Mikro Bilgisayarlı Tomografi Görüntüleme için hazırlık olarak retrograd perfüzyon ve Fare Koroner damarları doldurulması

Koroner damarların görüntülenmesi kardiyovasküler hastalıkların bizim anlayışın geliştirilmesi için çok önemlidir. Burada mikro-Bilgisayarlı Tomografi (μCT) görüntüleme için hazırlık, bir radyoopak silikon kauçuk (Microfil) ile sıçan koroner damar perfüze için bir yöntem açıklanmaktadır.

Damarların görüntülenmesi birçok hastalıktan anlamak için giderek önem kazanmaktadır. Çeşitli teknikler görüntüleme damar için mevcut olmakla birlikte, birkaç küçük gemilere ^1,2 içeren bir kararın uzanan bir bütün olarak vasküler ağ görselleştirmek edebiliyoruz. Ayrıca, birçok vasküler döküm teknikleri örnek ^3-5 daha fazla analiz önlenmesi, çevre doku yok. Bu konularda circumvents Bir yöntem mikro-Bilgisayarlı Tomografi (μCT) 'dir. μCT görüntüleme, kararlar <10 mikron tarama damar ağının 3D rekonstrüksiyon üretme yeteneğine sahip olduğunu ve (örneğin, histoloji ve morfometri) sonraki analiz için sağlam ^6-11 doku bırakır olabilir. Bununla birlikte, ex vivo μCT yöntemlerle görüntüleme damarlarının damarlarının radyoopak bileşiği ile doldurulmuş olması gerekir. Bunun gibi, μCT görüntüleme tarafından üretilen damarların doğru temsili üzerine olurludurgemilerin güvenilir ve tam dolum. Bu protokol, biz μCT görüntüleme için hazırlık fare koroner damarları doldurmak için bir teknik açıklar.

İki hakim teknikler koroner damar doldurmak için var: Bir Langendorff perfüzyon sistemi ^15-17 ile kanülasyon ve retrograd aort perfüzyon (veya arkus kapalı bir şube) ^12-14 veya ex vivo ile in vivo. Burada özellikle tüm damarlarda dolum sağlamak için tasarlanmıştır vivo aort kanülasyon yöntemi bir tarif. Bütün kılcal gibi vasküler ağın, arter ve ven her iki tarafında, doldurmak için küçük damarlarda serpmek için Microfil denilen düşük viskoziteli radyopak bileşiğin kullanımı. Kaplar basınçlı bir perfüzyon sistemi kullanılarak tamponu ile perfüze ve sonra Microfil ile doldurulur. Bu Microfil küçük yüksek direnç damarları doldurur sağlamak için, büyük dalları emanatin ligatekoroner arterler içine Microfil yönlendirir aorta, gelen g. Bir kez dolum bazı gemilerin Microfil silip atacak gelen kalp dokusunun elastik yapısı önlemek için, tam, biz hemen doldurduktan sonra erişilebilir büyük damar çıkış noktaları ligate. Bu nedenle, bizim teknik komple koroner damar ağı görselleştirme sağlayarak, dolgu ajanı tam dolum ve maksimum kalıcılık için optimize edilmiştir - arterlerin, kılcal damarları ve damarların hem.

1. Başlamadan önce hazırlıklar

1. , Sırasıyla, PBS içerisinde Vazodilatör tampon (4 mg / L Papaverin + 1 gr / L PBS içinde Adenosin) veya 4% paraformaldehit (PFA) ile basınçlı perfüzyon aparatı her bir tarafında doldurun.
2. 1:100 Heparin 0.1 ml (5000U/ml hisse senedi) ile doldurma ve yukarı eğim ile ~ 120 derecelik bir açıyla iğne bükerek bir 1/2cc İnsülin Şırınga (bir srekli 29G ½ "iğne ile) hazırlayın. Mı 0.3 ml doymuş KCl çözeltisi ile doldurulmuş 1 ml şırınga (26G bir ½ "iğne ile) ile aynı.

