Der Ago2-miRNA-co-IP-Assay zur Untersuchung der TGF-β1-vermittelten Rekrutierung von miRNA an den RISC in CFBE-Zellen

Hier beschreiben wir den Ago2-miRNA-co-IP-Assay, der entwickelt wurde, um einen aktiven Pool spezifischer miRNAs zu quantifizieren, die durch TGF-β1 in humanen bronchialepithelialen CFBE41o-Zellen induziert werden. Dieser Assay liefert funktionelle Informationen über die Rekrutierung von miRNA an den RNA-induzierten Silencing-Komplex, quantifiziert durch qRT-PCR unter Verwendung spezifischer miRNA-Primer und TaqMan-Hydrolysesonden.

Micro(mi)RNAs sind kurze, nicht-kodierende RNAs, die die RNA-Interferenz (RNAi) durch posttranskriptionelle Mechanismen vermitteln. Spezifische miRNAs werden an den zytoplasmatischen RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC) rekrutiert. Argonaute2 (Ago2), ein essentieller Bestandteil von RISC, erleichtert die Bindung von miRNA an die Zielstelle auf der mRNA, gefolgt von der Spaltung des miRNA-mRNA-Duplex mit seiner Endonuklease-Aktivität. RNAi wird durch einen spezifischen Pool von miRNAs vermittelt, die für RISC rekrutiert werden, und wird daher als funktioneller Pool bezeichnet. Die zellulären Spiegel vieler miRNAs werden durch das Zytokin Transforming Growth Factor-β1 (TGF-β1) beeinflusst. Es ist jedoch wenig darüber bekannt, ob das TGF-β1 die funktionellen Pools dieser miRNAs beeinflusst. Der Ago2-miRNA-co-IP-Assay, der in diesem Manuskript besprochen wird, wurde entwickelt, um die Auswirkungen von TGF-β1 auf die Rekrutierung von miRNAs an RISC zu untersuchen und zu bestimmen, ob Veränderungen in den zellulären miRNA-Spiegeln mit Veränderungen in den RISC-assoziierten, funktionellen Pools korrelieren. Die allgemeinen Prinzipien des Assays lauten wie folgt. Kultivierte Zellen, die mit TGF-β1 oder Vehikelkontrolle behandelt wurden, werden lysiert und das endogene Ago2 wird mit immobilisiertem Anti-Ago2-Antikörper immunpräzipitiert, und die aktiven miRNAs, die mit Ago2 komplexiert sind, werden mit einem RISC-Immunpräzipitations-Assay-Kit (RIP) isoliert. Die Identifizierung der miRNAs erfolgt mittels quantitativer Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) unter Verwendung von miRNA-spezifischen Stammschleifen-Primern während der reversen Transkription, gefolgt von der PCR mit miRNA-spezifischen Forward- und Reverse-Primern und TaqMan-Hydrolysesonden.

Der transformierende Wachstumsfaktor-β1 (TGF-β1) ist ein multifunktionales Zytokin, das die Expression vieler micro(mi)RNAs verändern kann ^1,2,3. Die zelluläre Gesamtebene einer bestimmten miRNA korreliert nicht mit ihrem inhibitorischen Potenzial, da nur ein spezifischer Teil der miRNA in den RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC) eingebaut wird, um RNA-Interferenz (RNAi⁾ durchzuführen3. Nur bis zu 10% jeder miRNA sind RISC-assoziiert und an RNAi ^4,5 beteiligt. Als nächstes beinhaltet der RNAi-Prozess die Bindung der RISC-assoziierten miRNA an die Ziel-mRNA-Erkennungssequenz(en)⁶. Die RISC-Assoziation wird durch die Verfügbarkeit der Ziel-mRNA und die miRNA-Komplementarität zur Bindungsstelle beeinflusst, die normalerweise in der 3'-untranslatierten Region (UTR) der mRNA^{vorhanden ist 4}. Der in diesem Manuskript beschriebene Argonaute2-miRNA-co-Immunpräzipitationsassay (Ago2-miRNA-co-IP) wurde entwickelt, um die Wirkung von TGF-β1 auf die Rekrutierung spezifischer miRNAs für RISC zu untersuchen, indem Unterschiede in den RISC-assoziierten miRNAs nach TGF-β1-Behandlung im Vergleich zur Vehikelkontrolle nachgewiesen werden. Die Untersuchung des RISC-assoziierten Funktionspools einer spezifischen miRNA ist viel aussagekräftiger über die miRNA-Effekte als die Untersuchung der gesamten zellulären Ebene der miRNA. RISC besteht aus Proteinen, die die Bindungsstelle auf der Ziel-mRNA scannen und den miRNA-mRNA-Duplex spalten. Argonaute2 (Ago2) ist der Hauptbestandteil von RISC. Von den fünf Ago-Isoformen (Ago1-Ago5) ist Ago2 die einzige, die eine Endonuklease-Aktivität aufweist und an RNAi in menschlichen Zellen beteiligt ist 7,8,9,10. Der Ago2-miRNA-RISC-Komplex ist die funktionelle Einheit für die miRNA-vermittelte posttranskriptionelle mRNA-Repression¹¹. Die Ago2-assoziierte miRNA repräsentiert den nativen Zustand der miRNA als Reaktion auf intrazelluläre oder extrazelluläre Signalübertragung. Die Immunpräzipitation des endogenen Ago2 bietet somit eine hervorragende Möglichkeit, die aktive, RISC-assoziierte Fraktion einer spezifischen miRNA nachzuweisen und deren Ziele funktionell zu bewerten. Dieser Assay ist dem Pull-Down von endogener Ziel-mRNA mit biotinylierten miRNA-Nachahmungen überlegen, da die zelluläre Aufnahme von biotinylierten Nukleinsäuremolekülen und ihre Off-Target-Effekte unvorhersehbar sind.

