하거나 제거합니다. 저장을 클릭하거나 프로그램을 직접 실행하십시오. Save Run Method에서 "run" Method의 이름을 지정하고, 반응 부피(30 μL)를 설정하고, 커버 온도를 105 °C로 설정하고, 저장한 후 종료합니다.
      2. "실행 방법 찾아보기" 화면이 나타나면 "실행 방법" 목록에서 저장된 방법을 선택합니다. Start Run 을 클릭하고 반응 부피와 커버 온도를 다시 확인합니다. 지금 실행 시작을 클릭합니다. 화면에 샘플 온도, 커버 온도 및 남은 시간이 표시됩니다. 완료 후 시작 및 중지 시간을 기록하고 열 순환기에서 튜브를 제거합니다.
         참고: cDNA를 포함하는 튜브는 miRNA의 qPCR에 더 사용할 때까지 -20°C에 보관할 수 있습니다.
2. miRNA 특이적 정방향/역방향 프라이머 및 가수분해 프로브를 사용한 qPCR
   참고: 다음 프로토콜은 4.1단계에서 준비한 miRNA 특이적 cDNA를 사용하여 miR-145-5p, miR-143-5p 및 miR-154-5p의 qPCR에 대한 것입니다. 단일 튜브 miRNA Assay(20x)에는 miRNA 특이적 정방향/역방향 프라이머와 가수분해 프로브(Table of Materials)가 포함되어 있습니다. 전방 프라이머는 뉴클레오타이드를 추가하여 길이를 늘리고 용융 온도를 최적화하며, 리버스 프라이머는 cDNA¹³의 줄기 루프를 방해합니다. Universal PCR Master Mix(Table of Materials)는 qPCR에 필요한 추가 구성 요소를 제공합니다. 반응(20μL)은 각 miRNA에 대해 3회씩 수행됩니다.
   1. 각각의 miRNA assay(20x)(1 μL), 2x Universal PCR Master Mix(No AmpErase UNG; 10 μL) 및 nuclease free water(7.5 μL)를 사용하여 miR-145-5p, miR-143-5p 및 miR-154-5p에 대한 별도의 Master Mix를 3회 준비합니다. 한 반응에 대한 총 부피는 18.5 μL입니다.
   2. PCR 플레이트의 각 웰에 4.1에서 제조된 miRNA 특이적 cDNA(1.5μL)를 3회씩 추가합니다.
   3. 단계 4.2.1에서 준비한 miRNA 특이적 마스터 믹스(18.5μL)를 각각의 cDNA(1.5μL)가 포함된 PCR 플레이트의 웰에 추가합니다.
   4. 적절한 밀봉기로 플레이트를 밀봉하고 qPCR 열순환기에서 qPCR을 45회 실행합니다(재료 표). 사이클 온도를 95°C에서 10분 동안 유지로 설정한 다음 95°C에서 15초 동안 45회, 60°C에서 60초 동안 반복합니다. 4.2.6단계를 참조하십시오.
   5. 플레이트당 qPCR 곡선 기준선을 수동으로 설정하고 증폭이 모든 샘플에 대해 로그가 되는 지점에서 모든 qPCR 실행에 대한 표준화된 임계값을 설정합니다.
   6. 열 순환기를 켜고 PCR 플레이트를 트레이에 넣습니다. 열 순환기 기계는 함께 제공되는 컴퓨터에 설치된 소프트웨어로 작동합니다. 시스템 소프트웨어의 아이콘을 클릭하십시오.
      1. 새 문서 만들기 또는 기존 문서 열기(이전에 저장한 문서가 있는 경우)를 클릭합니다. 새 문서 마법사가 나타납니다. 분석은 "표준 곡선(절대 정량화)"입니다. 다음을 클릭합니다.
      2. 새 감지기를 추가합니다. Create Another(하나 생성)를 클릭하여 감지기의 이름을 miR-143, miR-145 및 miR-154로 하나씩 지정합니다. reporter dye를 for all(모두에 대해 "FAM")으로 선택하고 Okay(확인)를 클릭합니다. 그런 다음 miR-143, miR-145 및 miR-154로 이름을 찾고 추가를 클릭하여 검출기 문서에 추가합니다. 그런 다음 다음을 클릭합니다.
      3. "샘플 플레이트 설정"이 나타납니다. 검출기의 웰을 선택한 다음 사용을 클릭하여 해당 검출기를 선택합니다. 그런 다음 마침을 클릭합니다. 시스템 초기화 중이 나타납니다.
      4. 기기로 이동하여 s를 설정합니다.tage, 온도 및 시간은 4.2.4단계에서 언급했습니다. 샘플 부피를 20μL로 설정합니다. 그런 다음 시작을 클릭하여 실행을 시작합니다. 그런 다음 원하는 위치에 이름이 있는 플레이트를 저장합니다. 예상 시간은 시작 버튼 근처의 화면에 표시됩니다. 시간을 기록해 두십시오.
      5. 완료 후 파일 | 내보내기 | 결과를 원하는 위치에 CT 값으로 저장합니다. CT 값은 .csv 파일에 있습니다. 그것을 열고 값을 스프레드시트 파일에 복사하십시오.
   7. TGF-β1 처리된 샘플의 평균 Ct에서 차량 제어 처리된 샘플의 3중 임계값 주기(Ct)의 평균을 빼서 ΔCt를 계산합니다. 마지막으로 공식 ^2-ΔCt를 사용하여 miRNA 수준의 접힘 변화(FC)를 계산합니다. FC 값의 log2 변환은 그래픽 표현에 사용할 수 있습니다.

