이 방법은 직접 세포 리프로그래밍을 기반으로 간단하고 가관 가능한 시험관 장 플랫폼을 제공함으로써 인간 조혈 개발을 연구하는 데 한계를 극복하는 데 도움이됩니다. 이 방법의 시각적 데모는 렌즈피바이러스 생산, 섬유아세포 트랜스듀션 및 세포 배양 중에 인간 혈전 세포를 생성하는 근본적인 단계에서 이상적인 지침을 제공합니다. 피부 섬유아세포를 혈우성 전구체로 전환함으로써, 우리는 줄기 세포 이식을 위한 충분한 수의 환자 특정 조혈 줄기 및 선조 세포를 생성하기를 희망합니다.
HEK293T 세포를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 10밀리리터의 완전 DMEM으로 처리한 100mm 조직 배양에서 HEK293T 세포를 성장시키는 것으로 시작하십시오. 트랜스펙팅 전날, 배지를 심은 후, PBS의 5밀리리터로 조심스럽게 접시를 씻고 1.5 밀리리터의 해리용으로 세포를 분리한다. 섭씨 37도에서 5~10분 동안 배양한 후, 완전한 DMEM 3밀리리터로 용액을 비활성화하고 셀 서스펜션을 15밀리리터 원내 튜브로 전송합니다.
5 밀리리터의 완전한 DMEM으로 접시를 씻어 남은 부착 된 세포를 제거하고 세포 용액으로 세척을 당깁니다. 원심분리에 의해 세포를 수집하고, 슈퍼나탈자를 흡인시키고, 완전한 DMEM의 6밀리리터에서 펠릿을 재보펜한다. 그런 다음, 6 개의 100 밀리미터 조직 배양 처리 된 접시 사이에 균일하게 현탁액을 접시 당 10 밀리리터의 최종 부피로 분할합니다.
다음 날, 새로운 15 밀리리터 원추형 튜브에 함께 세 개의 전송 플라스미드의 10 마이크로 그램 총 질량을 추가합니다. 다음으로, 개그, 폴, 타트 및 레브 유전자를 인코딩하는 psPAX2 패키징 벡터의 2세대 의 10 마이크로그램을 추가하고 5마이크로그램의 pMD2를 첨가한다. G 봉투 벡터는 VSV-G 유전자를 튜브에 인코딩한다.
마지막으로 물을 추가하여 최종 부피를 500 마이크로리터에 넣습니다. 두 개의 새로운 15 밀리리터 원추형 튜브에 FUW-M2rtTA 플라스미드 10 마이크로그램, 포장 벡터 10마이크로그램, 각 튜브에 5마이크로그램의 봉투 벡터를 추가합니다. 그런 다음 각 튜브에 500 마이크로리터의 최종 부피까지 물을 추가합니다.
다음으로, 3개의 튜브 각각에 2개의 어금니 칼슘 염화칼슘62.5 마이크로리터를 추가하고 파스퇴르 파이펫이 장착된 파이펫 컨트롤러를 사용하여 각 혼합물에 거품을 방출합니다. 거품이 형성되는 동안, 베S 완충식식염수의 500 마이크로리터를 파스퇴르 파이펫에 대고 혼합물에 떨어뜨립니다. 혼합물이 약간 흐린 것처럼 보일 때까지 적어도 15 분 동안 실온에서 튜브를 배양하십시오.
인큐베이션 하는 동안, 신중 하 게 HEK293T 세포 배양의 상체를 대체 10 항생제 없이 완전 DMEM의 밀리 리터. 개별 HEK293T 세포 배양 접시에 DNA 복합체를 나누어 24시간 동안 배양한다. 다음 날, 수퍼네이터를 문화당 완전한 DMEM 의 4밀리리터로 대체하고 하룻밤 사이에 37도 의 이산화탄소 세포 배양 배양으로 접시를 반환합니다.
다음 날 아침, 접시 당 50 밀리리터 튜브에 슈퍼네이터를 수집하고 각 접시에 신선한 매체 4 밀리리터를 추가합니다. 8시간의 문화가 더 끝나면, 이전에 수확한 상체와 함께 각 요리에 상체를 풀을 짜고 신선한 매체의 4 밀리리터를 추가합니다. 하룻밤 동안 세포 배양 인큐베이터에 접시를 반환하고 마지막 한 번 초월을 수집합니다.
모든 바이러스가 수집되면, 각 렌즈바이러스 상체를 개별 튜브에 0.45 마이크로미터 저단백질 결합 필터를 필터링하고 원심 분리를 위해 개별 원심 필터 장치에 필터링된 상산체 의 최대 15 밀리리터를 추가합니다. 흐름을 폐기합니다. 액체를 함유한 점성 렌즈바이러스는 필터 장치에 남아 있습니다.
모든 렌티바이러스 상체가 냉장 보관을 위해 농축 렌티바이러스의 50 내지 200 마이크로리터를 알리쿼트 50 내지 200 마이크로리터로 여과했을 때. 재프로그래밍 절차를 시작하기 전에, 우물 당 0.1 %의 500 마이크로 리터와 여섯 잘 조직 배양 처리 플레이트를 코딩하고 37 섭씨에서 20 분 동안 플레이트를 배양. 인큐베이션의 끝에서 나머지 젤라틴 용액을 흡인시합니다.