2. Kalp teşhir ve aort cannulating

1. Seçtiğiniz anestezik kullanarak fare uyutmak. (Biz bir Ketamin / Ksilazin karışımı aşırı dozda kullanın:. 130 mg / kg Ketamin ve tuzlu su içinde 8.8 mg / kg Xylazine IP enjeksiyon)
2. Anatomi tepsisi, ventral tarafı yukarı üzerine anestezi fare Pin. Orta hat kesi ile karın boşluğu açın ve cildi geriorganları açığa. Posterior Vena Kava (PVC) bir bölge ortaya çıkarmak bir yana bağırsak taşıyın.
3. PVC içine heparin solüsyonu enjekte edilir. Eğer iğne ayıklamak gibi, sızıntı önlemek ve PVC duvar pıhtılaşması ve mühürler kadar birkaç saniye tutun için bir pamuk uçlu aplikatör ile iğne deliği kapsar. Fare dolaşımı boyunca dağıtmak için Heparin için 2-3 dakika bekleyin.
4. Eğer kalpte gözlemlemek, böylece diyafram ve göğüs kafesini parçalara ayır. Yavaş yavaş kalp tutuklamalar kadar PVC KCl çözeltisi enjekte edilir.
5. Diyaframın bölgenin anterior zedelemeden, diyafram ve tüketim fare posterior bölümünün altındaki bütün organları çıkarın. Kalp proksimal kısmı sonraki adımlarda bulmak kolay yani diyafram yakınında PVC kesmek için dikkatli olmanın, diyafram çıkarın.
6. Aort kesik ucuna bulun. Aort altında anterior birkaç milimetre sağa sola 6-0 örgü ipek sütür biri uzun boyu yerleştirinm sütür geri kendisini iki katına olduğu gibi kesik uç. Aort altında sütür 2 adet vardır bu nedenle yarısında bu uzun sütür kesin. Aorta (Şekil 1A, B) kesik ucunu angiocatheter yerleştirin ve yerine angiocatheter tutun ve dışarı sızmasını aort içinde herhangi bir geri basıncı önlemek için bir çift düğüm, her dikiş kravat.

3. Perfüzyon ve Microfil enjeksiyon

1. Basıncı perfüzyon aparatı (Şekil 2) angiocatheter bağlayın ve 100-110 mmHg bir sürüş basıncına perfüzyon cihazı pompalayarak vazodilatör tamponu (Şekil 1C) gemiler perfüze başlar. Tampon sıvı sağlayarak koroner arterler ile perfüze olup olmadığını kontrol edin çift PVC çıkarken. En az 3 dakika serpmek devam veya PVC çıkan sıvı netleşene kadar. (Perfüze ise sonraki adımlar ile devam edin.)
2. Kaburga ve pin geri (veya kaldırmak) kalp duyurmak için göğüs kafesi parçalara ayır. Bir kere maruz kalan, caKalp gazlı bez tampon bulanmış parça kalbimin üstüne tampon damla sıkarak kuruması için değil reful. Aort arkı maruz timus uzak temizleyin. Sıvı sağlamak için 6-0 örgü ipek sütür kullanılarak üç büyük aort dalları Ligate yerine bu büyük, düşük dirençli damarlar (Şekil 1D) aracılığıyla daha koroner arterler üzerinden saptırılır.
3. 15 dakika boyunca sabitleştirici ile kalp serpmek, ardından en az 2 dakika süreyle Vazodilatasyon tamponu ile durulanır. Bu arada, enjeksiyon sonrası kalp (1E) dışarı sızmasını Microfil önlemek için hem ön Vena Cavae ligate. Yeri PVC ve aort etrafında dikişler ama doldurduktan sonra kadar onları sıkmayın.
4. Microfil hazırlayın (as reaktiflerin tabloda belirtildiği gibi) ve 1 ml şırınganın içine yerleştirin. Kateter (Microfil şırıngaya perfüzyon boru geçerken hava kabarcıklarının girişini önlemek amacıyla) kaplayacak kadar su ile diseksiyon tepsi doldurun. Perfüzyon ap ayırınkateter paratus ve hazırlanmış Microfil şırınga bağlanır.
5. Koroner arterlerin iyi dolgu (Şekil 1F, 3A) kanıtlanıncaya kadar aorta Microfil enjekte: arterler ilk dolduracak ve sonra Microfil Microfil rengi ile doku basması gibi kılcal damarlar içine "dökülebilir" olacaktır. Bir kez venöz tarafında, Microfil hidrofobik yapısı nedeniyle küçük gemilere çıkar başlangıçta bağımsız bir küre gibi görünmeye neden olur. Sürekli bir sütun damarları doldurur kadar Microfil enjekte devam edin. Microfil damarlar içinde sürekli olduğunda komple dolum belirgin olacak ve PVC ile çıkarken.
6. Dolum işlemi tamamlandıktan sonra, hızlı bir şekilde daha önceden damarlarının dışarı Microfil sıkma gelen kardiyak doku elastik doğası önlemek için PVC ve aorta etrafında yerleştirildi dikişlerle sıkmak.
7. (Diseksiyon tepsiden su ile ıslatılmış ıslak gazlı bez ile kalp kapak) Onun kurumasını önlemek ve Microfil polimerize kadar oda sıcaklığında yaklaşık 1 saat bekletin için. Böyle kaldırırken veya kalp arkasında dolu gemilerin erken bir görünüm elde etmek için bir girişim kalp dönüm olarak polimerizasyon işlemi esnasında kalp üzerinde herhangi bir dış baskı, kaçının. Bu Microfil tatili neden kalp bir daha elastik bir alana bazı gemilerin Microfil sıkmak olabilir.
8. Kalp çıkarın ve 4 gece 4% PFA post it-fix ° C Daha sonra 4 ° C'de% 70 etanol içinde depolamak Kalp damar artık μCT görüntüleme için hazırdır.

