Cette méthode aide à surmonter les limitations dans l’étude du développement hématopoïétique humain en fournissant une plate-forme in vitro simple et tractable basée sur la reprogrammation directe des cellules. La démonstration visuelle de cette méthode fournira la conduite idéale dans les étapes fondamentales pour produire des cellules hémogenic humaines à savoir pendant la production lentiviral, la transduction de fibroblaste et la culture cellulaire. En convertissant les fibroblastes cutanés en précurseurs hémogéniques, nous espérons générer des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques spécifiques aux patients en nombre suffisant pour la transplantation de cellules souches.
Commencez par cultiver des cellules HEK293T dans un plat traité par culture tissulaire de 100 millimètres avec 10 millilitres de DMEM complet à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone jusqu’à la confluence. La veille de la transfection, après avoir aspiré le milieu, laver soigneusement le plat avec cinq millilitres de PBS et détacher les cellules avec 1,5 millilitres de solution de dissociation. Après avoir incubé pendant cinq à 10 minutes à 37 degrés Celsius, inactivez la solution avec trois millilitres de DMEM complet et transférez la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 millilitres.
Lavez le plat avec 5 millilitres de DMEM complet pour enlever les cellules attachées restantes et tirez le lavage avec la solution cellulaire. Recueillir les cellules par centrifugation, aspirer le supernatant et resuspendre la pastille en six millilitres de DMEM complet. Ensuite, divisez la suspension uniformément entre six plats traités par culture tissulaire de 100 millimètres dans un volume final de 10 millilitres de DMEM complet par plat.
Le lendemain, ajouter 10 microgrammes de masse totale des trois plasmides de transfert ensemble à un nouveau tube conique de 15 millilitres. Ensuite, ajoutez 10 microgrammes de la deuxième génération de vecteur d’emballage psPAX2 codant les gènes gag, pol, tat et rev suivis de l’ajout de cinq microgrammes de pMD2. Vecteur d’enveloppe G codant le gène VSV-G au tube.
Enfin, ajoutez de l’eau pour porter le volume final à 500 microlitres. Dans deux nouveaux tubes coniques de 15 millilitres, ajouter 10 microgrammes de plasmide FUW-M2rtTA, 10 microgrammes du vecteur d’emballage et cinq microgrammes du vecteur de l’enveloppe à chaque tube. Ensuite, ajoutez de l’eau jusqu’à un volume final de 500 microlitres à chaque tube.
Ensuite, ajoutez 62,5 microlitres de deux chlorure de calcium molaire à chacun des trois tubes et utilisez un contrôleur de pipette équipé d’une pipette Pasteur pour libérer des bulles dans chaque mélange. Pendant la formation des bulles, ajouter 500 microlitres de bes tamponné salin dropwise contre la Pipette Pasteur et sur le mélange. Incuber les tubes à température ambiante pendant au moins 15 minutes jusqu’à ce que les mélanges semblent légèrement nuageux.
Pendant l’incubation, remplacez soigneusement le supernatant des cultures cellulaires HEK293T par 10 millilitres de DMEM complet sans antibiotiques. Distribuez les complexes d’ADN sur des plats individuels de culture cellulaire HEK293T et incubez pendant 24 heures. Le lendemain, remplacez les supernatants par quatre millilitres de DMEM complet par culture et retournez les plats à un incubateur de culture cellulaire de dioxyde de carbone de 37 degrés Celsius pendant la nuit.
Le lendemain matin, rassemblez les supernatants dans un tube de 50 millilitres par plat et ajoutez quatre millilitres de milieu frais à chaque plat. Après huit heures de culture de plus, mettre le supernatant en commun dans chaque plat avec le surnatant récolté précédemment et ajouter quatre millilitres de milieu frais. Retournez les plats à l’incubateur de culture cellulaire pendant la nuit et recueillez les supernatants une dernière fois.
Lorsque tout le virus a été collecté, filtrer chaque supernatant lentiviral à travers un filtre de liaison à faible teneur en protéines de 0,45 micromètre dans des tubes individuels et ajouter un maximum de 15 millilitres de supernatant filtré aux unités de filtre centrifuges individuelles pour centrifugation. Jetez le flux à travers. Un lentivirus visqueux contenant du liquide restera dans l’unité de filtrage.
Lorsque tous les supernatants lentiviraux ont été filtrés aliquot 50 à 200 microlitres des lentivirus concentrés pour le stockage à froid. Avant de commencer la procédure de reprogrammation, codez une plaque traitée à six puits de culture tissulaire avec 500 microlitres de 0,1 % de gélatine par puits et incubez la plaque pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, aspirer le reste de la solution gélatine.
