Perfusion rétrograde et remplissage de la vascularisation coronaire souris comme préparation à l'imagerie par ordinateur Micro tomographie

Visualisation des vaisseaux coronaires est essentielle pour faire progresser notre compréhension des maladies cardio-vasculaires. Nous décrivons ici une méthode pour perfuser murin vasculaire coronaire avec un caoutchouc de silicone radio-opaque (Microfil), en préparation pour les micro-tomographie par ordinateur (μCT) d'imagerie.

Visualisation de la vascularisation est de plus en plus important pour la compréhension de nombreux états pathologiques différentes. Bien que plusieurs techniques existent pour l'imagerie vasculaire, quelques-uns sont capables de visualiser le réseau vasculaire dans son ensemble tout en étendant à une résolution qui comprend le plus petit ^1,2 navires. En outre, de nombreuses techniques de moulage vasculaires détruire les tissus environnants, ce qui empêche une analyse plus approfondie de l'échantillon ^3-5. Une méthode qui contourne ces problèmes est la micro-tomographie par ordinateur (μCT). μCT imagerie permet de numériser à des résolutions de moins de 10 microns, est capable de produire des reconstitutions en 3D du réseau vasculaire, et laisse le tissu intact pour une analyse ultérieure (par exemple, l'histologie et la morphométrie) ^6-11. Toutefois, les navires d'imagerie par des méthodes in vivo ex μCT exige que les navires soient remplies avec un composé radio-opaque. En tant que tel, la représentation précise de la vascularisation produite par μCT imagerie est subordonnée àremplissage fiable et complète des vaisseaux. Dans ce protocole, nous décrivons une technique pour remplir des récipients de souris coronaires en préparation pour l'imagerie μCT.

Deux techniques existent prédominent pour le remplissage du système vasculaire coronaire: in vivo par perfusion canulation et rétrograde de l'aorte (ou une branche hors de l'arche aortique) ^12-14, ou ex vivo par l'intermédiaire d'un système de perfusion de Langendorff ^15-17. Nous décrivons ici une méthode in vivo canulation aortique qui a été spécifiquement conçu pour assurer le remplissage de tous les navires. On utiliser un composé radio-opaque appelé faible viscosité Microfil qui peut perfuser à travers les petits vaisseaux pour remplir tous les capillaires, ainsi que deux des côtés artériels et veineux du réseau vasculaire. Les navires sont perfusées avec le tampon en utilisant un système de perfusion sous pression, puis rempli de Microfil. Pour veiller à ce que Microfil remplit les petits vaisseaux de résistance plus élevés, nous ligaturer les grosses branches emanating à partir de l'aorte, qui dévie le Microfil dans les artères coronaires. Une fois le remplissage terminé, pour empêcher la nature élastique du tissu cardiaque de serrage Microfil sur des vaisseaux, on ligature accessibles principaux points de sortie vasculaires immédiatement après le remplissage. Par conséquent, notre technique est optimisé pour un remplissage complet et la rétention maximale de l'agent de remplissage, permettant la visualisation de l'ensemble du réseau vasculaire coronaire - artères, les capillaires et les veines ressemblent.

1. Préparatifs avant de commencer

1. Remplir chaque côté de l'appareil de perfusion sous pression avec un tampon vasodilatateur (4 mg / L de papavérine + 1 g / L adénosine dans du PBS) ou paraformaldéhyde 4% (PFA) dans du PBS, respectivement.
2. Préparer une seringue à insuline 1/2cc (avec un 29G fixé en permanence ½ "aiguille) en le remplissant avec 0,1 ml de 1:100 héparine (stock 5000U/ml) et de tordre l'aiguille à l'angle ~ 120 degrés avec le biseau vers le haut. Faites le même avec une seringue de 1 ml (avec une 26G ½ "aiguille) remplie avec 0,3 ml de solution de KCl saturé.