Der in diesem Manuskript besprochene Ago2-miRNA-co-IP-Assay wurde optimiert, um die Auswirkungen von TGF-β1 auf die RISC-Rekrutierung von miRNAs in immortalisierten humanen Bronchialepithel-CFBE41o-Zellen zu bestimmen³. Komponenten des RIP-Assay-Kits wurden verwendet, um den Ago2-miRNA-co-IP-Assay mit Änderungen im vom Hersteller bereitgestellten Protokoll durchzuführen. Zur Isolierung kleiner und großer RNA wurde eine Trennmethode verwendet, bei der kleine RNA zur Quantifizierung der miRNA mit Hilfe der quantitativen Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) unter Verwendung von miRNA-spezifischen Stammschleifen-Primern während der reversen Transkription verwendet wurde, gefolgt von der PCR mit miRNA-spezifischen Forward- und Reverse-Primern und TaqMan-Hydrolysesonden.

1. Vorbereitung vor dem Experiment

1. Zellen aussäen
   1. Bereiten Sie 10%ige Kollagen-I-Lösung in minimalem essentiellem Medium (MEM) vor und geben Sie 500 μl zu jedem 24-mm-Zellkulturfilter in einer 6-Well-Platte. Verteilen Sie die Menge, um die gesamte Oberfläche des Filters zu bedecken, indem Sie sie vorsichtig mit der Hand drehen. Inkubieren Sie die Filter unter dem UV-Licht in der Laminar-Flow-Haube bei Raumtemperatur für 30 Minuten (min), gefolgt von der Inkubation im Zellkultur-Inkubator bei 37 °C für 1 h.
   2. Bereiten Sie das Zellkulturmedium vor (MEM, das 20 Minuten lang mit CO₂ begast wurde, 10 % fötales Kälberserum (FBS), 50 μl/ml Penicillin, 50 μl/ml Streptomycin, 2 mM l-Glutamin, 0,5 μg/ml Puromycin).
   3. Nehmen Sie die kollagenbeschichteten Filter (Schritt 1.1.1) aus dem Inkubator und saugen Sie das überschüssige Kollagen ab. Geben Sie 1,5 mL des Zellkulturmediums (Schritt 1.1.2) auf die basolaterale Seite und 0,5 mL auf die apikale Seite (auf den Filter) in die 6-Well-Platte.
   4. Seed 1 x 10⁶ CFBE41o-Zellen¹² , suspendiert in 500 μl des Zellkulturmediums. Drehen Sie die Platte vorsichtig von Hand, um die Zellen gleichmäßig auf den Filtern zu verteilen und inkubieren Sie im Zellkultur-Inkubator bei 37 °C mit 5% CO₂.
   5. Einen Tag nach der Aussaat der Zellen wird das Medium von der apikalen Seite entfernt und die Kultivierung der Zellen in der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche fortgesetzt (kein Medium auf der apikalen Seite). Wechseln Sie das basolaterale Medium täglich und führen Sie das Experiment am 8^. Tag durch.
2. Behandlung von Zellen mit TGF-β1 oder Vehicle Control
   1. FBS-freies Zellkulturmedium (FBS-freies Medium) vorbereiten: MEM mit 5 % CO₂ für 20 min Gas MEM geben, 50 U/mL Penicillin, 50 U/mL Streptomycin und 2 mM L-Glutamin zugeben und das Medium filtrieren.
   2. Fahrzeugkontrolle vorbereiten: 20 μl 1 M HCl und 5 mg BSA zu 5 mL doppelt destilliertem Wasser (4 mM HCl mit 1 mg/ml BSA) geben, um 1 ng/μl Stammlösung zu erhalten. Filter: Sterilisieren Sie die Mischung vor Gebrauch.
   3. TGF-β1-Lösung herstellen: 1 μg lyophilisiertes TGF-β1 in 1 ml sterilfiltriertem Vehikel (4 mM HCl und 1 mg/ml BSA) rekonstituieren, um 1 ng/μl Stammlösung zu erhalten. In kleinen Mengen aliquotieren und bei -20 °C lagern.
   4. Bereiten Sie die Arbeitskonzentration von TGF-β1 oder Vehikelkontrolle bei 15 ng/ml FBS-freiem Medium vor (fügen Sie 15 μl TGF-β1 oder Vehikelkontroll-Stammlösung pro ml FBS-freiem Medium hinzu). Das Zellkulturmedium von der basolateralen Seite absaugen und 24 h vor dem Experiment das TGF-β1 oder die Vehikelkontrolle mit dem Medium zugeben.
3. Aufbereitung von Puffern für die Zelllyse und Immunpräzipitation
   1. Bereiten Sie den mi-Lysis-Puffer (+) für die Zelllyse vor. Geben Sie 1 Tablette Proteasehemmer mini und 15 μl 1 M DTT pro 10 ml Volumen in den mi-Lysis-Puffer, der im RIP-Assay-Kit enthalten ist.
   2. Bereiten Sie mi-Wash Puffer (+) zum Waschen von Protein G Agarosekügelchen vor. Geben Sie 52,5 μl 1 M DTT pro 35 ml Volumen in den mi-Wash-Puffer, der im RIP-Assay-Kit enthalten ist.
4. Konjugation von Anti-Ago2-Antikörpern mit Protein-G-Agarose-Kügelchen
   1. Waschen Sie getrennt zwei 30-μl-Aliquots von Protein-G-Agarose-Bead-Slurry (50 %), indem Sie den folgenden Vorgang dreimal wiederholen: Fügen Sie 100 μl eiskaltes PBS hinzu, mischen Sie vorsichtig, zentrifugieren Sie 1 Minute lang bei 2.000 x g und saugen Sie den Überstand mit einer 200-μl-Pipette ab.
   2. Waschen Sie die Kügelchen einmal mit 100 μL eiskaltem mi-Wash Buffer (+), saugen Sie den Überstand mit einer 200 μL Pipette ab und geben Sie 500 μL mi-Wash Buffer (+) zu den Kügelchen und mischen Sie vorsichtig. Bewahren Sie die Röhren auf Eis auf.
   3. Geben Sie 7,5 μg monoklonalen (IgG2) Maus-Antikörper gegen den Menschen EIF2C2 (Ago2) (siehe Materialtabelle) oder unspezifisches Maus-IgG2 (Negativkontrolle) zu der Protein-G-Kügelchen-Aufschlämmung im mi-Wash Puffer (+).
   4. Inkubieren Sie die Röhrchen über Nacht und drehen Sie sich mit 8 Umdrehungen pro Minute (U/min) in einem Kühlraum.