4. Temsilcisi Sonuçlar

Etkili Microfil ile perfüze olan gemiler gemi boyunca sürekli, kesintisiz Microfil (Şekil 3A) olacaktır. Koroner damarlarda dolum kapsamı göz tarafından değerlendirilecek olabilir; damarlar epicardially ¹⁸ bulunur ve kolayca (Şekil 3A, ok) görülebilir; arterler,hangi ¹⁸ daha intramiyokardiyal olan kalbin yüzeyine (Şekil 3A, ok) ile de görülebilir. Kardiyak doku kılcal damarların çok yüksek bir yoğunluğa sahip olarak kapiller dolum, de bellidir, ve bu nedenle, ne zaman kılcal dolgu, kardiyak doku Microfil rengini (Şekil 3A, yıldız) ile floş olacaktır. Böylece, doldurmak için başarısız herhangi bir damar ağları Microfil eksikliği (Şekil 3B, C) bağlı fark olacaktır.

Microfil hidrofobik doğanın kendi içine kasılmasına ve dolu gemi içinde "sonları" neden neden çünkü Microfil (Şekil 3B'de yıldız) süreksizlikler sık ​​görünür. Damarları içindeki basıncı kalpten damar çıkış noktalarının tie-off'lara uygun yoluyla sürdürüldüğü takdirde, bu "molaları" azaltılabilir. Diğer süreksizliklerin mikrofiltre içinde hava kabarcıkları neden olabilir. Perfüzyon ap geçerken hava girişini önlemek için, angiocatheter tamamen su altında olduğundan emin olun Microfil şırıngaya paratus. Bir hava kabarcığı tanışınca, genellikle balonu koroner damarların üzerinden itti ve dışarı dek Microfil perfüzyon devam ederek basitçe kaldırılabilir.

Vasküler yataklı bir bölümünü (Şekil 3B, ok) bloke halinde vasküler ağlar tamamen dolgu olmayabilir. Heparin kan pıhtısı oluşumunu inhibe ederken, zaman zaman tıkanmalara hala prosedür öncesi veya başka bir bilinmeyen faktörler nedeniyle başlayan eksik heparin perfüzyon nedeniyle oluşabilir. Bir tıkanma meydana gelirse, vasküler dolgu tamamlamak için blokaj yerinden oynatmamaya için hiçbir yöntem, bildiğimiz kadarıyla yok. Çok az basınç Microfil tüm vasküler yatak ve kılcal ağlar (Şekil 3C) zorla olmayacak gibi, dolum esnasında kullanıldığı takdirde eksik bilgi girilmesi de neden olabilir. Tersine, çok fazla basınç kılcal (Şekil 3D) çevredeki dokuya Microfil patlaması ve extravasate neden olabilir.

