Этот метод помогает преодолеть ограничения в изучении гематопоэтического развития человека, предоставляя простую и уроченную платформу in vitro, основанную на прямом перепрограммирование клеток. Визуальная демонстрация этого метода обеспечит идеальное руководство в фундаментальных шагов для создания человеческих гемогенных клеток, а именно во время лентивирусного производства, фибробластовой трансдукции и клеточной культуры. Путем преобразовывать фибробласты кожи в гемогенные прекурсоры, мы надеемся произвести пациента специфические гематопоэтические ствол и клетки progenitor в достаточных номерах для трансплантации стволовой клетки.
Начните с выращивания HEK293T клеток в 100-миллиметровой культуры ткани лечение блюдо с 10 миллилитров полного DMEM при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа до слияния. За день до трансфекции, после аспирации среды, тщательно промыть блюдо пятью миллилитров PBS и отделить клетки с 1,5 миллилитров диссоциации раствора. После инкубации в течение пяти-десяти минут при 37 градусах Цельсия, инактивировать раствор с тремя миллилитров полного DMEM и передачи подвески клетки в 15 миллилитров конической трубки.
Вымойте блюдо с 5 миллилитров полного DMEM, чтобы удалить все оставшиеся прикрепленные клетки и вытащить мыть с клеточным раствором. Соберите клетки путем центрифугации, аспирировать супернатант и повторно помыть гранулы в шесть миллилитров полного DMEM. Затем, разделить подвеску равномерно между шестью 100 миллиметров ткани культуры обработанные блюда в конечном томе 10 миллилитров полного DMEM на блюдо.
На следующий день добавьте 10 микрограммов общей массы трех плазмидов переноса вместе в новую 15 миллилитровую коническую трубку. Далее добавьте 10 микрограммов второго поколения вектора упаковки psPAX2, кодирующих гены кляпа, pol, tat и rev с последующим добавлением пяти микрограммов pMD2. Вектор конверта G, кодирующий ген VSV-G к трубке.
Наконец, добавьте воду, чтобы довести конечный объем до 500 микролитров. В двух новых 15 миллилитровых конических трубок добавьте 10 микрограммов плазмиды FUW-M2rtTA, 10 микрограммов вектора упаковки и пять микрограммов вектора оболочки к каждой трубке. Затем добавьте воду до конечного объема в 500 микролитров в каждую трубку.
Далее добавьте 62,5 микролитров двух хлорида молярного кальция к каждой из трех трубок и используйте контроллер пипетки, оснащенный Пастер Пипетт, чтобы выпустить пузырьки в каждую смесь. В то время как пузырьки формируются, добавить 500 микролитров BES буферной солевой dropwise против Пастер Pipette и на смесь. Инкубировать трубки при комнатной температуре, по крайней мере 15 минут, пока смеси появляются слегка облачно.
Во время инкубации тщательно замените супернатант клеточных культур HEK293T 10 миллилитров полного DMEM без антибиотиков. Распределите комплексы ДНК на отдельные блюда культуры клеток HEK293T и инкубировать в течение 24 часов. На следующий день, заменить supernatants с четырьмя миллилитров полного DMEM за культуру и вернуть блюда на 37 градусов по Цельсию 5%углекислого газа культуры инкубатора ночь.
На следующее утро, собирать supernatants в один 50 миллилитров трубки на блюдо и добавить четыре миллилитров свежей среды для каждого блюда. После еще восьми часов культуры, бассейн супернатант в каждом блюде с ранее собранным супернатантом и добавить четыре миллилитров свежей среды. Верните блюда в инкубатор клеточной культуры на ночь и соберите супернатанты в последний раз.
Когда весь вирус был собран, фильтруйте каждый лентивирусный супернатант через 0,45 микрометровый фильтр связывания низкого белка в отдельные трубки и добавляйте максимум 15 миллилитров фильтрованного супернатанта к отдельным центробежным фильтрам для центробежки. Отбросьте поток через. В блоке фильтра останется вязкий лентивирус, содержащий жидкость.
Когда все лентивирусные супернатанты были отфильтрованы aliquot от 50 до 200 микролитров концентрированных лентивирусов для холодного хранения. Перед началом процедуры перепрограммирования кодировать шесть хорошо ткани культуры обработанной пластины с 500 микролитров 0,1% желатина на колодец и инкубировать пластину в течение 20 минут при 37 градусов по Цельсию. В конце инкубации, аспирировать оставшийся раствор желатина.