2. Immunpräzipitation von Ago2

1. Lyse von Zellen
   1. Bringen Sie die Platte mit den auf 24-mm-Filtern kultivierten Zellen aus dem Zellkultur-Inkubator und setzen Sie die Filter schnell auf eine mit eiskaltem PBS gefüllte Platte auf Eis um. Lassen Sie PBS in die apikale Seite der Filter überlaufen, um die Zellen abzudecken.
   2. Saugen Sie PBS mit einer Seite ab und waschen Sie die apikale und basolaterale Seite zweimal mit eiskaltem PBS.
   3. Saugen Sie alle PBS ab, geben Sie 300 μl eiskalten mi-Lysis-Puffer (+) zu den Zellen, kratzen Sie die Zellen ab und geben Sie sie in ein 1,5-ml-Röhrchen, das für den jeweiligen Behandlungszustand (TGF-β1 oder Vehikelkontrolle) gekennzeichnet ist.
   4. Geben Sie 200 μl mi-Lysis-Puffer (+) in jedes Röhrchen und wirbeln Sie es gründlich ein.
   5. Inkubieren Sie die Röhrchen 15 Minuten lang auf Eis.
   6. Das Röhrchen bei 14.000 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugieren, den Überstand als Zelllysat auffangen und auf Eis legen.
2. Preclearing von Zelllysat mit unkonjugierten Protein G Agarosekügelchen
   1. Waschen Sie 30 μl frische Protein-G-Agarose-Bead-Aufschlämmung (50 %) in einem 1,5-ml-Röhrchen 3 Mal mit 100 μl PBS (Schritt 1.4.1) und entfernen Sie überschüssiges PBS.
   2. Waschen Sie die Kügelchen einmal mit 500 μl mi-Wash Buffer (+) und einmal mit 500 μl mi-Lysis Buffer (+). Entfernen Sie den überschüssigen Puffer.
   3. Das Zelllysat aus Schritt 2.1.6 wird in die Röhrchen mit den unkonjugierten Protein-G-Kügelchen gegeben.
   4. Drehen Sie die Röhren 1 h lang im Kühlraum (8 U/min), um die Zelllysate vorzureinigen.
   5. Nach dem Preclearing zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 2.000 x g für 1 min bei 4 °C. Das vorgeklärte Lysat als Überstand in frischen Röhrchen auffangen und auf Eis legen.
   6. Bereiten Sie Vollzelllysat (WCL) vor der Immunpräzipitation für den Nachweis des Ago2-Proteins durch Western Blotting vor. Nehmen Sie 10 μl vorgeklärte Lysate und fügen Sie 10 μl Probenpuffer (mit 10 % DTT) hinzu, erhitzen Sie es 4 Minuten lang auf 85 °C, kühlen Sie es auf dem Tisch ab und lagern Sie es bei -20 °C.
3. Immunpräzipitation von Ago2-Komplexen mit Anti-Ago2-Antikörpern, die auf Protein-G-Agarosekügelchen immobilisiert sind
   1. Der Anti-Ago2-Antikörper, der an die in Schritt 1.4.4 hergestellten Protein-G-Kügelchen konjugiert ist, wird 1 min lang bei 4 ΰC bei 2.000 x g zentrifugiert, der Überstand wird entfernt und verworfen. Waschen Sie die Kügelchen einmal mit 500 μl mi-Lysis Puffer (+), zentrifugieren Sie wie zuvor und entsorgen Sie den Überstand wieder.
   2. 500 μl der vorgeklärten Zelllysate aus Schritt 2.2.6 mit Anti-Ago2-Antikörpern mischen, die mit Protein-G-Kügelchen konjugiert sind, und 3 h rotierend (8 U/min) im Kühlraum inkubieren.
   3. Bringen Sie die Röhrchen aus dem Kühlraum auf Eis auf den Tisch und zentrifugieren Sie sie bei 2.000 x g für 1 min bei 4 °C. Entfernen Sie dann den Überstand und entsorgen Sie ihn.
   4. Waschen Sie die Protein-G-Agarose-Kügelchen mit immobilisierten Anti-Ago2-Antikörper-Ago2-Komplexen, die die co-immunpräzipitierten miRNAs enthalten, mit 1 ml mi-Wash-Puffer (+), zentrifugieren Sie 1 Minute lang bei 4 °C bei 2.000 x g und verwerfen Sie den Überstand. Wiederholen Sie diesen Vorgang zweimal.
   5. Resuspendieren Sie die Kügelchen mit 1 mL mi-Wash Buffer (+) und geben Sie 100 μl des Slurry in ein neues Röhrchen für die Proteinproben nach der Immunpräzipitation für das Western Blotting.
   6. Die Röhrchen bei 2.000 x g für 1 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
   7. 20 μl Probenpuffer (10 % DTT) zugeben, 5 min auf 85 °C erhitzen, mischen und 1 min bei Raumtemperatur bei 2.000 x g zentrifugieren. Lagern Sie die Proben bei -20 °C.
   8. Die Röhrchen mit den restlichen 900 μl immobilisierten Anti-Ago2-Antikörper-Ago2-Komplexen aus Schritt 2.3.5 bei 2.000 x g für 1 min bei 4 °C zentrifugieren, absaugen und den Überstand verwerfen. Bewahren Sie die Proben auf Eis auf.