2. Exposer le cœur et l'aorte canulation

1. Anesthésier la souris en utilisant votre anesthésique de choix. (Nous utilisons une surdose d'un mélange kétamine / xylazine:. Injection IP de 130 mg / kg de kétamine et 8,8 mg / kg de xylazine dans une solution saline)
2. Epingler la souris anesthésiée sur le plateau de dissection, jusqu'à la face ventrale. Ouvrez la cavité abdominale par une incision médiane et se rétracter la peauà exposer les organes. Déplacer les intestins d'un côté afin d'exposer une région du postérieur veine cave (PVC).
3. Injecter la solution d'héparine dans le PVC. Comme vous extraire l'aiguille, couvrir le trou d'aiguille avec un coton-tige pour empêcher les fuites et maintenez-le pendant quelques secondes jusqu'à ce que les caillots de mur PVC et les joints. Attendre 2-3 minutes pour l'héparine pour disperser tout au long de la circulation de la souris.
4. Disséquer le diaphragme et la cage thoracique afin que vous puissiez observer le cœur battant. Injecter lentement une solution de KCl dans le PVC jusqu'à ce que les arrestations de coeur.
5. Retirez tous les organes ci-dessous du diaphragme et de l'accise de la partie postérieure de la souris, en laissant la partie antérieure région de la membrane intacte. Enlever la membrane, en prenant soin de couper le PVC à proximité de la membrane de sorte que la partie proximale du cœur est facile à localiser dans des étapes ultérieures.
6. Localisez l'extrémité coupée de l'aorte. Placez une grande longueur de 6-0 suture soie tressée sous l'aorte quelques millimètres antérieures vientm l'extrémité coupée de telle sorte que la suture est replié sur lui-même. Couper ce fil de suture plus de moitié il ya donc 2 morceaux de fil de suture sous l'aorte. Insérez le angiocathéter dans l'extrémité coupée de l'aorte (figure 1A, B) et attacher chaque suture avec un double-noeud pour tenir le angiocathéter en place et d'empêcher toute contre-pression dans l'aorte de s'échapper.

3. Perfusion et d'injection Microfil

1. Connecter le angiocathéter à l'appareil de perfusion sous pression (Fig 2) et pour commencer à perfuser des vaisseaux avec du tampon vasodilatateur (figure 1C) par pompage de l'appareil de perfusion à une pression de 100-110 mm de Hg conduite. Vérifiez que le tampon est perfuser à travers les artères coronaires en veillant à ce liquide est sortie de la PVC. Continuer à perfuser pendant au moins 3 minutes ou jusqu'à ce que le liquide sortant de la PVC est clair. (Continuer avec les prochaines étapes tout en perfusant.)
2. Disséquer les côtes et le dos broches (ou supprimer) la cage thoracique afin d'exposer le cœur. Une fois exposée, soit environreful de ne pas laisser le cœur se dessécher en serrant gouttes de tampon sur le cœur d'un morceau de tampon imbibé de gaze. Dégagez le thymus pour exposer la crosse aortique. Ligaturer les trois branches de l'aorte majeurs en utilisant 6-0 suture en soie tressée pour assurer fluide est détournée par les artères coronaires, plutôt que par ces grands, les bateaux à faible résistance (1d).
3. Perfuser le cœur avec un fixateur pendant 15 minutes, puis rincer avec un tampon de vasodilatation pendant au moins 2 minutes. Pendant ce temps, à la fois antérieur ligaturer Vena veines pour empêcher Microfil de s'échapper du cœur après l'injection (figure 1E). Sutures placer autour du PVC et de l'aorte, mais ne les serrez pas jusqu'à ce que après le remplissage.
4. Préparer le Microfil (tel que spécifié dans le tableau des réactifs) et le charger dans une seringue de 1 ml. Remplir le bac de dissection avec suffisamment d'eau pour couvrir le cathéter (manière à empêcher l'introduction de bulles d'air lors du passage de tube de perfusion à la seringue Microfil). Débranchez l'AP perfusionparatus du cathéter et connecter la seringue Microfil préparée.
5. Injecter le Microfil dans l'aorte jusqu'à un bon remplissage des artères coronaires est évident (fig. 1F, 3A): les artères se remplissent d'abord, puis l'Microfil sera "déborder" dans les capillaires comme les bouffées de tissus avec la couleur de la Microfil. Une fois sur le côté veineux, la nature hydrophobe de la Microfil qu'il occasionne aux initialement apparaître comme des sphères indépendantes comme il ressort des navires plus petits. Continuer à injecter le Microfil jusqu'à une colonne continue remplit les veines. Remplissage complet sera manifeste lorsque le Microfil est continue dans les vaisseaux, et il est sortie par l'intermédiaire du PVC.
6. Après remplissage est terminée, rapidement serrer les fils de suture qui ont été précédemment placées autour du PVC et de l'aorte pour empêcher la nature élastique du tissu cardiaque à partir du pressage Microfil hors des vaisseaux.
7. Couvrez le coeur avec de la gaze humide (imbibé d'eau à partir du bac de dissection) Pour empêcher sa dessèchement, et laissez-le reposer pendant environ 1 heure à température ambiante jusqu'à ce que le Microfil a polymérisé. Évitez toute pression extérieure sur le coeur pendant le procédé de polymérisation, comme soulever ou le retourner au cœur dans une tentative pour obtenir une vue rapide des récipients remplis à l'arrière du cœur. Cela peut presser Microfil de certains navires dans une zone plus élastique du cœur, provoquant des ruptures dans la Microfil.
8. Retirez le cœur et le post-fixer dans 4% PFA une nuit à 4 ° C. Puis stocker dans de l'éthanol 70% à 4 ° C. La vascularisation coeur est maintenant prêt pour l'imagerie μCT.

