Diese Methode hilft, Einschränkungen bei der Untersuchung der humanen hämatopoetischen Entwicklung zu überwinden, indem sie eine einfache und beschreibbare In-vitro-Plattform bereitstellt, die auf direkter Zellreprogrammierung basiert. Die visuelle Demonstration dieser Methode wird eine ideale Anleitung in grundlegenden Schritten zur Erzeugung menschlicher hämogener Zellen bieten, und zwar während der lentiviralen Produktion, der Fibroblastentransduktion und der Zellkultur. Durch die Umwandlung von Hautfibroblasten in hämogene Vorläufer hoffen wir, patientenspezifische hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen in ausreichender Anzahl für die Stammzelltransplantation zu erzeugen.
Beginnen Sie mit dem Anbau von HEK293T-Zellen in einer 100-Millimeter-Gewebekultur behandeltschale mit 10 Milliliter n kompletten DMEM bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid bis zur Konfluenz. Am Tag vor der Transfektion, nach dem Angieren des Mediums, waschen Sie die Schale sorgfältig mit fünf Milliliter PBS und lösen Sie die Zellen mit 1,5 Milliliter Dissoziationslösung. Nach der Inkubation für fünf bis zehn Minuten bei 37 Grad Celsius, inaktivieren Sie die Lösung mit drei Milliliter n. Chr. und übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15 Milliliter konisches Rohr.
Waschen Sie die Schale mit 5 Millilitern kompletter DMEM, um alle verbleibenden angeschlossenen Zellen zu entfernen und ziehen Sie die Wäsche mit der Zelllösung. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation, aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in sechs Millilitern vollständiger DMEM wieder auf. Dann teilen Sie die Suspension gleichmäßig auf sechs 100 Millimeter Gewebekultur behandelt Gerichte in einem Endvolumen von 10 Milliliter nbiss gesamten DMEM pro Schale.
Am nächsten Tag fügen Sie 10 Mikrogramm Gesamtmasse der drei Transferplasmide zusammen zu einem neuen 15 Milliliter konischen Rohr hinzu. Als nächstes fügen Sie 10 Mikrogramm der zweiten Generation von psPAX2-Verpackungsvektor kodieren die Gag-, Pol-, Tat- und Rev-Gene, gefolgt von der Zugabe von fünf Mikrogramm pMD2. G-Hüllkurvenvektor, der das VSV-G-Gen in die Röhre kodiert.
Fügen Sie schließlich Wasser hinzu, um das endgültige Volumen auf 500 Mikroliter zu bringen. In zwei neuen 15 Milliliter konischen Röhrchen fügen Sie 10 Mikrogramm FUW-M2rtTA-Plasmid, 10 Mikrogramm des Verpackungsvektors und fünf Mikrogramm des Hüllvektors zu jedem Rohr hinzu. Dann fügen Sie Wasser bis zu einem Endvolumen von 500 Mikrolitern zu jedem Rohr hinzu.
Als nächstes fügen Sie 62,5 Mikroliter von zwei molarem Calciumchlorid in jede der drei Röhren und verwenden Sie einen Pipettenregler mit einer Pasteur Pipette ausgestattet, um Blasen in jede Mischung zu lösen. Während sich die Blasen bilden, fügen Sie 500 Mikroliter BES gepufferte Saline tropfenweise gegen die Pasteur Pipette und auf die Mischung. Inkubieren Sie die Rohre mindestens 15 Minuten bei Raumtemperatur, bis die Mischungen leicht bewölkt erscheinen.
Während der Inkubation den Überstand der HEK293T-Zellkulturen sorgfältig durch 10 Milliliter komplettes DMEM ohne Antibiotika ersetzen. Verteilen Sie die DNA-Komplexe tropfenweise auf einzelne HEK293T-Zellkulturgerichte und brüten 24 Stunden lang. Am nächsten Tag die Überstande durch vier Milliliter komplettedmEM pro Kultur ersetzen und die Gerichte über Nacht auf einen 37 Grad Celsius 5% Kohlendioxid-Zellkultur-Inkubator zurückgeben.
Am nächsten Morgen sammeln Sie die Überräube in einer 50 Milliliter Tube pro Gericht und fügen Sie vier Milliliter frisches Medium zu jedem Gericht hinzu. Nach acht weiteren Stunden Kultur den Überstand in jedem Gericht mit dem zuvor geernteten Überstand bündeln und vier Milliliter frisches Medium hinzufügen. Bringen Sie die Gerichte über Nacht in den Zellkultur-Inkubator zurück und sammeln Sie die Überstande ein letztes Mal.
Wenn das gesamte Virus gesammelt ist, filtern Sie jeden lentiviralen Überstand durch einen 0,45 Mikrometer niedriger Proteinbindungsfilter in einzelne Röhrchen und fügen Sie den einzelnen Zentrifugalfiltereinheiten für die Zentrifugation maximal 15 Milliliter gefilterten Überstand hinzu. Entsorgen Sie den Durchfluss. Ein viskoses Lentivirus, das Flüssigkeit enthält, verbleibt in der Filtereinheit.
Wenn der gesamte lentivirale Überstand aliquot 50 bis 200 Mikroliter der konzentrierten Lentiviren für die Kühllagerung gefiltert wurde. Vor Beginn des Reprogrammierungsverfahrens eine sechs Brunnengewebekultur behandelte Platte mit 500 Mikrolitern 0,1% Gelatine pro Brunnen und inkubieren die Platte für 20 Minuten bei 37 Grad Celsius. Am Ende der Inkubation die verbleibende Gelatinelösung ansaugen.