3. RNA-Isolierung

1. Markieren Sie zwei 1,5-ml-Röhrchen pro Probe für die Isolierung von kleiner und großer RNA in den folgenden Schritten und fügen Sie jedem Röhrchen 2 μl mi-solution IV hinzu, die in den Schritten 3.5 und 3.8 verwendet werden sollen.
2. Bereiten Sie die Mastermix-Lösung vor, indem Sie 10 μl mi-Lösung I und 240 μl mi-Lösung II aus dem RIP-Assay-Kit pro Probe in ein 1,5-ml-Röhrchen geben und das Röhrchen bei Raumtemperatur halten.
3. 250 μl des Mastermixes in jedes Röhrchen mit immobilisierten Anti-Ago2-Antikörper-Ago2-Komplexen geben (hergestellt in Schritt 2.3.8), vortexen und bei 2.000 x g für 1 min bei Raumtemperatur zentrifugieren.
4. 150 μl mi-solution III in dasselbe Röhrchen geben und gut mischen. Anschließend bei 2.000 x g für 2 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Der Überstand in diesem Schritt enthält neben kleiner RNA (d. h. Gesamt-RNA) auch große RNA.
5. Der Überstand wird vorsichtig in das in Schritt 3.1 hergestellte Röhrchen mit 2 μl mi-Lösung IV überführt. Vermeiden Sie es, den Überstand mit Kügelchen zu kontaminieren, die die qRT-PCR beeinträchtigen.
6. Geben Sie 300 μl eiskaltes 2-Popanol in jedes Röhrchen mit der Gesamt-RNA, wirbeln Sie es auf, schleudern Sie es herunter und inkubieren Sie es 2 h lang bei -20 °C, um eine optimale Ausfällung großer RNA zu gewährleisten.
7. Nach der Inkubation bei -20 °C zentrifugieren Sie die Proben bei 12.000 x g für 10 min bei 4 °C, um die kleinen und großen RNAs, die im Überstand bzw. im Pellet enthalten sind, zu trennen. Bewahren Sie die Pellets bis Schritt 3.11 auf Eis auf.
8. Den Überstand mit kleinen RNAs in das in Schritt 3.1 vorbereitete Röhrchen (mit 2 μl mi-Lösung IV) überführen und 500 μl eiskaltes 2-Propanol hinzufügen, vortexen und nach unten schleudern.
9. Inkubieren Sie die Überstände über Nacht bei -20 °C, um eine optimale Ausfällung kleiner RNAs zu gewährleisten.
10. Am nächsten Tag die Röhrchen mit kleinen RNAs aus dem -20 °C Gefrierschrank nehmen und bei 12.000 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugieren. Der Überstand wird aspiriert, ohne das Pellet zu stören, und das Pellet, das den größten Teil der kleinen RNA enthält, gemäß Schritt 3.11 gewaschen.
11. Spülen Sie das Pellet mit großer RNA (Schritt 3.7) und kleiner RNA (Schritt 3.10) mit jeweils 500 μl eiskaltem 70%igem Ethanol. Das Pellet langsam mit eiskaltem 70%igem Ethanol mischen und dann bei 12.000 x g für 3 min bei 4 °C zentrifugieren. Saugen Sie den Überstand vorsichtig an, ohne das Pellet zu stören. Wiederholen Sie den Waschvorgang noch einmal.
12. Restliches Ethanol mit einer Pipette kleinerer Volumina (10 μl oder 20 μl) aspirieren und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in einer RNase-freien Umgebung an der Luft trocknen lassen.
13. Rekonstituieren Sie die kleine RNA und die großen RNA-Pellets, indem Sie 50 μl nukleasefreies Wasser hinzufügen und 5 Minuten lang auf 65 °C erhitzen. Lagern Sie die RNA dann bei -80 °C bis zur weiteren Verwendung, nachdem Sie die Qualität und Konzentration der RNA mit Nanotropfen überprüft haben.