files/ftp_upload/3740/3740fig1.jpg "alt =" Şekil 1 "/>
Şekil 1.. Microfil perfüzyon düzeninin bakış. (A) aort ve PVC diyaframın yaklaşık seviyesinde kesilir. (B) aort bir angiocatheter ile kanüle edilir. (D) arkus kapalı üç ana kolu bağlandı iken (C) Vazodilatasyon tampon baskı perfüzyon aparatı (Resim mevcut değil) tarafından tahrik olan gemiler, içinden perfüze edilmiştir. Her iki ön Vena Cavas ligate edilir ise (E) 4% PFA koroner içinden perfüze edilmiştir. Bu PVC'den çıkmadan gözlenene kadar (F) bir şırınga kullanılarak, Microfil koroner içinden perfüze edilmiştir.

Şekil 2. Perfüzyon Aparatı. İki Erlenmeyer matara, Vazodilatasyon tampon veya% 4 PFA ya dolu, her biri katıldı ve sidearms bağlı borular aracılığıyla tahrik edilmektedir. Sistemin bir pompa aracılığıyla elle basınçlı haletermometre ve bir basınç ölçer izleme ve basınç bakım izin vermek için şişeler birine bağlanır. Küçük tüpler kauçuk tıpa ile ve aşağı her şişede sıvı içine uzatmak. Basınç bu küçük tüpler dışarı her şişesi sidearms pompalar sıvı giren. Tüpler sonra sadece bir kerede bir şişesi akmaya sıvı sağlayan bir musluk de birleştirebilirsiniz.

Şekil 3. Microfilled kalpleri tadın. (A) de dolu gemiler (varsa) Microfil tatili kaç olacak ve kalp dokusu dolu kılcal (yıldız, ve C ile karşılaştırmak) nedeniyle Microfil ile tinged rengi olacak. Her iki arter (ok - Sol ön inen arter) ve damarlar (ok - Sol Koroner Damar) kalp yüzey boyunca görülebilir. (B) Tam Mikrofon önlenir bazı damarlarda Microfil in sonlarının (yıldız işareti) yanı sıra, tıkanmalar olan bir kalppenetrasyon rofil. Bloke damarlar kan perfüzyon işlemi sırasında dışarı atılır değildi olarak, kırmızı (ok) kalır. Tam olarak dolduruldu damarları ile (C) bir kalp. Doku Microfil kılcal damarları içine nüfuz etmedi belirten Microfil ve sarı renk üzerine almadığını dikkat edin. (D) Bir kalp burada Microfil çevreleyen doku (ok) içine sızmaya neden dolum esnasında kılcal damarların patlaması.

Kardiyak doku çok yüksek metabolik talep vardır ve bu nedenle, koroner damar tarafından sağlanan kandan besin ve oksijen sabit bir besleme gerektirir. Damar darlığı ve tıkanma nedeniyle koroner fonksiyonu azaltmak koroner damarlarında, hastalıkları, doku hipoksisi ve iskemiye yol, myokard infarktüsü ve kalp kası onarılamaz hasar riski etkilenen hastalar koyabilirsiniz. Bu gemilerin hastalıklı devlet daha iyi anlaşılması gereklidir ve koroner damarların çalışma yeteneğimizi kritik damarların görselleştirme olduğunu. Burada, bir radyoopak madde ile damar doldurarak ex vivo görüntüleme için fare koroner damar hazırlamak için bir yöntem sunuyoruz. Bu protokol, özellikle kılcal damarlar dahil tüm koroner damarların tam olarak doldurulması ve daha sonra görüntüleme sağlamak için tasarlanmıştır.

