Ретроградная перфузия и заполнение мыши коронарных артерий, как подготовка к Micro компьютерной томографии изображений

Визуализация коронарных сосудов имеет решающее значение для продвижения нашего понимания сердечно-сосудистых заболеваний. Здесь мы опишем метод перфузии мышиных коронарных артерий с резиновой рентгеноконтрастные силиконовые (Microfil), в рамках подготовки к микро-компьютерной томографии (μCT) изображений.

Визуализация сосудистой становится все более важным для понимания различных болезненных состояний. Хотя существует несколько методов для визуализации сосудистой, немногие из них способны визуализировать сосудистую сеть в целом в то время как расширение к резолюции, которая включает в себя более мелкие суда ^1,2. Кроме того, многие сосудистые методы литья уничтожать окружающие ткани, предотвращая дальнейший анализ образцов ^3-5. Один из методов, который обходит эти вопросы, является микро-компьютерной томографии (μCT). μCT можете сканировать изображения с разрешением <10 мкм, способна производить 3D-реконструкция сосудистой сети, и оставляет нетронутыми ткани для последующего анализа (например, гистологии и морфометрии) ^6-11. Тем не менее, изображение суда экс естественных методов μCT требует, чтобы суда заполнена рентгеноконтрастного вещества. Таким образом, точное представление о сосудистой производства μCT визуализация зависит отдостоверного и полного наполнения сосудов. В этом протоколе описываются методики для заполнения мыши коронарных сосудов при подготовке изображений μCT.

Два преобладают методы существуют для заполнения коронарных артерий: в естественных условиях с помощью катетеризации и ретроградной перфузии аорты (или отделение от дуги аорты), ^12-14, или бывших естественных условиях через систему Langendorff перфузии ^15-17. Здесь мы опишем в естественных условиях катетеризации аорты метод, который был специально разработан, чтобы обеспечить заполнение всех судов. Мы используем низкую вязкость рентгеноконтрастное соединение называется Microfil который может заливать через мельчайшие сосуды, чтобы заполнить все капилляры, а также как артериальных и венозных стороны сосудистой сети. Сосуды озарен буфера с помощью системы перфузии под давлением, а затем заполнены Microfil. Для того, чтобы Microfil заполняет небольшую высших судов сопротивление, мы перевязывать крупные ветви emanatinг от аорты, которая отвлекает Microfil в коронарные артерии. После завершения заполнения, чтобы не допустить упругий характер сердечной ткани от сжатия Microfil из некоторых судов, мы перевязывать доступны основных сосудистых точек выхода сразу после заполнения. Таким образом, наша техника оптимизирована для полного заполнения и сохранения максимальной наполнителя, что позволяет визуализировать полный коронарных сосудов сети - артерий, капилляров, вен и так.

1. Подготовка перед началом

1. Заполнение каждой стороне аппарата перфузионного давления с Сосудорасширяющие буфера (4 мг / л Папаверин + 1 г / л Аденозин в PBS), или 4% параформальдегид (PFA) в PBS, соответственно.
2. Подготовить 1/2cc шприц инсулина (с постоянно соединенные 29G ½ "иглы), наполнив ее 0,1 мл 1:100 гепарин (5000U/ml акций) и изгиб иглы до ~ 120 градусов углом наклона вверх. У то же самое с 1 мл шприц (с 26G ½ "игла), заполненную 0,3 мл насыщенного KCl решение.