4. Quantifizierung der miRNA durch quantitative Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR)

1. cDNA-Präparation durch reverse Transkription von miRNA mit miRNA-spezifischen Stem-Looped Primern
   HINWEIS: Für den RNA-Nachweis mittels Standard-qRT-PCR ist ein Template erforderlich, das mindestens doppelt so lang ist wie der Vorwärts- oder Rückwärtsprimer, jeweils etwa 20 Nukleotide lang. Die Mindestlänge beträgt also mindestens 40 Nukleotide, was kleine RNAs zu kurz für den Nachweis macht. Das Protokoll beschreibt miRNA-spezifische RT-Primer (Table of Materials), die eine hochstabile Stammschleifenstruktur enthalten, die die Ziel-cDNA verlängert. Der Forward-PCR-Primer fügt mit Nukleotiden zusätzliche Länge hinzu, die die Schmelztemperatur optimiert und die Assay-Spezifität erhöht. Die umgekehrte Grundierung stört die Stielschlaufe¹³. Das folgende Protokoll beschreibt die RT von RNA zu cDNA für miR-145-5p, miR-143-5p und miR-154-5p unter Verwendung des miRNA-Reverse-Transkriptions-Kits (Materialtabelle).
   1. Bereiten Sie einen Mastermix für jede miRNA vor, indem Sie 100 mM dNTPs (0,3 μl), Reverse Transkriptase (2 μl), 10x RT-Puffer (3 μl), RNase-Inhibitor (0,38 μl), miRNA-spezifischen Looped Primer (6 μl) und nukleasefreies Wasser (8,32 μl) hinzufügen. Das kombinierte Volumen des Mastermixes beträgt 20 μl.
   2. Geben Sie 10 μl kleine RNA aus Schritt 3.13 (50-100 ng) in drei separate 200-μl-Röhrchen für jede cDNA von miR-145-5p, miR-143-5p und miR-154-5p.
   3. Geben Sie den Mastermix zu kleiner RNA, mischen Sie vorsichtig und schleudern Sie ihn auf den Boden der Röhrchen. Bewahren Sie die Schläuche bis zum Laden in den Thermocycler auf Eis auf.
   4. Stellen Sie das Programm im Thermocycler für einen Einzelzyklus so ein, dass es 30 Minuten lang bei 16 °C hält, 30 Minuten lang bei 42 °C hält, 5 Minuten lang bei 85 °C hält und bei 4 °C hält. Stellen Sie das Reaktionsvolumen auf 30,0 μl ein. Siehe Schritt 4.1.6.1.
   5. Laden Sie die Reaktionsrohre in den Thermocycler. Starten Sie den RT-Lauf. Siehe Schritt 4.1.6.2.
   6. Schalten Sie den Thermocycler ein und legen Sie die Schläuche in die Schale. Es wird angezeigt, dass "System bootet, bitte warten". Klicken Sie auf Durchsuchen/Neue Methoden. Speichern Sie die Methode, und verwenden Sie sie in einem anderen Experiment, indem Sie das Menü durchsuchen. Wählen Sie entweder aus der Liste der zuvor gespeicherten Methoden aus und starten Sie die Ausführung oder erstellen Sie eine "neue" Methode. Der Bildschirm "Ausführung bearbeiten" oder "neue" Methode wird angezeigt.
      1. Bearbeiten Sie Temperatur und Zyklen wie in Schritt 4.1.4 beschrieben. Fügen Sie Phasen und Schritte hinzu oder entfernen Sie sie, indem Sie auf eine bestimmte Phase oder einen bestimmten Schritt klicken und dann auf die Schaltfläche Hinzufügen oder Löschen klicken. Klicken Sie auf Speichern oder führen Sie das Programm direkt aus. Benennen Sie unter Save Run Method die Methode "run", stellen Sie das Reaktionsvolumen (30 μl) ein, stellen Sie die Abdeckungstemperatur auf 105 °C ein, speichern Sie und beenden Sie den Vorgang.
      2. Wenn der Bildschirm "Ausführungsmethode durchsuchen" angezeigt wird, wählen Sie die gespeicherte Methode aus der Liste "Ausführungsmethode" aus. Klicken Sie auf Start Run und bestätigen Sie erneut das Reaktionsvolumen und die Abdeckungstemperatur. Klicken Sie auf Jetzt ausführen starten. Auf dem Bildschirm werden die Probentemperatur, die Deckeltemperatur und die verbleibende Zeit angezeigt. Erfassen Sie die Start- und Stoppzeit nach Fertigstellung und nehmen Sie die Schläuche aus dem Thermocycler.
         HINWEIS: Die Röhrchen, die cDNA enthalten, können bis zu ihrer weiteren Verwendung für die qPCR von miRNA bei -20 °C gelagert werden.
2. qPCR mit den miRNA-spezifischen Forward/Reverse-Primern und Hydrolysesonden
   HINWEIS: Das folgende Protokoll gilt für die qPCR von miR-145-5p, miR-143-5p und miR-154-5p unter Verwendung von miRNA-spezifischen cDNAs, die in Schritt 4.1 hergestellt wurden. Der Einröhrchen-miRNA-Assay (20x) enthält miRNA-spezifische Vorwärts-/Rückwärtsprimer und eine Hydrolysesonde (Materialtabelle). Der vordere Primer fügt Nukleotid hinzu, um die Länge zu erhöhen und die Schmelztemperatur zu optimieren, während der umgekehrte Primer die Stammschleife von cDNA¹³ unterbricht. Der Universal PCR Master Mix (Table of Materials) liefert zusätzliche Komponenten, die für die qPCR benötigt werden. Die Reaktion (20 μL) erfolgt in dreifacher Ausfertigung für jede miRNA.
   1. Bereiten Sie separate Mastermixe für miR-145-5p, miR-143-5p und miR-154-5p in Dreifachpräparaten unter Verwendung des jeweiligen miRNA-Assays (20x) (1 μl), 2x Universal PCR Master Mix (No AmpErase UNG; 10 μl) und nukleasefreiem Wasser (7,5 μl) vor. Das Gesamtvolumen für eine Reaktion beträgt 18,5 μL.
   2. Die in Nummer 4.1 hergestellte miRNA-spezifische cDNA (1,5 μl) wird in dreifacher Ausführung in jede Vertiefung der PCR-Platte gegeben.
   3. Geben Sie den in Schritt 4.2.1 hergestellten miRNA-spezifischen Mastermix (18,5 μl) in die Vertiefungen der PCR-Platte, die die entsprechende cDNA (1,5 μl) enthält.
   4. Versiegeln Sie die Platte mit einem geeigneten Versiegelungsmittel und führen Sie qPCR für 45 Zyklen auf einem qPCR-Thermocycler durch (Table of Materials). Stellen Sie die Zyklustemperatur 10 Minuten lang auf 95 °C ein, gefolgt von 45 Wiederholungen von 95 °C für 15 Sekunden (s) und 60 °C für 60 s. Siehe Schritt 4.2.6.
   5. Legen Sie die Ausgangswerte der qPCR-Kurve manuell pro Platte und standardisierte Schwellenwerte für alle qPCR-Läufe an einem Punkt fest, an dem die Amplifikation für alle Proben logarithmisch wird.
   6. Schalten Sie den Thermocycler ein und legen Sie die PCR-Platte in das Tablett. Die Thermocycler-Maschine arbeitet mit der Software, die auf dem zugehörigen Computer installiert ist. Klicken Sie auf das Symbol der Systemsoftware.
      1. Klicken Sie auf Neues Dokument erstellen oder Vorhandenes Dokument öffnen (wenn es ein zuvor gespeichertes Dokument gibt). Der Assistent für neue Dokumente wird angezeigt. Der Assay wird eine "Standardkurve (absolute Quantifizierung)" sein. Klicken Sie auf Weiter.
      2. Fügen Sie einen neuen Melder hinzu. Benennen Sie den Detektor nacheinander in miR-143, miR-145 und miR-154, indem Sie auf "Weiteren erstellen" klicken. Wählen Sie Reporterfarbe als "FAM" für alle aus und klicken Sie auf OK. Suchen Sie dann den Namen als miR-143, miR-145 und miR-154 und fügen Sie sie dem Detektordokument hinzu, indem Sie auf Hinzufügen klicken. Klicken Sie dann auf Weiter.
      3. "Probenplatte einrichten" wird angezeigt. Wählen Sie die Wells für einen Detektor aus und klicken Sie dann auf Verwenden , um den entsprechenden Detektor auszuwählen. Klicken Sie dann auf Fertigstellen. Die Systeminitialisierung wird angezeigt.
      4. Gehen Sie zum Gerät und stellen Sie Phase, Temperatur und Zeit ein, wie in Schritt 4.2.4 beschrieben. Stellen Sie das Probenvolumen auf 20 μl ein. Starten Sie dann den Lauf, indem Sie auf Start klicken. Speichern Sie dann die Platte mit einem Namen an einem gewünschten Ort. Die geschätzte Zeit wird auf dem Bildschirm in der Nähe der Startschaltfläche angezeigt. Notieren Sie sich die Zeit.
      5. Gehen Sie nach Abschluss des Vorgangs zu Datei | Exportieren | Ergebnisse und speichern Sie die Ergebnisse als CT-Werte an der gewünschten Stelle. Die CT-Werte befinden sich in .csv Dateien. Öffnen Sie sie und kopieren Sie die Werte in eine Tabellenkalkulationsdatei.
   7. Subtrahieren Sie den Durchschnitt des dreifachen Schwellenzyklus (Ct) der mit Vehikelkontrollen behandelten Proben vom durchschnittlichen Ct der mit TGF-β1 behandelten Proben, um ΔCt zu berechnen. Berechnen Sie schließlich die Faltungsänderung (FC) der miRNA-Spiegel mit der Formel ^2-ΔCt. Die log2-Transformation des FC-Wertes kann für die grafische Darstellung verwendet werden.