4. Les résultats représentatifs

Les navires qui sont effectivement irrigués par Microfil auront continue, ininterrompue tout au long de Microfil les vaisseaux (figure 3A). Le degré de remplissage des vaisseaux coronaires peut être jugée par les yeux; veines sont épicardique situé à ^18, et peut être facilement observée (figure 3A, tête de flèche); artères,qui sont plus intramyocardique ^18, sont également visible à travers la surface du coeur (figure 3A, flèche). Remplissage capillaire est également évident, que le tissu cardiaque a une très forte densité des capillaires et, par conséquent, lorsque le remplissage des capillaires, le tissu cardiaque sera rincer avec de la couleur de la Microfil (Fig. 3A, étoiles). Ainsi, les réseaux vasculaires qui ont échoué à remplir sera perceptible en raison de l'absence de Microfil (Fig. 3B, C).

Les discontinuités dans la Microfil (astérisques dans la figure 3B) apparaissent souvent parce que le caractère hydrophobe de la Microfil le fera se contracter sur lui-même et provoquer "casse" dans les vaisseaux remplis. Ces "casse" peut être réduit si la pression dans les vaisseaux est maintenue grâce à bon tie-offs des points de sortie vasculaires du coeur. Autres discontinuités peuvent être causées par les bulles d'air au sein de la microfiltration. Pour prévenir l'introduction de l'air, assurez-vous que l'angiocathéter est entièrement immergé dans l'eau lors du passage de l'AP perfusion reils à la seringue Microfil. Si une bulle d'air est introduite, elle peut souvent être éliminés simplement en continuant la perfusion Microfil ce que la bulle a été poussé à travers et hors des vaisseaux coronaires.

Réseaux vasculaires peuvent ne pas remplir complètement si une partie du lit vasculaire est bloquée (Fig. 3B, flèche). Bien que l'héparine inhibe la formation de caillots sanguins, les blocages occasionnels peuvent encore se produire en raison de la perfusion d'héparine incomplète avant de commencer la procédure, ou en raison d'autres facteurs inconnus. Si un blocage se produit, il est, à notre connaissance, aucune méthode pour déloger l'obstruction pour compléter le remplissage vasculaire. Remplissage incomplet peut également se produire si la pression est trop peu utilisé au cours du remplissage, comme le Microfil ne seront pas contraints à tous les lits vasculaires et les réseaux capillaires (Fig. 3C). A l'inverse, trop de pression peut causer des capillaires à éclater et s'extravaser Microfil dans le tissu environnant (Fig. 3D).