2. Разоблачение сердца и аорты cannulating

1. Анестезию мыши с помощью анестезии выбора. (Мы используем передозировки кетамином / Ксилазин смеси. IP введения 130 мг / кг кетамина и 8,8 мг / кг Ксилазин в физиологическом растворе)
2. Прикрепите наркозом мыши на вскрытии лоток, брюшной стороной вверх. Откройте брюшной полости средней линии разреза и убрать кожуподвергать органов. Перемещение кишечник в сторону, чтобы разоблачить области задней полой вены (ПВХ).
3. Вводите Гепарин раствор в ПВХ. Как извлечь иглы, игла охватывают отверстие ватным наконечником аппликатором, чтобы предотвратить утечку и удерживайте ее в течение нескольких секунд, пока ПВХ сгустки стены и печатями. Подождите 2-3 минут гепарин для разгона всей мышь обращения.
4. Проанализируйте диафрагмы и грудной клетки, таким образом Вы можете наблюдать за бьющееся сердце. Медленно введите KCl решение в ПВХ, пока сердце аресты.
5. Удаление всех органов ниже диафрагмы и акцизов задней части мыши, в результате чего область передней мембраны неповрежденными. Удалите диафрагму, стараясь резать ПВХ вблизи диафрагмы, так что часть проксимальных к сердцу легко найти в последующих шагах.
6. Найдите срез аорты. Положите одну длинную длину 6-0 плетеный шовный шелк под аорты несколько миллиметров переднюю сюдам срез так, что шов в два раза обратно на себя. Вырезать это больше шов пополам, так есть 2 части шва под аортой. Вставьте ангиокатетер в разрезе конца аорты (рис. 1а, б) и связать каждый шов с двойной узел провести ангиокатетер на месте и предотвращения обратного давления в аорте от утечки.

3. Перфузии и инъекции Microfil

1. Подключите ангиокатетер к аппарату перфузионного давления (рис. 2) и начать перфузии сосудов с сосудорасширяющим буфера (рис. 1С) путем закачки перфузии аппарат вождения давление 100-110 мм рт. Дважды проверьте, что буфер перфузии через коронарные артерии, обеспечивая жидкость выходит из ПВХ. Продолжайте заливать в течение 3 минут, пока жидкость не выходя из ПВХ ясно. (Переходите к следующему шагу в то время перфузии.)
2. Проанализируйте ребра и пин-код обратно (или удалить) грудной клетки, чтобы разоблачить сердце. После подвергается, быть окreful не допустить, чтобы сердце высыхают, сжимая капли буфера на сердце из буфера пропитанный кусок марли. Очистить от вилочковой железы, чтобы разоблачить дуги аорты. Перевязывать трех основных ветвей аорты использованием 6-0 плетеный шовный шелк для обеспечения жидкость отводится через коронарные артерии, а не через эти большие, низкие сопротивления сосудов (рис. 1D).
3. Заливать сердца с фиксатором в течение 15 минут, затем смойте Расширение сосудов буфера в течение 2 минут. Между тем, как перевязывать передней полой вен, чтобы предотвратить утечку Microfil из сердца после инъекции (рис. 1Е). Место вокруг швов ПВХ и аорты, но не затягивайте их до окончания заполнения.
4. Подготовка Microfil (как указано в таблице реагентов) и загрузить его в 1 мл шприц. Заполните рассечение лоток с достаточным количеством воды, чтобы покрыть катетер (таким образом, чтобы предотвратить введение пузырьков воздуха при переходе от перфузии трубки к Microfil шприца). Отключите перфузии APparatus от катетера и подключение подготовленный шприц Microfil.
5. Вводите Microfil в аорту до хорошего наполнения коронарных артерий видно (рис. 1F, 3А): артерии, заполнить, а затем Microfil будет "проливать" в капиллярах, как ткань жара с цветом Microfil. После того как на венозную стороны, гидрофобный характер Microfil заставляет его сначала появляются как независимые сферы, как он выходит из мелких судов. Продолжайте вводить Microfil до непрерывного столбца наполняет вены. Полное заполнение будет видно, когда Microfil непрерывно в судах, и выходят через ПВХ.
6. После заполнения завершена, быстро затянуть швы, которые ранее были размещены вокруг ПВХ и аорты, чтобы предотвратить упругий характер сердечной ткани сжимая Microfil из сосудов.
7. Закройте сердце мокрой марлей (пропитанный водой от рассечения лоток) Для предотвращения ее высыхания, и оставьте примерно на 1 час при комнатной температуре до Microfil был полимеризуется. Избегайте любого давления извне на сердце во время процесса полимеризации, такие как подъем или поворот сердца в попытке получить ранний вид заполненных сосудов в задней части сердца. Это может выжать Microfil из некоторых судов в более упругой области сердца, вызывая разрывы в Microfil.
8. Удалить сердца и пост-это исправить в 4% PFA в течение ночи при 4 ° C. Затем хранить в 70% этанолом при температуре 4 ° C. Сердце сосудистой готов для работы с изображениями μCT.

