Este método ajuda a superar limitações no estudo do desenvolvimento hematopoiético humano, fornecendo uma plataforma in vitro simples e tratável baseada na reprogramação celular direta. A demonstração visual deste método fornecerá orientação ideal em etapas fundamentais para a geração de células hemogênicas humanas, ou seja, durante a produção lentiviral, transdução do fibroblasto e cultura celular. Convertendo fibroblastos de pele em precursores hemogênicos, esperamos gerar células-tronco hematopoiéticas específicas do paciente e progenitoras em número suficiente para transplante de células-tronco.
Comece cultivando células HEK293T em um prato tratado de cultura tecidual de 100 milímetros com 10 mililitros de DMEM completo a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono até a confluência. No dia anterior à transfecção, após aspirar o meio, lave o prato cuidadosamente com cinco mililitros de PBS e desprende as células com 1,5 mililitros de solução de dissociação. Depois de incubar por cinco a 10 minutos a 37 graus Celsius, inativar a solução com três mililitros de DMEM completos e transferir a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mililitros.
Lave o prato com 5 mililitros de DMEM completo para remover todas as células anexadas restantes e puxe a lavagem com a solução celular. Recolher as células por centrifugação, aspirar o supernasce e resuspensar a pelota em seis mililitros de DMEM completo. Em seguida, divida a suspensão uniformemente entre seis pratos tratados de cultura de tecido de 100 milímetros em um volume final de 10 mililitros de DMEM completo por prato.
No dia seguinte, adicione 10 microgramas de massa total dos três plasmídeos de transferência juntos a um novo tubo cônico de 15 mililitros. Em seguida, adicione 10 microgramas da segunda geração do vetor de embalagem psPAX2 codificando os genes gag, pol, tat e rev seguidos pela adição de cinco microgramas de pMD2. G envelope vetor codificando o gene VSV-G para o tubo.
Por fim, adicione água para levar o volume final a 500 microliters. Em dois novos tubos cônicos de 15 mililitros, adicione 10 microgramas de plasmídeo FUW-M2rtTA, 10 microgramas do vetor da embalagem e cinco microgramas do vetor envelope a cada tubo. Em seguida, adicione água até um volume final de 500 microliters a cada tubo.
Em seguida, adicione 62,5 microliters de dois cloretos de cálcio molar a cada um dos três tubos e use um controlador de pipeta equipado com uma Pipeta Pasteur para liberar bolhas em cada mistura. Enquanto as bolhas estão se formando, adicione 500 microliters de soro fisiológico tamponado BES contra a Pipeta Pasteur e na mistura. Incubar os tubos à temperatura ambiente por pelo menos 15 minutos até que as misturas pareçam ligeiramente nubladas.
Durante a incubação, substitua cuidadosamente o supernascedor das culturas celulares HEK293T por 10 mililitros de DMEM completos sem antibióticos. Distribua os complexos de DNA em pratos individuais de cultura celular HEK293T e incubar por 24 horas. No dia seguinte, substitua os supernacantes por quatro mililitros de DMEM completo por cultura e devolva os pratos a uma incubadora de cultura de células de dióxido de carbono de 37 graus Celsius 5% durante a noite.
Na manhã seguinte, colete os supernacantes em um tubo de 50 mililitros por prato e adicione quatro mililitros de meio fresco a cada prato. Depois de mais oito horas de cultura, junte o supernascido em cada prato com o supernanato previamente colhido e adicione quatro mililitros de meio fresco. Devolva os pratos para a incubadora de cultura celular durante a noite e colete os supernantes uma última vez.
Quando todo o vírus tiver sido coletado, filtre cada supernanato lentiviral através de um filtro de ligação de proteína de baixa proteína de 0,45 micrômetros em tubos individuais e adicione um máximo de 15 mililitros de supernascer filtrado a unidades individuais de filtro centrífugo para centrifugação. Descarte o fluxo através. Um lentivírus viscoso contendo líquido permanecerá na unidade do filtro.
Quando todo o supernatante lentiviral tiver sido filtrado aliquot 50 a 200 microliters dos lentivírus concentrados para armazenamento a frio. Antes de iniciar o procedimento de reprogramação, codeie uma placa tratada de seis poços de cultura tecidual com 500 microliters de 0,1% de gelatina por poço e incubar a placa por 20 minutos a 37 graus Celsius. No final da incubação, aspire a solução de gelatina restante.