우리는 이전에 TGF-β1이 CFBE41o- 세포에서 miR-145-5p, miR-143-5p 및 miR-154-5p miRNA의 총 세포 수준을 증가시킨다는 것을 보여주었습니다³. 다음으로, Ago2-miRNA-co-IP assay를 사용하여 이러한 miRNA에 대한 TGF-β1의 기능적 효과를 밝혔습니다. miR-145-5p, miR-143-5p 및 miR-154-5p의 RISC 모집은 508 위치 (F508del) -CFTR^14,15에서 페닐알라닌의 결실과 함께 야생형 (WT) - 낭포성 섬유증 막횡단 전도성 조절제 (CFTR) 또는 돌연변이 CFTR을 안정적으로 발현하는 CFBE41o- 세포에서 연구되었다. WT- 또는 F508del-CFBE41o- 세포의 공기-액체 계면 배양을 TGF-β1 또는 비히클로 24시간 동안 처리했습니다. 세포를 용해시키고 내인성 Ago2를 면역침전시키고 1:3000 희석시 1차 마우스 단클론 항-Ago2 항체를 사용한 웨스턴 블로팅에 의해 검출한 후 항-마우스 양고추냉이 과산화효소 2차 항체를 검출했습니다. Ago2 면역침전의 정량화는 필름의 선형 동적 범위 내에서 노출된 ImageJ를 사용하여 밀도 측정으로 수행되었습니다. 면역침전된 Ago2의 풍부도는 배경을 빼고 WCL Ago2로 정규화한 후 계산되었습니다. miR-145-5p, miR-143-5p 및 miR-154-5p와 Ago2의 동시 면역침전은 cDNA 준비를 위해 miRNA 특이적 줄기 루프 프라이머를 사용하여 qRT-PCR에 의해 검출된 후, miRNA 특이적 정방향 및 역방향 프라이머를 사용한 PCR, TaqMan 가수분해 프로브에 의해 검출되었습니다. 그룹 간의 평균은 양측 학생 t-test로 계산되었습니다. 데이터는 평균 ± S.E.M.으로 표시됩니다. Ago2 단백질 풍부도와 면역침전 효율은 TGF-β1 또는 운반체 처리된 세포주에서 유사했습니다(그림 1A–1C). miR-145-5p 및 miR-143-5p는 WT- 및 F508del-CFTR 발현 세포에서 Ago2와 함께 공동 면역 침전된 복합체에 존재했습니다(그림 1, D-1E). TGF-β1은 비히클 대조군과 비교하여 두 세포주 모두에서 Ago2와 함께 miR-145-5p 및 miR-143-5p의 동시 면역침전을 증가시켰습니다. miR-154-5p는 Ago2와 동시 면역침전을 일으켰지만 TGF-β1은 비히클 대조군과 비교하여 활성 miR-154-5p 풀의 풍부도에 영향을 미치지 않았습니다(그림 1F). 위의 결과를 종합하면 TGF-β1이 기능 풀에 영향을 주지 않고 총 세포 miRNA 수준을 증가시킬 수 있음을 보여줍니다. Ago2-miRNA-co-IP 분석은 miRNA에 대한 TGF-β1의 뚜렷한 효과에 대한 이해를 높였습니다.