4. Представитель Результаты

Суда, которые эффективно перфузии по Microfil будет иметь непрерывный, непрерывный Microfil всем судам (рис. 3А). Степень заполнения коронарных сосудов можно судить на глаз, вены epicardially расположен в ^18, и может быть легко наблюдается (рис. 3А, стрелки); артерий,, которые являются более интрамиокардиальной ^18, также видны через поверхность сердца (рис. 3А, стрелка). Капиллярная заполнения также очевидна, как сердечная ткань имеет очень высокую плотность капилляров, и поэтому, когда капилляры заполнения, сердечной ткани будут на одном уровне с цветом Microfil (рис. 3А, звезды). Таким образом, любой сосудистой сети, которые не смогли заполнить будет заметно в связи с отсутствием Microfil (рис. 3B, C).

Разрывы в Microfil (звездочки на рис 3B) часто возникают потому, что гидрофобный характер Microfil заставит его заключить в себя и вызвать «разрывов» в заполненный суда. Эти "разрывы" может быть уменьшен, если давление внутри сосудов поддерживается за счет надлежащего тай-офф сосудистых точек выхода из сердца. Другие разрывов может быть вызвано пузырьками воздуха в Microfil. Чтобы избежать введения воздуха, убедитесь, что ангиокатетер полностью погружен в воду при переходе от перфузии AP paratus к Microfil шприц. Если пузырек воздуха вводится, он часто может быть удален только путем продолжения Microfil перфузии, пока пузырь был протолкнул и из коронарных сосудов.

Сосудистая сеть не может заполнить полностью, если часть сосудистого русла блокируется (рис. 3Б, стрелка). В то время как гепарин препятствует образованию тромбов, иногда завалами еще может произойти из-за неполной перфузии гепарин до начала процедуры, или в силу других неизвестных факторов. Если блокировка происходит, то, по нашим сведениям, ни один метод для выбить блокировки для завершения сосудистых заполнения. Неполное заполнение может также возникнуть, если слишком мало давления используется во время наполнения, как Microfil не придется во все сосудистого русла и капиллярной сети (рис. 3в). С другой стороны, слишком сильное давление может привести к капилляры лопаются и вытекать из сосудов в ткань Microfil в окружающие ткани (рис. 3).

files/ftp_upload/3740/3740fig1.jpg "ALT =" Рисунок 1 "/>
Рисунок 1. Обзор Microfil схемы перфузии. (A) аорты и ПВХ сократить примерно на уровне диафрагмы. (B) восходящая аорта канюлю с ангиокатетер. (C) Расширение сосудов буфер перфузии через сосуды, обусловлен аппарат перфузионного давления (не показан), а (D) три основные ветки дуги аорты лигируют. (E) 4% PFA в перфузию через коронарные артерии в то время как передняя Cavas Вена лигируют. (F) с помощью шприца, Microfil в перфузию через коронарные артерии, пока не наблюдается выход из ПВХ.

Рисунок 2. Перфузии аппарата. Две колбы Эрленмейера, заполненных либо буфер Расширение сосудов, или 4% PFA, соединяются и под давлением через трубы, связанных с их штыки. Система находится под давлением с помощью ручного накачкилампочки, а манометр подключен к одной из колб для мониторинга и поддержания давления. Малый трубы проходят через резиновые пробки и вниз в жидкости в каждой колбе. Давление, поступающих из личного оружия насосов жидкость из колбы из этих небольших труб. Трубы затем сливаются в кран который только позволяет жидкости течь из одной колбы в то время.

Рисунок 3. Попробуйте Microfilled сердца. (A) судов, которые заполняются и будут иметь несколько (если таковые имеются) перерывы в Microfil и ткани сердца будет оттенком цвета Microfil из-за заполненных капилляров (звезда, и сравнить с C). Обе артерии (стрелка - левой передней нисходящей артерии) и вен (стрелки - левой коронарной вены) видны через сердце поверхности. (B) сердце с перерывами в Microfil (звездочки), а также завалы в некоторых судов, которые помешали полной микрофонаrofil проникновения. Заблокированы суда остаются красные (стрелка), а кровь не смывается во время перфузии процесса. (C) сердце с сосудами, которые были полностью заполнены. Обратите внимание на ткань не принимает на желтый цвет Microfil, с указанием Microfil не проникает в капилляры. (D), где сердце взрыв во время наполнения капилляров, что приводит к Microfil, чтобы просочиться в окружающие ткани (стрелка).