Placa de fibroblastos dérmicos humanos a uma densidade de 1,5 vezes dez para as quintas células por placa em dois mililitros de DMEM completo por poço e incubar durante a noite. Na manhã seguinte, substitua o meio em cada poço por dois mililitros de DMEM completos suplementados com oito microgramas por polibreno mililitro e adicione uma mistura de lentivírus de fator de transcrição produzido na piscina e M2rtTA em um novo tubo de microcentrifuge. Em seguida, transduzi o fibroblasto com um volume ideal da mistura lentiviral, entre 10 a 100 microliters por poço.
Após 16 horas de incubação, substitua os supernacantes por DMEM completo e devolva as células à incubadora de cultura celular por seis a oito horas. Após a recuperação, substitua os supernacantes por dois mililitros de DMEM completos complementados com polibreno e realize uma segunda transdução como apenas demonstrado. No final da segunda incubação de transdução, substitua os supernaentes por DMEM completo suplementado por um micrograma por mililitro de doxiciclina e devolva a placa à incubadora de cultura celular por 48 horas.
No final da incubação, divida cada poço em uma proporção de um a dois e replate células em dois mililitros por poço de meio hematopoiético suplementado com doxiciclina em uma nova gelatina revestida de seis placas de poço. Para obter um número suficiente de células para a análise de sequenciamento de imunoprecipitação de cromatina, a placa três vezes 10 para o quinto fibroblastos em uma gelatina revestida de seis placas de poço e incubar durante a noite. Ao final da incubação, transduem células duas vezes em dois dias consecutivos com 10 a 20 microliters de lentivírus contendo os fatores individuais de interesse ou um pool dos três fatores mais FUW-M2rtTA em uma proporção de um para um.
16 horas após a segunda transdução, remova o vírus contendo supernaca e incuba as células em DMEM completo por 24 horas. Ao final da incubação, relate o conteúdo de cada poço em gelatina individual revestida de 100 milímetros de cultura de tecido tratada pratos tratados com DMEM completo para um volume final de 10 mililitros de médio por prato, e retornar as células para a incubadora de cultura celular. Após seis dias, substitua o supernaente por DMEM completo complementado com doxiciclina.
Devolva as culturas à incubadora por mais dois dias. Como demonstram essas parcelas representativas da citometria, aproximadamente 17% das células reprogramadas expressam TANTO CD49f quanto CD9 após 25 dias de reprogramação. A maioria das células duplas positivas expressa CD143 e uma pequena população expressa CD34, sugerindo uma indução dinâmica do destino hemogênico.
Estes marcadores não são ativados em fibroblastos dérmicos humanos transduzidos M2rtTA cultivados por 25 dias. A imagem de imunofluorescência confirma a expressão de CD9 e CD143 em células aderentes e redondas que são morfologicamente distintas dos fibroblastos, que são negativos para esses marcadores. A imagem brightfeild é realizada para visualizar a confluência celular, a morfologia e a formação de colônias durante todo o processo de reprogramação.
A análise de sequenciamento de RNA unicelular de células reprogramadas revela um aumento escalonado na expressão CD49f, CD9 e CD143 dos dias dois para 25. Após o sequenciamento da imunoprecipitação de cromatina, os perfis do Navegador genoma mostram a vinculação gata2 às regiões regulatórias genômicas de ITGA6 e ACE quando os fibroblastos são coduzidos com os três fatores ou GATA2 individualmente. O volume de partículas antivirais adicionadas à cultura deve ser otimizado para uma reprogramação bem sucedida sem comprometer a viabilidade celular.
Esta plataforma pode ser acoplada com inibição farmacológica e tecnologias de triagem em escala de genoma, como o CRISPR-Cas9, para definir novos reguladores da hematopoiese definitiva humana. Essa abordagem de reprogramação direta permitirá aos pesquisadores explorar novas questões no campo da hematopeiese do desenvolvimento humano e decifrar mecanismos subjacentes à especificação das células-tronco hematopoiéticas humanas. É importante realizar coletas e transduduções antivirais em um capô de fluxo laminar dedicado ao trabalho lentiviral e descartar resíduos contaminados virais em um recipiente apropriado.