Wir haben bereits gezeigt, dass TGF-β1 die zellulären Gesamtspiegel von miR-145-5p, miR-143-5p und miR-154-5p miRNAs in CFBE41o-Zellen erhöhte³. Als nächstes verwendeten wir den Ago2-miRNA-co-IP-Assay, um die funktionellen Effekte von TGF-β1 auf diese miRNAs aufzuklären. Die RISC-Rekrutierung von miR-145-5p, miR-143-5p und miR-154-5p wurde in CFBE41o-Zellen untersucht, die stabil den Wildtyp (WT)-Mukoviszidose-Transmembran-Leitfähigkeitsregulator (CFTR) oder mutiertes CFTR exprimieren, mit der Deletion von Phenylalanin an Position 508 (F508del)-CFTR^14,15. Die Luft-Flüssig-Grenzflächenkulturen von WT- oder F508del-CFBE41o-Zellen wurden 24 h lang mit TGF-β1 oder Vehikel behandelt. Die Zellen wurden lysiert und endogenes Ago2 wurde immunpräzipitiert und durch Western Blotting mit dem primären monoklonalen Anti-Ago2-Antikörper der Maus in einer Verdünnung von 1:3000 nachgewiesen, gefolgt von einem sekundären Anti-Maus-Meerrettichperoxidase-Antikörper. Die Quantifizierung der Ago2-Immunpräzipitation erfolgte durch Densitometrie mit ImageJ mit Belichtungen innerhalb des linearen Dynamikbereichs des Films. Die Häufigkeit von immunpräzipitiertem Ago2 wurde nach Subtraktion des Hintergrunds und Normalisierung auf WCL Ago2 berechnet. Die Co-Immunpräzipitation von miR-145-5p, miR-143-5p und miR-154-5p mit Ago2 wurde mittels qRT-PCR unter Verwendung von miRNA-spezifischen Stammschleifen-Primern für die cDNA-Präparation nachgewiesen, gefolgt von der PCR mit den miRNA-spezifischen Vorwärts- und Rückwärtsprimern und TaqMan-Hydrolysesonden. Die Mittelwerte zwischen den Gruppen wurden durch einen zweiseitigen studentischen t-Test berechnet. Die Daten werden als mittlere ± S.E.M. dargestellt. Die Ago2-Proteinhäufigkeit und seine Immunpräzipitationseffizienz waren in TGF-β1- oder Vehikel-behandelten Zelllinien ähnlich (Abbildung 1A–1C). miR-145-5p und miR-143-5p waren in den mit Ago2 co-immunpräzipitierten Komplexen in den WT- und F508del-CFTR-exprimierenden Zellen vorhanden (Abbildung 1D-1E). TGF-β1 erhöhte die Co-Immunpräzipitation von miR-145-5p und miR-143-5p mit Ago2 in beiden Zelllinien im Vergleich zur Vehikelkontrolle. miR-154-5p co-immunpräzipitiert mit Ago2, aber TGF-β1 hatte keinen Einfluss auf die Abundanz des aktiven miR-154-5p-Pools im Vergleich zur Vehikelkontrolle (Abbildung 1F). Zusammengenommen zeigen die obigen Ergebnisse, dass TGF-β1 den gesamten zellulären miRNA-Spiegel erhöhen kann, ohne seinen Funktionspool zu beeinträchtigen. Der Ago2-miRNA-co-IP-Assay hat unser Verständnis der unterschiedlichen Auswirkungen von TGF-β1 auf miRNAs erweitert.