Сердечная ткань имеет очень высокую метаболическую спрос и, следовательно, требует постоянного поступления питательных веществ и кислорода из крови доставлен в коронарных сосудов. Заболевания коронарных сосудов, которые уменьшают коронарный функции из-за стеноз сосудов и блокировки, может привести к гипоксии и ишемии тканей, и положил пострадавших пациентов с риском развития инфаркта миокарда и непоправимый вред сердечной мышце. Лучшего понимания больных состояние этих сосудов является необходимым, и решающее значение для нашей способности учиться коронарных сосудов визуализации сосудов. Здесь мы представляем способ получения мышиных коронарных артерий для работы с изображениями естественных бывший заполнив сосудистой с рентгеноконтрастного материала. Этот протокол был специально разработан, чтобы обеспечить полное заполнение, а затем и визуализации, всех коронарных сосудов, включая капилляры.

Чтобы обеспечить полное заполнение всех капилляров, заполнение агентствт, Microfil, должен быть введен в частично закрытая система, которая заставит Microfil в меньшие, более высокое сопротивление сосудов в сосудистой сети. Для создания этого частичного закрытия в наших в естественных условиях заполнение системы, перевязывать три больше, низкое сопротивление артерии отходит от дуги аорты. Хотя это не исключает всех других потенциальных «утечка» точек, остальные суда (главным образом межреберных артерий) достаточно малы, что любые потери давления в них не вмешивается в полное заполнение коронарных сосудов. После Microfil был озарен все сосуды в области сердца, врожденный упругий характер сердечной и сосудистой ткани прижмет Microfil из некоторых судов. Чтобы предотвратить эту потерю Microfil, мы перевязывать все большие и доступные точки выхода, а именно, как верхней полой вен, задней полой вены, аорты и после коронарных артерий полностью перфузии. Таким образом, давление мaintained в сердце, пока Microfil полимеризуется, что позволяет Microfil в соответствие к судну при нормальных физиологических кровяное давление.

Кроме того, если визуализации капилляров не требуется, это также можно заполнить только артериальной или венозной только сосудистого русла. Более вязкие версии Microfil можно смешивать использованием высоких разбавителя вязкость (доступен Flowtech). Более вязкой перфузат не может проникать в капилляры, и, следовательно, позволяет визуализировать только артерий, или только вены, если перфузии с венозной стороне. Кроме того, протокол, представленные здесь могут быть легко адаптированы для других видов или без взрослых мышей. Расширение процедуры надлежащим образом соответствуют размеру животное просто требует, чтобы катетер и перфузии трубки имеют соответствующего размера в аорте животных так, чтобы минимизировать утечку и предотвратить растяжение или разрыв. Объем жидкости вводят (т.е. гепарин,насыщенный KCl и Microfil) также должны быть соответствующим образом масштабируются.

Наш протокол был специально разработан для инъекций Microfil и изображений на μCT, однако, могут быть легко адаптированы для других наполнителей, либо для μCT анализа, или другие методы естественных бывший изображений. При поиске μCT совместимых наполнителей, есть несколько вариантов рентгеноконтрастных красителей, так как многие вещества, используемые для наполнения и изучения сосудистой помощью других методов визуализации (например, акрил) могут вводиться с радио непрозрачного материала, например, свинца пигмента ⁹ или осмий решение ^3. Независимо от наполнителя используется, μCT изображение имеет то преимущество, что результаты могут быть восстановлены в 3D-модели для обеспечения сосудистого измерений, а также структурную информацию о ветвления наполненных коронарных сосудов ^6,7,14,19. Кроме того, изображение на μCT сохраняет окружающие ткани, что позволяет обеспечить дополнительныйalyses после сканирования. Таким образом, заполнить и сканирование сердца может быть обработан для гистологического анализа и срезах, окрашенных в различные маркеры могут быть приведены в соответствие с μCT данные коррелируют артериального / венозного личности, наличием гладких слоев мышц, или дополнительного гистологического индексов.