그림 1. TGF-β1이 WT- 및 F508del-CFBE41o- 세포에서 RISC에 대한 특정 miRNA의 선택적 모집을 매개했음을 보여주는 Ago2-miRNA-co-IP 분석의 요약.(A) 내인성 Ago2는 항-Ago2 항체 또는 비면역 IgG2(음성 대조군)로 WT- 또는 F508del-CFTR을 발현하는 CFBE41o- 세포의 전체 세포 용해물(WCL)에서 면역침전(IP)되고 웨스턴 블로팅(WB)에 의해 검출되었습니다. 도시된 것은 WT-CFTR 발현 세포로부터의 대표적인 WB이다. IP 샘플의 불특정 밴드는 별표로 표시됩니다. 대표적인 WB 이미지(B) 및 데이터 요약(C)은 TGF-β1이 WCL의 Ago2 풍부도에 영향을 미치지 않았으며 Ago2 IP의 효율을 변화시키지 않았음을 보여줍니다. (D-F) miRNA와 내인성 Ago2의 co-IP를 보여주는 qRT-PCR 데이터. TGF-β1 처리한 세포에서 miR-145의 Ct 값에서 비히클 처리된 세포에서 miR-145(miR-145-5p)의 Ct 값을 빼서 ΔCts를 생성했습니다. 샘플 간 miR-145 수준의 폴드 변화(FC)는 방정식 ^2-ΔCt를 사용하여 결정되었으며 Log2 FC 대 차량으로 표현되었습니다. TGF-β1은 WT- 및 F508del-CFBE41o- 세포에서 miR-145 (D) 및 miR-143 (miR-143-5p) (E) Ago2와의 co-IP를 증가시켰고 miR-154 (miR-154-5p) (F)의 co-IP에 영향을 미치지 않았다. 오차 막대, S.E.M. N = 10/그룹. * p < 0.05. (이것은 이전에 출판된 원고³에서 발췌한 대표적인 그림이다.) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Ago2-miRNA-co-IP assay는 TGF-β1 처리에 대한 반응으로 miRNA의 활성 풀을 조사하도록 설계되었습니다. 활성 또는 RISC-associated miRNA는 타겟 mRNA에 대한 억제 가능성을 이해하는 데 중요합니다⁴. Panshin 등은 최근 Ago2 및 miRNA의 면역침전 효율이 프로토콜¹⁶에 따라 달라질 수 있음을 보여주었습니다. 여기의 프로토콜과 위에 게시된 데이터 사이에는 몇 가지 차이점이 있습니다. 여기서의 프로토콜은 CFBE41o- 세포에 최적화되었습니다. 이와는 대조적으로, Panshin 등은 인간 혈장 또는 HEK293 세포에서 Ago2 IP를 연구했습니다. 우리는 Ago2를 단백질 G 아가로스 비드와 접합된 마우스 단클론, 항인간 Ago2 항체, 아종 IgG2로 면역침전시켰습니다. Panshin 등은 단백질 A 아가로스 비드와 접합된 다클론 항-Ago2 항체를 사용했는데, 이는 면역침전된 miRNA 풀 간의 가변성을 유도할 수 있습니다¹⁶. 단백질 A 비드는 단백질 G¹⁷만큼 효율적으로 모든 인간 IgG 하위 분류에 결합하지 않습니다. 비특이적 IgG2 음성 대조군을 사용하여 항-Ago2 항체의 IgG2 하위 분류를 대조했습니다. 동일한 IP 프로토콜을 사용하여 RISC 관련 miRNA 풀에 대한 TGF-β1 효과를 조사했습니다.

TGF-β1 유도 RISC miRNA 동원을 연구하기 위해 면역침전 및 RNA 분리를 최적화하기 위해 RIP 분석 키트에 몇 가지 수정 사항을 도입했습니다. 먼저, 단백질 G 아가로스 비드의 완전한 세척을 위해 더 많은 양의 PBS를 사용했습니다. 둘째, 항-아고2(anti-Ago2) 항체와 세척 완충액을 50% 줄여 비용을 절감했습니다. 셋째, 모든 단계를 통일된 저온에서 수행하고 저온 용해 완충액을 세포에 직접 첨가했습니다. 넷째, CFBE41o- 세포의 전체 세포 용해물에서 miRNA 발현에 대한 데이터를 이미 발표했기 때문에 miRNA 정량화를 위해 면역침전 RNA를 분리하지 않았습니다³. 마그네틱 비드 기반 RNA 결합 단백질 면역침전과 같은 다른 방법을 사용하여 mRNA를 검사할 수 있습니다. 그러나, 마그네틱 비드 기반 방법은 RISC의 성분을 특이적으로 표적화할 수 없으므로 miRNA의 활성 풀을 평가하기에 적합하지 않을 수 있습니다.