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Figure 1. Vue d'ensemble du régime de perfusion Microfil. (A) l'aorte et le PVC sont coupés à peu près au niveau de la membrane. (B) L'aorte ascendante est une canule avec un angiocathéter. (C) du tampon vasodilatation est perfusé à travers les vaisseaux, poussés par l'appareil de perfusion sous pression (non représenté), tandis que (D) les trois principales branches au large de la crosse de l'aorte sont ligaturés. (E) 4% PFA est perfusé par les artères coronaires alors que les deux Cavas antérieures Vena sont ligaturés. (F) utilisant une seringue, Microfil est perfusé à travers les artères coronaires jusqu'à ce qu'il soit constaté sortant du PVC.

Figure 2. Appareil de perfusion. Deux erlenmeyers, chacun rempli avec le tampon vasodilatation soit ou 4% PFA, sont unis et mis sous pression par des tubes reliés à leurs armes de poing. Le système est pressurisé à travers le pompage manuel de l'ampoule, et une jauge de pression est connecté à l'un des flacons pour permettre la surveillance et l'entretien de la pression. Les petits tubes s'étendent à travers un bouchon en caoutchouc et en bas dans le liquide dans chaque flacon. Pression d'entrer des armes de poing pompes le fluide à partir de chaque flacon de ces petits tubes. Les tubes ensuite fusionner à un robinet d'arrêt qui ne permet au fluide de s'écouler d'un flacon à la fois.

Figure 3. Goûtez cœur microchargés. (A) Les navires qui sont remplis et aura quelques-uns (le cas échéant) des ruptures dans la Microfil, et le tissu cardiaque sera teintée de la couleur de la Microfil en raison de la pleine capillaires (étoiles, et les comparer avec C). Les deux artères (flèche - artère descendante antérieure gauche) et les veines (tête de flèche - gauche veine coronaire) sont visibles à travers la surface du coeur. (B) Un coeur avec des pauses dans la microfiltration (astérisques) ainsi que des blocages dans certains navires qui empêchait Mic complèterofil pénétration. Les navires bloqués restent au rouge (flèche), que le sang n'a pas été purgés pendant le processus de perfusion. (C) Un coeur avec des navires qui ont été partiellement remplis. Notez que le tissu n'a pas pris la couleur jaune de la Microfil, indiquant la Microfil ne pas pénétrer dans les capillaires. (D) Un cœur où l'éclatement de la capillaires pendant le remplissage, provoquant la Microfil de s'infiltrer dans le tissu environnant (flèche).

Tissu cardiaque a une très forte demande métabolique, et nécessite donc un apport constant de nutriments et d'oxygène dans le sang fourni par le système vasculaire coronarien. Maladies des vaisseaux coronaires, qui diminuent la fonction coronarienne en raison de sténose du vaisseau et le blocage, peuvent conduire à une hypoxie tissulaire et de l'ischémie, et de mettre les patients affectés au risque d'infarctus du myocarde et des dommages irréparables au muscle cardiaque. Une meilleure compréhension de l'état maladif de ces navires est nécessaire, et vital pour notre capacité à étudier les vaisseaux coronaires est la visualisation de la vascularisation. Ici, nous présentons une méthode pour la préparation murin artères coronaires pour l'imagerie ex vivo en remplissant le système vasculaire d'un matériau radio-opaque. Ce protocole a été spécialement conçu pour assurer un remplissage complet, et par la suite de visualisation, de tous les vaisseaux coronaires, y compris les capillaires.