플레이트 인간 진피 섬유아세포는 1.5배 10배의 밀도로 플레이트당 완전한 DMEM의 2밀리리터로 플레이트당 5번째 세포에 1.5배의 밀도를 가지며 하룻밤 사이에 배양한다. 다음 날 아침, 밀리리터 폴리브레네 당 8 마이크로그램으로 보충된 완전한 DMEM의 2밀리리터로 매질을 교체하고 새로운 마이크로센트리슈에이체 튜브에 풀 생성 전사 인자 렌티바이러스와 M2rtTA의 혼합물을 1대 1로 추가한다. 그런 다음, 렌티바이러스 혼합물의 최적의 부피로 섬유아드를 잘 10~100마이크로리터 사이로 변환한다.
16시간의 인큐베이션 후, 수퍼네이터를 완전한 DMEM으로 대체하고 세포를 세포 배양 인큐베이터로 6~8시간 동안 되돌려 보입니다. 복구 후, 수퍼넌트는 폴리브레인으로 보충된 완전한 DMEM의 2밀리리터로 교체하고 방금 입증된 대로 두 번째 트랜스퍼션을 수행합니다. 두 번째 트랜스듀싱 인큐베이션의 끝에서, 초월체를 독시사이클린의 밀리리터당 1마이크로그램으로 보충한 완전한 DMEM으로 대체하고 48시간 동안 세포 배양 인큐베이터로 플레이트를 반환한다.
인큐베이션의 끝에서, 새로운 젤라틴 코팅 6 웰 플레이트에 독시 사이클린으로 보충 조혈 매체의 웰 당 두 밀리리터에 각각 1 대 2 비율로 각각 잘 분할및 재플레이트 세포. 크로마틴 면역 침전 시퀀싱 분석을 위한 충분한 수의 세포를 얻으려면, 6개의 웰 플레이트를 코팅한 젤라틴에서 제5 섬유아세포에 3회 10번 플레이트를 플레이트하고 하룻밤 동안 배양한다. 인큐베이션이 끝나면, 1대 1비율로 FUW-M2rtTA를 플러스한 세 가지 요인의 개별 인자 또는 풀을 포함하는 렌즈바이러스의 10~20마이크로리터로 2일 연속으로 세포를 두 번 트랜스듀싱한다.
제2 전관 후 16시간 후, 상체가 함유된 바이러스를 제거하고 24시간 동안 완전한 DMEM에서 세포를 배양한다. 인큐베이션의 끝에서, 개별 젤라틴 코팅 된 개별 젤라틴으로 각각의 내용기를 다시 플레이트 100 밀리미터 조직 배양 완전한 DMEM과 함께 요리 당 10 밀리리터의 최종 볼륨에, 세포 배양 인큐베이터에 세포를 반환. 6 일 후, 독시 사이클린으로 보충 된 완전한 DMEM으로 상체를 교체하십시오.
문화를 인큐베이터에 2일 더 돌려보내보도록 한다. 이러한 대표적인 세포 측정 플롯에서 입증된 바와 같이, 재프로그래밍된 세포의 약 17%가 25일 의 재프로그래밍 후 CD49f와 CD9를 모두 표현합니다. 이중 양성 세포의 대다수는 CD143및 작은 인구 표현 CD34를 표현합니다, 동적 혈전성 운명 유도를 건의합니다.
이러한 마커는 M2rtTA에서 25일 동안 배양된 인간 진피 섬유아세포로 작용하지 않는다. 면역형광 이미징은 이러한 마커에 대해 부정적인 섬유아세포와 형태학적으로 구별되는 응고 및 둥근 세포에서 CD9 및 CD143의 발현을 확인합니다. 브라이트페이드 이미징은 리프로그래밍 프로세스 전반에 걸쳐 세포 융합, 형태 및 식민지 형성을 시각화하기 위해 수행됩니다.
재프로그래밍된 세포의 단세포 RNA 염기분석분석은 2일부터 25일까지 CD49f, CD9 및 CD143 발현의 단계별 증가를 나타낸다. 크로마틴 면역 침전 시퀀싱 후, 게놈 브라우저 프로파일은 섬유아세포가 개별적으로 3가지 요인 또는 GATA2와 결합될 때 ITGA6 및 ACE의 게놈 조절 영역에 결합하는 GATA2를 보여줍니다. 배양에 추가된 항바이러스 입자의 부피는 세포 생존가능성을 손상시키지 않으면서 성공적인 재프로그래밍을 위해 최적화되어야 합니다.
이 플랫폼은 CRISPR-Cas9와 같은 약리학적 억제 및 게놈 스케일 스크리닝 기술과 결합하여 인간 최종 혈막증의 새로운 조절기를 정의할 수 있습니다. 이 직접 적인 재프로그래밍 접근은 연구원이 인간 발달 혈토포이시스의 필드에 있는 새로운 질문을 탐구하고 인간 조혈 줄기 세포의 사양의 밑에 기계장치를 해독하는 것을 허용할 것입니다. 렌티바이러스 작업을 위해 전용 라미나 플로우 후드에서 항바이러스 수집 및 환원제를 수행하고 바이러스 오염 폐기물을 적절한 용기에 버리는 것이 중요합니다.