Platte menschliche dermale Fibroblasten mit einer Dichte von 1,5 mal zehn bis die fünften Zellen pro Platte in zwei Milliliter nbis vollständigdmEM pro Brunnen und über Nacht inkubieren. Ersetzen Sie am nächsten Morgen das Medium in jedem Brunnen durch zwei Milliliter komplettes DMEM, ergänzt durch acht Mikrogramm pro Milliliter Polybren, und fügen Sie ein 1:1 in einem Gemisch aus poolproduzierten Transkriptionsfaktor-Lentiviren und M2rtTA in einem neuen Mikrozentrifugenrohr hinzu. Dann transducieren Sie den Fibroblasten mit einem optimalen Volumen der lentiviralen Mischung, zwischen 10 bis 100 Mikroliter pro Brunnen.
Ersetzen Sie nach 16 Stunden Inkubation die Überstande durch vollständiges DMEM und geben Sie die Zellen für sechs bis acht Stunden in den Zellkultur-Inkubator zurück. Ersetzen Sie nach der Erholung die Überräube durch zwei Milliliter komplettes DMEM, ergänzt durch Polybren, und führen Sie eine zweite Transduktion durch, wie gerade gezeigt. Am Ende der zweiten Transduktionsinkubation die Überstande durch ein komplettes DMEM ersetzen, das mit einem Mikrogramm pro Milliliter Doxycyclin ergänzt wird, und geben Sie die Platte für 48 Stunden an den Zellkultur-Inkubator zurück.
Am Ende der Inkubation jeden Brunnen im Verhältnis eins zu zwei aufteilen und Zellen in zwei Milliliter pro Brunnen hämatopoetisches Medium, ergänzt mit Doxycyclin, in einer neuen gelatinebeschichteten Sechs-Well-Platte neu aufteilen. Um eine ausreichende Anzahl von Zellen für die Chromatin-Immunpräzipationssequenzierungsanalyse zu erhalten, Platte dreimal 10 bis fünf Fibroblasten in einer Gelatine beschichtet sechs Brunnenplatte und inkubieren über Nacht. Am Ende der Inkubation, transduce Zellen zweimal an zwei aufeinanderfolgenden Tagen mit 10 bis 20 Mikroliter Lentivirus enthalten die einzelnen Faktoren von Interesse oder einen Pool der drei Faktoren plus FUW-M2rtTA in einem Verhältnis eins zu eins.
16 Stunden nach der zweiten Transduktion entfernen Sie das Virus, das Überstand enthält, und inkubieren Sie die Zellen 24 Stunden lang in vollständiger DMEM. Am Ende der Inkubation den Inhalt jedes Brunnens in einzelne gelatinebeschichtete 100-Millimeter-Gewebekultur behandelte Gerichte mit vollständigem DMEM auf ein Endvolumen von 10 Milliliter n Medium pro Schale, und geben Sie die Zellen an den Zellkultur-Inkubator zurück. Ersetzen Sie nach sechs Tagen den Überstand durch vollständiges DMEM, ergänzt durch Doxycyclin.
Bringen Sie die Kulturen für weitere zwei Tage in den Inkubator zurück. Wie diese repräsentativen Zytometrie-Plots zeigen, drücken etwa 17% der umprogrammierten Zellen sowohl CD49f als auch CD9 nach 25 Tagen Der Neuprogrammierung aus. Die Mehrheit der doppelten positiven Zellen exprimiert CD143 und eine kleine Population exprimiert CD34, was auf eine dynamische hämogene Schicksalsinduktion hindeutet.
Diese Marker werden in M2rtTA transduzierten menschlichen dermalen Fibroblasten, die 25 Tage lang kultiviert wurden, nicht aktiviert. Die Immunfluoreszenz-Bildgebung bestätigt die Expression von CD9 und CD143 in anhaftenden und runden Zellen, die sich morphologisch von Fibroblasten unterscheiden, die für diese Marker negativ sind. Brightfeild-Bildgebung wird durchgeführt, um die Zellkonfluenz, Morphologie und Koloniebildung während des gesamten Reprogrammierungsprozesses zu visualisieren.
Die einzellige RNA-Sequenzierungsanalyse von neu programmierten Zellen zeigt einen schrittweisen Anstieg der CD49f-, CD9- und CD143-Expression von den Tagen zwei bis 25. Nach der Sequenzierung der Chromatin-Immunpräzipation zeigen Genome Browser-Profile GATA2-Bindung an genomische regulatorische Regionen von ITGA6 und ACE, wenn Fibroblasten mit den drei Faktoren oder GATA2 einzeln kodiert werden. Das Volumen der der Kultur zugesetzten antiviralen Partikel sollte für eine erfolgreiche Neuprogrammierung optimiert werden, ohne die Zelllebensfähigkeit zu beeinträchtigen.
Diese Plattform kann mit pharmakologischen Hemmungs- und Genom-Skala-Screening-Technologien wie CRISPR-Cas9 gekoppelt werden, um neue Regulatoren der menschlichen definitiven Hämatopoese zu definieren. Dieser direkte Umprogrammierungsansatz wird es den Forschern ermöglichen, neue Fragen auf dem Gebiet der humanen Entwicklungshämatiese zu erforschen und Mechanismen zu entschlüsseln, die der Spezifikation menschlicher hämatopoetischer Stammzellen zugrunde liegen. Es ist wichtig, antivirale Sammlungen und Transduktionen in einer laminaren Durchflusshaube durchzuführen, die für lentivirale Arbeiten bestimmt ist, und viral kontaminierte Abfälle in einen geeigneten Behälter zu entsorgen.