Abbildung 1. Zusammenfassung des Ago2-miRNA-co-IP-Assays, der zeigt, dass TGF-β1 die selektive Rekrutierung spezifischer miRNAs an RISC in WT- und F508del-CFBE41o-Zellen vermittelt. (A) Endogenes Ago2 wurde immunpräzipitiert (IP) aus Ganzzelllysaten (WCL) von CFBE41o-Zellen, die entweder WT- oder F508del-CFTR exprimieren, mit dem Anti-Ago2-Antikörper oder nicht-immunem IgG2 (eine Negativkontrolle) und durch Western Blotting (WB) nachgewiesen. Dargestellt sind repräsentative WB aus WT-CFTR-exprimierenden Zellen. Die unspezifische Bande in IP-Stichproben ist mit einem Sternchen gekennzeichnet. Repräsentative WB-Bilder (B) und eine Zusammenfassung der Daten (C), die zeigen, dass TGF-β1 keinen Einfluss auf die Ago2-Häufigkeit in WCL hatte und die Effizienz von Ago2 IP nicht veränderte. (D-F) qRT-PCR-Daten, die die co-IP von miRNAs mit endogenem Ago2 zeigen. Die Ct-Werte von miR-145 (miR-145-5p) in Vehikel-behandelten Zellen wurden von den Ct-Werten von miR-145 in TGF-β1-behandelten Zellen subtrahiert, um ΔCts zu erzeugen. Die Faltungsänderung (FC) im miR-145-Spiegel zwischen den Proben wurde unter Verwendung der Gleichung ^2-ΔCt bestimmt und als Log2 FC gegenüber dem Fahrzeug ausgedrückt. TGF-β1 erhöhte die co-IP von miR-145 (D) und miR-143 (miR-143-5p) (E) mit Ago2 in WT- und F508del-CFBE41o-Zellen und beeinflusste die co-IP von miR-154 (miR-154-5p) (F) nicht. Fehlerbalken, S.E.M. N = 10/Gruppe. * p < 0,05. (Dies ist eine repräsentative Zahl, die aus einem zuvor veröffentlichten Manuskript^{übernommen wurde 3}). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Der Ago2-miRNA-co-IP-Assay wurde entwickelt, um den aktiven Pool von miRNAs als Reaktion auf eine TGF-β1-Behandlung zu untersuchen. Die aktiven oder RISC-assoziierten miRNAs sind wichtig, um ihr inhibitorisches Potenzial für die Ziel-mRNA^{zu verstehen 4}. Panshin et al. zeigten kürzlich, dass die Immunpräzipitationseffizienz von Ago2 und miRNAs vom Protokoll^{abhängen könnte 16}. Es gibt mehrere Unterschiede zwischen dem Protokoll hier und den oben veröffentlichten Daten. Das Protokoll wurde hier für CFBE41o-Zellen optimiert. Im Gegensatz dazu untersuchten Panshin et al. Ago2 IP in humanem Plasma oder HEK293-Zellen. Wir immunpräzipitierten Ago2 mit monoklonalen Anti-humanen Ago2-Antikörpern der Maus, Unterklasse IgG2, konjugiert mit Protein-G-Agarosekügelchen. Panshin et al. verwendeten polyklonale Anti-Ago2-Antikörper, die mit Protein-A-Agarosekügelchen konjugiert sind, die eine Variabilität zwischen immunpräzipitierten miRNA-Pools induzieren können¹⁶. Die Protein-A-Kügelchen binden nicht so effizient an alle menschlichen IgG-Unterklassen wie Protein G¹⁷. Wir kontrollierten die IgG2-Unterklasse des Anti-Ago2-Antikörpers mit der unspezifischen IgG2-Negativkontrolle. Unter Verwendung des gleichen IP-Protokolls untersuchten wir die Auswirkungen von TGF-β1 auf den RISC-assoziierten miRNA-Pool.