Pour assurer le remplissage complet de tous les capillaires, l'agen de remplissaget, Microfil, doit être injecté dans un système partiellement fermé qui va forcer l'Microfil en petits vaisseaux de résistance, de les plus élevés au sein du réseau vasculaire. Pour créer cette fermeture partielle au sein de notre système de remplissage in vivo, nous ligaturer les trois plus grandes, des artères à faible résistance de branchement de l'arc aortique. Bien que cela n'exclut pas tous les autres potentiels «fuite» des points, les navires restants (principalement les artères intercostales) sont suffisamment petits pour que toute perte de pression à travers eux n'interfère pas avec le remplissage complet du système vasculaire coronarien. Une fois que le Microfil a perfusé tous les navires dans le cœur, la nature innée élastique du tissu cardiaque et vasculaire seront presser le Microfil sur certains navires. Pour éviter cette perte de Microfil, nous ligaturer tous les points de sortie de grandes et accessibles, à savoir, à la fois cave supérieure veines, la veine cave postérieure, et l'aorte, après la vascularisation coronaire est complètement perfusés. De cette façon, la pression est maintained dans le coeur jusqu'à ce que le Microfil polymérise, permettant l'Microfil se conformer à la structure de récipient à la pression artérielle normale physiologique.

Par ailleurs, si la visualisation des capillaires n'est pas nécessaire, il est également possible de remplir uniquement les lits artériels ou veineux seulement vasculaires. Les versions les plus visqueux de Microfil peut être mélangé à l'aide d'un diluant à haute viscosité (disponible à partir FlowTech). Le perfusat plus visqueux est incapable de pénétrer les capillaires, et permet donc la visualisation des artères les seuls, ou uniquement les veines si perfusé du côté veineux. En outre, le protocole présenté ici peut facilement être adapté à d'autres espèces ou non des souris adultes. Mise à l'échelle de façon appropriée la procédure à correspondre à la taille de l'animal a besoin simplement ce que le cathéter et le tube de perfusion sont de taille appropriée à l'aorte de l'animal de façon à minimiser les fuites et empêcher étirement ou de rupture. Les volumes de fluides injectés (c.-à-héparine,KCl saturée, et la Microfil) doit également être mise à l'échelle appropriée.

Notre protocole a été spécialement conçu pour l'injection de Microfil et l'imagerie par μCT, cependant, il peut facilement être adapté à d'autres agents de remplissage, soit pour l'analyse μCT, ou d'autres techniques d'imagerie ex vivo. Lorsque la recherche d'μCT charges compatibles, il ya plusieurs options de colorants radio-opaques, en tant que substances utilisées pour le remplissage de nombreux et se former vasculaire par l'intermédiaire d'autres méthodes d'imagerie (par exemple acrylique) peut être perfusé avec un matériau opaque à la radio, tel qu'un pigment ⁹ plomb ou une solution de l'osmium ^3. Indépendamment de l'agent de remplissage utilisé, μCT imagerie offre l'avantage que les résultats peuvent être reconstruites dans un modèle 3D pour fournir des mesures vasculaires ainsi que des informations structurelles sur le mode de ramification des vaisseaux coronaires remplis ^6,7,14,19. En outre, l'imagerie par μCT conserve le tissu environnant, ce qui permet une supplémentairealyses après le scan. Ainsi, les cœurs remplis et scannés peuvent être traitées pour l'analyse histologique, et les coupes colorées pour différents marqueurs peuvent être alignées avec les données μCT de corréler l'identité artérielle / veineuse, la présence de couches musculaires lisses, ou d'autres indices histologiques.