Tüm kılcal damarların tam dolum, dolum AGEN sağlamak içint, Microfil, vasküler ağı içinde daha küçük, daha yüksek direnç damarları içine Microfil zorlar kısmi kapalı sistem içine enjekte edilmesi gerekir. Dolum sistemi in vivo olarak bizim içinde bu kısmi kapatma oluşturmak için, biz arkus dallanma üç büyük, düşük direnç arterlerde ligate. Bu tüm diğer potansiyel "kaçak" puan, kalan gemiler (başlıca interkostal arterler) göz ardı etmez iken herhangi bir baskı koroner damar sistemi komple dolmasıyla engel değildir onlar üzerinden kayıp yeterince küçük. Microfil kalbin tüm gemilerin perfüze sonra, kalp ve damar dokusunun doğuştan esnek doğası, bazı gemilerin Microfil sıkmak olacaktır. Microfil Bu kaybı önlemek için, koroner damar tamamen düzeldi sonra tüm büyük ve erişilebilir çıkış noktaları, yani her iki vena cavae, posterior vena kava ve aorta, ligate. Bu şekilde, basınç mMicrofil Microfil normal fizyolojik kan basıncı altında kap yapıya uygun sağlayan polimerize kadar, kalp aintained.

Kılcal görselleştirilmesi gerekli değildir Alternatif olarak, eğer yalnızca arteryel veya sadece venöz yatak doldurmak mümkündür. Microfil daha viskoz sürümleri viskozitesi yüksek bir seyreltici (FlowTech edinilebilir) ile karıştırılabilir. Daha viskoz perfüzat kılcal nüfuz edememesi ve venöz tarafında perfüze eğer bu nedenle yalnızca arterler, veya sadece damarların görüntülenmesi mümkün kılar. Ek olarak, iletişim kuralı kolayca diğer türler veya non-yetişkin farelere adapte edilebilir burada sunulmaktadır. Uygun hayvanın boyutuna göre işlem ölçeklendirmek sadece sızıntı en aza indirmek ve germe veya kaçmasını engellemek şekilde kateter ve perfüzyon boru hayvanın aorta uygun büyüklükte olmasını gerektirir. Sıvılarının cilt (ör. heparin, enjektedoymuş KCl, ve Microfil) de uygun bir şekilde ölçeklendirilir edilmelidir.

Bizim protokolü özellikle μCT tarafından Microfil ve görüntüleme enjeksiyonu için dizayn edilmiştir, ancak, bu kolaylıkla μCT analizi, ya da diğer ex vivo görüntüleme teknikleri için de, diğer dolgu maddeleri için adapte edilebilir. ΜCT uyumlu dolgu ararken, radyoopak boyaların çeşitli seçenekler diğer görüntüleme yöntemleri (örn. akrilik) ile vasküler dolum ve çalışmak için kullanılan birçok madde gibi, işte böyle bir kurşun pigment ⁹ veya bir osmiyum çözüm olarak radyo opak madde ile infüze edilebilir ^3. Bağımsız olarak kullanıldığı dolgu maddesi, μCT görüntüleme sonuçlar vasküler ölçümü için yanı sıra doldurulmuş koroner damar ^6,7,14,19 ve dallanan desen ile ilgili bilgileri, yapısal bir 3D modeli içine yeniden edilebilir bir avantaj sunar. Ayrıca, μCT tarafından görüntüleme böylece ek bir izin vererek, çevre dokuya korurTaramadan sonra alyses. Böylece, dolu ve taranan kalpleri histolojik analiz için işlenebilir ve çeşitli belirteçler için boyanan kesitler arteriyel / venöz kimlik, düz kas kat varlığı, veya ek histolojik endeksleri arasında ilişki μCT verileri ile uyumlu olabilir.