Plaquez les fibroblastes dermiques humains à une densité de 1,5 fois dix à la cinquième cellule par plaque en deux millilitres de DMEM complet par puits et incuber pendant la nuit. Le lendemain matin, remplacer le milieu de chaque puits par deux millilitres de DMEM complet complété par huit microgrammes par millilitre polybrene et ajouter un à un mélange de lentivirus facteur de transcription produit par piscine et M2rtTA dans un nouveau tube de microcentrifugeuse. Ensuite, transduire le fibroblaste avec un volume optimal du mélange lentiviral, entre 10 et 100 microlitres par puits.
Après 16 heures d’incubation, remplacez les supernatants par un DMEM complet et retournez les cellules dans l’incubateur de culture cellulaire pendant six à huit heures. Après la récupération, remplacer les supernatants par deux millilitres de DMEM complet complété par du polybrene et effectuer une deuxième transduction comme nous venons de le démontrer. À la fin de la deuxième incubation par transduction, remplacer les supernatants par un DMEM complet complété par un microgramme par millilitre de doxycycline et remettre la plaque à l’incubateur de culture cellulaire pendant 48 heures.
À la fin de l’incubation, fendre chaque puits à un rapport un à deux et replater les cellules en deux millilitres par puits de milieu hématopoïétique complété par de la doxycycline dans une nouvelle gélatine enduite de six plaques de puits. Pour obtenir un nombre suffisant de cellules pour l’analyse de séquençage d’immunoprécipitation de chromatine, plaquez trois fois 10 aux cinquièmes fibroblastes dans une gélatine enduite six plaque de puits et incubez pendant la nuit. À la fin de l’incubation, transduire les cellules deux fois en deux jours consécutifs avec 10 à 20 microlitres de lentivirus contenant les facteurs d’intérêt individuels ou un pool des trois facteurs plus FUW-M2rtTA à un rapport un à un.
16 heures après la deuxième transduction, éliminez le virus contenant du surnatant et incubez les cellules dans le DMEM complet pendant 24 heures. À la fin de l’incubation, replatez le contenu de chaque puits en gélatine individuelle enduite de 100 millimètres de culture tissulaire traitée plats avec DMEM complet à un volume final de 10 millilitres de milieu par plat, et retourner les cellules à l’incubateur de culture cellulaire. Après six jours, remplacer le supernatant par un DMEM complet complété par de la doxycycline.
Retournez les cultures à l’incubateur pour deux jours supplémentaires. Comme le démontrent ces parcelles représentatives de cytométrie, environ 17 % des cellules reprogrammées expriment à la fois le CD49f et le CD9 après 25 jours de reprogrammation. La majorité des cellules doublement positives expriment le CD143 et une petite population exprime cd34, suggérant une induction dynamique de destin hémogenic.
Ces marqueurs ne sont pas activés dans les fibroblastes dermiques humains transduits M2rtTA cultivés pendant 25 jours. La formation image d’immunofluorescence confirme l’expression de CD9 et de CD143 dans les cellules adhérentes et rondes qui sont morphologiquement distinctes des fibroblastes, qui sont négatives pour ces marqueurs. L’imagerie brightfeild est exécutée pour visualiser la confluence cellulaire, la morphologie, et la formation de colonie tout au long du processus de reprogrammation.
L’analyse de séquençage d’ARN unicellule des cellules reprogrammées indique une augmentation stepwise de CD49f, CD9, et CD143 expression des jours deux à 25. Après le séquençage de l’immunoprécipitation de la chromatine, les profils genome browser montrent GATA2 se liant aux régions génomiques de régulation d’ITGA6 et d’ACE lorsque les fibroblastes sont cotransduits avec les trois facteurs ou GATA2 individuellement. Le volume de particules antivirales ajoutées à la culture doit être optimisé pour une reprogrammation réussie sans compromettre la viabilité cellulaire.
Cette plate-forme peut être couplée avec l’inhibition pharmacologique et les technologies de criblage à l’échelle du génome, telles que CRISPR-Cas9, pour définir de nouveaux régulateurs de l’hématopoïèse définitive humaine. Cette approche de reprogrammation directe permettra aux chercheurs d’explorer de nouvelles questions dans le domaine de l’hématopoïèse développementale humaine et de déchiffrer les mécanismes sous-jacents à la spécification des cellules souches hématopoïétiques humaines. Il est important d’effectuer des collectes et des transductions d’antiviraux dans une hotte d’écoulement laminaire dédiée aux travaux lentiviraux et de jeter les déchets contaminés viraux dans un contenant approprié.