Autres communes des techniques d'imagerie vasculaire exigent également le remplissage vasculaire et notre protocole peut facilement être adapté pour perfuser les artères coronaires avec n'importe lequel de ces autres agents de remplissage. Microscopie électronique à balayage (MEB) nécessite le remplissage des navires et puis la dissolution du tissu mou loin de la fonte vasculaire établie dans un processus appelé coulée à la corrosion. Afin de maintenir la forme des vaisseaux sans le soutien de la tissus mous environnants, l'agent de remplissage doit être forte et non fragile: souvent une résine acrylique (par exemple MercOx, Batson) ^3,20,21. Alors que SEM fournit des résolutions de numérisation largement supérieure à celle de μCT imagerie ^22, la troupe à la corrosionING procédure détruit le tissu, empêchant toute analyse des tissus supplémentaires. Procédé d'imagerie d'un autre ex vivo de l'système vasculaire coronaire, tomographie optique de projection (TPO), peut détecter la lumière visible ou proche du visible, et permet ainsi à la détection du signal fluorescent en plus chromogène précipités comme le précipité pourpre produite par la phosphatase alcaline conversion de BCIP / NBT (5-bromo-4-chloro-3-indolyle phosphate/4-nitro bleu de tétrazolium) ^23-25. La visualisation des vaisseaux, donc, qui peut être accompli soit par remplissage avec une substance fluorescente (par exemple PU4ii: une résine de polyuréthane ^3, ou la fluorescéine infusé dextrane ^26), ou par le biais de non-remplissage des méthodes, comme l'ensemble du montage via immunodétection soit par fluorescence ou un histochimique précipité chromogène (par exemple BCIP / NBT) ^23. OPT imagerie peut atteindre des résolutions légèrement meilleure que celle de μCT (à environ 1 micron), mais, à la fois pour le remplissage et le immunodetection des méthodes les tissus mous environnants doivent être chimiquement effacé, ce qui peut perturber certains antigènes pour l'analyse histologique post-numérisation.

Il existe également plusieurs méthodes pour l'imagerie de la vascularisation coronaire qui ne nécessitent pas de remplissage vasculaire ou immunodétection, et en tant que telle peut être effectuée in vivo. Une technique, de contraste pour ultrasons à haute résolution améliorée (CEHRUS), utilise des microbulles de gaz remplis comme un agent de contraste. L'injection de ces microbulles dans la circulation sanguine permet la visualisation de l'écoulement du sang avec des mesures de débit en temps réel jusqu'au niveau capillaire, mais il ne fournit pas une vue 3D des vaisseaux imagées ^2,27-31. Une autre méthode, angiographie par résonance magnétique (ARM) a également été utilisé pour les navires coronaires image ^32-34, et les progrès récents dans l'ARM ont étendu ses capacités d'imagerie pour obtenir en temps réel des mesures du débit sanguin ^35,36. Bien que l'ERM peut produire des reconstitutions en 3D de la vexelles imagée, la résolution de l'ARM est actuellement limitée à environ 100 microns, et ne permet donc pas d'identifier des navires plus petits (capillaires, artérioles et veinules).

Depuis deux CEHRUS et ARM peut être effectuée sur des animaux vivants, ils offrent l'avantage de l'écoulement du sang à plusieurs reprises et de surveillance non invasive et le développement vasculaire. Toutefois, la résolution relativement faible de l'ARM et le manque de capacités 3D à partir de CEHRUS obstacle imagerie du réseau coronaire dans son ensemble. Ainsi, les techniques d'imagerie in vivo ex vasculaires qui nécessitent des agents de remplissage ou d'immunodétection sont importants pour obtenir des informations 3D haute résolution du système vasculaire coronarien, alors que dans des techniques in vivo fournissent de précieuses informations concernant la fonctionnalité du réseau vasculaire (c.-à-données de flux) au fil du temps . La combinaison de l'analyse en temps bien sûr in vivo avec le point final ex imagerie in vivo fournit un système puissant pour l'étude de la vascularisation coronaire.

Les souris ont été traitées avec des méthodes approuvées par le soin des animaux et du Comité institutionnel utilisation de l'Université de Washington et en conformité avec le Guide pour les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire publié par l'Institut national américain de la Santé (NIH Publication No. 85-23, révisée en 1996).

Nous remercions le Dr Kelly Stevens pour les essais initiaux du protocole, le Dr Michael Simons, Hauch Kip Dr, et les membres de leurs deux laboratoires pour la discussion générale.

Ce travail est le soutien par des subventions du NIH HL087513 et P01 HL094374.