Diğer yaygın damar görüntüleme teknikleri de vasküler dolgu gerektiren ve protokol kolayca bu diğer dolgu maddeleri herhangi birisi ile koroner arterler perfüze için adapte edilebilir. Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM) gemilerin dolum ve sonra korozyon döküm denilen bir süreçle kurulmuş vasküler döküm uzak yumuşak doku çözme gerektirir. Çevreleyen yumuşak doku desteği olmadan damarların şeklini korumak için, dolgu ajanı güçlü ve non-kırılgan olmalıdır: genellikle bir akrilik reçine (örneğin Mercox, Batson Kullanıcı) ^3,20,21. SEM μCT görüntüleme ²² olduğu için çok üstün tarama çözünürlükleri, korozyon dökme sağlarkening prosedürü herhangi bir ek doku analizi engelleyerek, doku tahrip eder. Koroner damar ex vivo görüntüleme, optik projeksiyon tomografi (OPT), başka bir yöntemi alkalin fosfataz ile üretilen mor renkli çökelti gibi çökeltiler görünür veya yakınındaki-görünür ışık algılamak ve böylece kromojenik ek olarak floresan sinyallerin bulgulanması için olanak edebilir BCIP / NBT dönüşümü (5-bromo-4-kloro-3-indolil phosphate/4-nitro mavi tetrazolyum) ^23-25. Floresans ya da bir ya yoluyla örneğin tam olarak monte İmmuno yöntemleri, veya yoluyla non-dolum: damar görselleştirilmesi, bu nedenle, bir floresan madde ⁽²⁶ dekstran aşılanmış bir poliüretan reçine ^3, floresein veya örneğin PU4ii) ile doldurma yoluyla gerçekleştirilebilir histokimyasal kromojenik çökelti (örneğin BCIP / NBT) ^23. OPT görüntüleme μCT (yaklaşık 1 mikron) göre biraz daha iyi çözünürlük elde edebilirsiniz, ancak, doldurma ve immunodete hemction yöntemleri çevreleyen yumuşak doku kimyasal histolojik analiz sonrası tarama için bazı antijenleri bozabilir ki, temizlenmesi gerekir.

Vardır görüntüleme vasküler dolgu ya İmmuno gerekmez, koroner damar için çeşitli yöntemler de vardır ve bu gibi in vivo gerçekleştirilebilir gibi. Bir teknik, Kontrast Geliştirilmiş Yüksek Çözünürlük Ultrason (CEHRUS), bir kontrast madde olarak gaz dolu kabarcıkların kullanır. Kana, bu kabarcıkların Enjeksiyon aşağı kılcal seviyesine gerçek zamanlı akış ölçümleri ile kan akışını görselleştirilmesi için izin verir, ama görüntülü gemilerin ^2,27-31 bir 3D görünümü sağlamaz. Başka bir yöntem, Manyetik Rezonans Anjiografi (MRA) da görüntü koroner damarların ^32-34, ve MRA son gelişmeler için kullanılan gerçek zamanlı kan akımı ölçümleri ^35,36 almak için kendi görüntüleme yetenekleri artırdık. MRA ve 3 boyutlu rekonstrüksiyon üretebilir ikenssels görüntülü, MRA kararı şu anda yaklaşık 100 mikron ile sınırlıdır ve bu nedenle daha küçük damarlarda (kapiller, arteriol ve venüller) tanımlamak için başarısız olur.

CEHRUS ve MRA hem canlı hayvan üzerinde yapılabilir beri, sürekli ve non-invaziv izleme kan akımı ve vasküler gelişim avantajı sunuyoruz. Bununla birlikte, MRA arasında nispeten düşük bir çözünürlüğe ve CEHRUS 3D yetenekleri eksikliği, bir bütün olarak koroner ağ görüntüleme engellemektedir. In vivo teknikleriyle zaman içinde damarsal ağ işlevselliği ile ilgili olarak değerli bir bilgi (örn., akımı verileri) temin ederken Böylece, vasküler dolgu maddeleri ya İmmuno gerektiren ex vivo görüntüleme tekniği, koroner damar sistemi, yüksek çözünürlükte 3D bilgilerin elde edilmesi için önemlidir . Son nokta ex vivo görüntüleme ile in vivo zamanlı ders analizi birleştiren koroner damarlarda çalışma için güçlü bir sistem sağlar.

Fareler, Washington Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından ve Sağlık ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH Yayın No 85-23 tarafından yayınlanan Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu göre onaylanmış yöntemlerle ele alındı ) 1996 revize edilmiştir.

Biz protokol, Dr Michael Simons, Dr Kip Hauch ve genel tartışma için laboratuvarlarında her iki üyelerinin ilk denemeleri için Dr Kelly Stevens teşekkür ederim.

Bu çalışma NIH hibe HL087513 ve P01 HL094374 tarafından destek.