Ago2-miRNA-co-IP 분석의 성공에 중요한 몇 가지 조건을 강조하고자 합니다. 항-Ago2 항체와 단백질 G 아가로스 비드의 효율적인 접합이 첫 번째 중요한 단계입니다. 다음으로, 고정된 항-Ago2 항체를 사용하여 WCL에서 Ago2를 효율적으로 풀다운하는 것이 다음 단계입니다. 용해된 세포에는 파편이 포함되어 있으며, 이는 Ago2 풀다운에 대한 간섭을 방지하기 위해 원심분리를 통해 효율적으로 제거되어야 합니다. 세포 용해물을 포함하는 상등액을 수집하는 동안 세포 파편이 포함된 펠릿이 떨어져 나와 상층액과 혼합되지 않도록 주의해야 합니다. 면역침전 전 투명화 단계는 빈 비드(항체와 결합되지 않은 비드)에 대한 단백질의 비특이적 결합을 제거하기 위해서도 필요합니다. 사전 면역침전 RNA 분리의 선택은 실험에 따라 결정되어야 합니다. pre-immunoprecipitation RNA의 분리는 생략하고 여기에서는 TGF-β1이 miRNA의 RISC 모집에 미치는 영향을 조사했습니다. TGF-β1 대 비히클 대조군으로 처리한 후 동시 면역침전된 miRNA FC는 TGF-β1이 RISC에 miRNA를 동원한다는 강력한 증거를 제공합니다. 작동 온도는 중요한 역할을 하며 Ago2의 면역침전 중 모든 단계는 RISC 관련 단백질 및 RNA의 분해 또는 변성을 방지하기 위해 얼음 위 또는 4°C에서 수행해야 합니다. 비드에서 RNA를 용리하는 것과 관련된 모든 추가 단계는 유비쿼터스이며 빠른 RNA 분해를 담당하는 효소인 RNase의 활성이 실온에서 최적이기 때문에 유사한 온도에서 수행해야 합니다. 장비, 팁, 튜브, 피펫 및 벤치 탑을 포함한 RNase가 없는 환경의 사용을 적극 권장합니다. 자주 교체되는 RNase free, powder free 니트릴 장갑을 착용하는 것은 모든 단계에서 연습해야 합니다. 용리 후 RNA는 즉시 -80°C에서 보관하는 것이 좋습니다. 아가로스 비드의 오염은 cDNA 준비 중에 문제를 일으킬 수 있으며 qRT-PCR 중 miRNA 또는 mRNA의 상대적 정량화에 영향을 미칠 수 있습니다. 세포 배양에는 특별한 주의가 필요하며 주의 깊게 모니터링해야 합니다. 조직 배양 접시는 세포 부착력을 높이고 상피 세포 분화를 촉진하기 위해 콜라겐으로 코팅되어야 합니다. CFBE41o- 세포 모델에서 Ago2-miRNA-co-IP assay를 수행했습니다.

프로토콜의 한계는 사용되는 셀 수의 변동에 매우 민감하다는 것입니다. 세포 수는 정밀하게 제어되어야 하며, 면역침전된 Ago2가 miRNA로 포화되는 것을 방지하기 위해 세포 입력에 따라 Ago2 면역침전을 최적화해야 합니다. 앞으로 이 분석법은 유전자 녹다운(gene knockdown)과 같은 여러 실험 환경에 적용할 수 있을 뿐만 아니라 다양한 질병 모델에서 miRNA의 활성 풀을 검사하는 데 적용할 수 있을 것입니다. 이 분석은 일차 세포 또는 동물 모델을 포함한 다른 상피 및 비상피 세포 모델과 함께 사용하도록 최적화할 수 있습니다.

저자들은 자신들은 경쟁할 만한 재정적 이해관계가 없으며, 공개할 것도 없다고 선언한다.

CFBE41o- 세포를 생성한 Tranzyme, Inc.(앨라배마주 버밍엄)의 John Wakefield와 세포를 제공한 CFFT의 J.P. Clancy에게 감사드립니다. 이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 R01HL144539 및 R56HL127202(A.S.-U.)와 낭포성 섬유증 재단(Cystic Fibrosis Foundation)의 보조금 SWIATE18G0의 지원을 받았습니다.