Другие распространенные методы визуализации сосудистой также требуется заполнение сосудистого и наш протокол может быть легко адаптирована для перфузии коронарных артерий с любой из этих других наполнителей. Сканирующей электронной микроскопии (SEM) требует заполнения сосудов и растворения мягких тканей от установленной сосудистой литья в процессе, называемом коррозии отливки. Для того, чтобы поддерживать форму суда без поддержки со стороны окружающих мягких тканей, наполнитель должен быть сильным и не хрупкой: часто акриловой смолы (например, Mercox, Бэтсон в) ^3,20,21. В то время как SEM обеспечивает сканирование резолюции значительно выше, чем μCT изображения ^22, коррозия литойследующая процедура разрушает ткани, предотвращая любые дополнительный анализ тканей. Другой метод бывших естественных изображений коронарных артерий, оптическая томография проекции (ОПТ), можно обнаружить видимые или почти видимого света, и таким образом позволяет для обнаружения флуоресцентные сигналы в дополнение к хромогенных осадков, такие как фиолетовый осадок производства щелочной фосфатазы преобразование BCIP / NBT (5-бром-4-хлор-3-индолил phosphate/4-nitro тетразолия) ^23-25. Визуализация сосудов, поэтому, может быть достигнуто либо путем заполнения флуоресцентным веществом (например, PU4ii: полиуретановая смола ³ или флуоресцеин проникнуты декстран ^26), или через не-заполнение методы, такие как весь монтаж иммунодетекции либо через флуоресценции или гистохимические хромогенных осадок (например, BCIP / NBT) ^23. OPT изображения можно добиться резолюции немного лучше, чем у μCT (около 1 мкм), однако для наполнения и immunodetection методы окружающие мягкие ткани должны быть химически очищены, которые могут привести к нарушению некоторых антигенов для гистологического анализа после сканирования.

Есть также несколько методов для визуализации коронарных артерий, которые не требуют заполнения сосудистой или иммунологического, и как таковые могут быть выполнены в естественных условиях. Один из методов, контрастность высокая Расширенные Ультразвуковое разрешение (CEHRUS), используются газонаполненные микропузырьки в качестве контрастного вещества. Введение этих микропузырьков в крови позволяет визуализировать поток крови в режиме реального времени измерения расхода до капиллярного уровня, но он не обеспечивает 3D вид отображаемых суда ^2,27-31. Другой метод, магнитно-резонансной ангиографии (МРА), также был использован для изображений коронарных сосудов ^32-34, и последние достижения в MRA расширили свои возможности для получения изображений в режиме реального времени измерения кровотока ^35,36. В то время МРА может производить 3D-реконструкции веssels отображаемого, разрешение MRA в настоящее время ограничена примерно до 100 мкм, и, следовательно, не может определить меньше сосудов (капилляров, артериол и венул).

Так как CEHRUS и MRA может быть выполнено на живых животных, они дают преимущество в несколько раз и неинвазивного мониторинга кровотока и сосудистого развития. Тем не менее, относительно низкое разрешение MRA и отсутствие возможности 3D с CEHRUS препятствует визуализации коронарных сети в целом. Таким образом, экс естественных методов визуализации, которые требуют сосудистой наполнителей или иммунодетекции имеют важное значение для получения высокого разрешения 3D информации коронарной сосудистой системы, в то время как в естественных условиях методы дают ценную информацию о функциональности сосудистой сети (например, поток данных) с течением времени . Объединение в естественных условиях анализ учебного времени с конечной точкой бывшего естественных изображений обеспечивает мощная система для исследования коронарных сосудов.

Мыши были обработаны с помощью методов утвержденным Уходу за животными и использованию комитета Университета Вашингтона и в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных опубликованы американским Национальным институтом здоровья (NIH публикации № 85-23, пересмотренным в 1996 г.).

Мы благодарим доктора Келли Стивенс для начальных попыток протокола, д-р Майкл Симмонс, доктор Кип Hauch и членов обоих своих лабораториях для общего обсуждения.

Эта работа является поддержка грантов NIH HL087513 и P01 HL094374.