Плита человека кожные фибробласты при плотности 1,5 раза десять до пятой клетки на тарелку в двух миллилитров полного DMEM на колодец и инкубировать на ночь. На следующее утро, заменить средний в каждой хорошо с двумя миллилитров полного DMEM дополнены восемью микрограммами на миллилитр полибрена и добавить один к одному смесь пула производства транскрипции фактор лентивирусов и M2rtTA в новой микроцентрифуг трубки. Затем вывести фибробласт с оптимальным объемом лентивирусной смеси, от 10 до 100 микролитров на колодец.
После 16 часов инкубации замените супернатанты на полный DMEM и верните клетки в инкубатор клеточной культуры на шесть-восемь часов. После выздоровления замените супернатанты двумя миллилитров полного DMEM, дополненных полибреном, и выполните вторую трансдукцию, как только что продемонстрировано. В конце второй инкубации трансдукции замените супернатанты полным DMEM, дополненным одним микрограммом на миллилитр доксициклина, и верните пластину в инкубатор клеточной культуры в течение 48 часов.
В конце инкубации, разделить каждый хорошо на один-два соотношения и replate клетки в два миллилитров на колодец гематопоэтической среды дополняется доксициклина в новом желатин покрытием шесть хорошо пластины. Чтобы получить достаточное количество клеток для анализа секвенирования иммунопреципиентации хроматина, пластина три раза от 10 до пятого фибробластов в желатине покрытием шесть хорошо пластины и инкубировать на ночь. В конце инкубации, трансдуцирование клеток два раза в течение двух дней подряд с 10 до 20 микролитров лентивируса, содержащего индивидуальные факторы, представляющие интерес или пул из трех факторов плюс FUW-M2rtTA на один к одному соотношению.
Через 16 часов после второй трансдукции удалите вирус, содержащий супернатант, и инкубировать клетки в полном DMEM в течение 24 часов. В конце инкубации, replate содержание каждого хорошо в отдельных желатина покрытием 100 миллиметров ткани культуры обработанные блюда с полным DMEM до конечного объема 10 миллилитров среднего на блюдо, и вернуть клетки в инкубатор клеточной культуры. Через шесть дней замените супернатант полным DMEM, дополненным доксициклиным.
Верните культуры в инкубатор еще на два дня. Как показывают эти репрезентативные цитометрические участки, примерно 17% перепрограммированных ячеек выражают как CD49f, так и CD9 после 25 дней перепрограммирования. Большинство двойных положительных клеток выражают CD143, а небольшая популяция выражает CD34, что свидетельствует о динамической гемогенной индукции судьбы.
Эти маркеры не активируются в M2rtTA трансдуцированных человеческих кожных фибробластов, культурных в течение 25 дней. Иммунофлуоресценция изображения подтверждает выражение CD9 и CD143 в адепт и круглые клетки, которые морфологически отличаются от фибробластов, которые являются отрицательными для этих маркеров. Яркая визуализация выполняется для визуализации слияния клеток, морфологии и формирования колоний на протяжении всего процесса перепрограммирования.
Одноклеточный анализ секвенирования РНК перепрограммированных ячеек показывает пошаговое увеличение экспрессии CD49f, CD9 и CD143 с двух дней до 25. После секвенирования иммунопреципиентации хроматина профили Genome Browser показывают, что GATA2 привязи к геномным регулятивным регионам ITGA6 и ACE, когда фибробласты котрансдуируются с тремя факторами или GATA2 индивидуально. Объем противовирусных частиц, добавленных в культуру, должен быть оптимизирован для успешного перепрограммирования без ущерба для жизнеспособности клеток.
Эта платформа может быть соединена с фармакологическим ингибированием и технологиями скрининга генома, такими как CRISPR-Cas9, для определения новых регуляторов человеческого окончательного гематопоеза. Такой подход прямого перепрограммирования позволит исследователям изучить новые вопросы в области развития человека гематопоэза и расшифровать механизмы, лежащие в основе спецификации человеческих гематопоэтических стволовых клеток. Важно выполнять противовирусные сборы и переливки в капюшоне ламинарного потока, предназначенного для лентивирусной работы, и выбрасывать вирусные загрязненные отходы в соответствующий контейнер.