Wir haben mehrere Modifikationen am RIP-Assay-Kit eingeführt, um die Immunpräzipitation und RNA-Isolierung zu optimieren und die TGF-β1-induzierte RISC-Rekrutierung von miRNAs zu untersuchen. Zuerst verwendeten wir ein größeres Volumen PBS zum vollständigen Waschen der Protein-G-Agarose-Kügelchen. Zweitens haben wir die Menge an Anti-Ago2-Antikörpern und den Waschpuffer um 50 % reduziert, um die Kosten zu senken. Drittens führten wir alle Schritte bei einheitlicher Kältetemperatur durch und fügten Kältelysepuffer direkt auf die Zellen hinzu. Viertens haben wir Prä-Immunpräzipitations-RNA nicht für die miRNA-Quantifizierung isoliert, da wir bereits die Daten zur miRNA-Expression im Ganzzelllysat von CFBE41o-Zellen veröffentlicht^{haben 3}. Andere Methoden, wie z.B. die auf magnetischen Kügelchen basierende RNA-Bindungsprotein Immunpräzipitation, können zur Untersuchung der mRNA verwendet werden. Die auf magnetischen Beads basierenden Methoden können jedoch nicht spezifisch auf die Komponente von RISC abzielen und sind daher möglicherweise nicht geeignet, um den aktiven Pool von miRNAs zu bewerten.

Wir möchten einige Bedingungen hervorheben, die für den Erfolg des Ago2-miRNA-co-IP-Assays entscheidend sind. Die effiziente Konjugation des Anti-Ago2-Antikörpers mit dem Protein G-Agarosekügelchen ist der erste entscheidende Schritt. Als nächstes ist der effiziente Pull-down von Ago2 aus WCL mit dem immobilisierten Anti-Ago2-Antikörper der nächste Schritt. Lysierte Zellen enthalten Ablagerungen, die durch Zentrifugation effizient entfernt werden sollten, um eine Interferenz mit dem Ago2-Pulldown zu vermeiden. Beim Auffangen des Überstands, der Zelllysat enthält, ist Vorsicht geboten, damit sich das Pellet mit Zelltrümmern nicht löst und mit dem Überstand vermischt. Der Pre-Clearing-Schritt vor der Immunpräzipitation ist auch notwendig, um eine unspezifische Bindung von Proteinen an die leeren Kügelchen (Kügelchen, die nicht mit dem Antikörper konjugiert sind) zu entfernen. Die Wahl der Präimmunpräzipitations-RNA-Isolierung sollte entsprechend dem Experiment bestimmt werden. Die Isolierung von Prä-Immunpräzipitations-RNA wurde weggelassen und hier wurde der Effekt von TGF-β1 auf die RISC-Rekrutierung von miRNAs untersucht. Die co-immunpräzipitierte miRNA FC nach Behandlung mit TGF-β1 im Vergleich zur Vehikelkontrolle liefert einen überzeugenden Beweis für die TGF-β1-Rekrutierung von miRNAs an RISC. Die Arbeitstemperatur spielt eine entscheidende Rolle, und alle Schritte während der Immunpräzipitation von Ago2 müssen auf Eis oder bei 4 °C durchgeführt werden, um einen Abbau oder eine Denaturierung von RISC-assoziierten Proteinen und RNA zu vermeiden. Alle weiteren Schritte, die die Elution von RNA aus Kügelchen beinhalten, müssen bei ähnlicher Temperatur durchgeführt werden, da die Aktivität von RNase, einem allgegenwärtigen Enzym, das für den schnellen RNA-Abbau verantwortlich ist, bei Raumtemperatur optimal ist. Die Verwendung einer RNase-freien Umgebung, einschließlich Geräten, Spitzen, Röhrchen, Pipetten und Tischgeräten, wird dringend empfohlen. Das Tragen der RNase-freien, puderfreien Nitrilhandschuhe, die häufig gewechselt werden, sollte bei jedem Schritt geübt werden. Es wird empfohlen, die RNA sofort nach der Elution bei -80 °C zu lagern. Die Kontamination mit Agarosekügelchen kann zu Problemen bei der cDNA-Präparation führen und die relative Quantifizierung von miRNA oder mRNA während der qRT-PCR beeinträchtigen. Die Zellkultur erfordert besondere Aufmerksamkeit und sollte sorgfältig überwacht werden. Die Gewebekulturschalen sollten mit Kollagen beschichtet werden, um die Zelladhärenz zu erhöhen und die Differenzierung der Epithelzellen zu fördern. Wir haben den Ago2-miRNA-co-IP-Assay im CFBE41o-Zellmodell durchgeführt.

Die Einschränkung des Protokolls besteht darin, dass es sehr empfindlich auf Schwankungen in der Anzahl der verwendeten Zellen reagiert. Die Zellzahl muss genau kontrolliert werden und die Ago2-Immunpräzipitation muss entsprechend dem Zellinput optimiert werden, um eine Sättigung des immunpräzipitierten Ago2 mit miRNAs zu verhindern. In Zukunft könnte der Assay in verschiedenen experimentellen Umgebungen eingesetzt werden, z. B. beim Gen-Knockdown und zur Untersuchung des aktiven Pools von miRNAs in verschiedenen Krankheitsmodellen. Der Assay kann für die Verwendung mit anderen epithelialen und nicht-epithelialen Zellmodellen, einschließlich Primärzellen oder Tiermodellen, optimiert werden.

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben und nichts offenzulegen haben.

Wir danken John Wakefield von Tranzyme, Inc. (Birmingham, AL), der die CFBE41o-Zellen erzeugt hat, und J.P. Clancy von der CFFT, der die Zellen zur Verfügung gestellt hat. Diese Forschung wurde von den National Institutes of Health Grants R01HL144539 und R56HL127202 (an die A.S.-U.) und dem Cystic Fibrosis Foundation Grant SWIATE18G0 finanziert.