Уникальная мышиная модель для количественной оценки образования биопленки на хирургических имплантатах при подкожном абсцессе

Этот протокол описывает уникальную экспериментальную модель инфекций, связанных с имплантатами, которая позволяет одновременно инкубировать два имплантата с бактериями в идентичных условиях в пределах одной мыши. Он также позволяет точно оценить образование биопленки на поверхности имплантатов с помощью оптимизированных сравнительных аналитических методов, демонстрируя передовые методы оценки антимикробных свойств биоматериалов.

Для разработки нового биоматериала с антибактериальными свойствами для ортопедических хирургических процедур решающее значение имеет создание экспериментальной модели инфекций, связанных с имплантатами, на животных, которая точно имитирует патологическое состояние. Кроме того, требуется количественное сравнение с контрольными образцами для оценки образования биопленки на материалах. Тем не менее, современные модели на животных, которые включают имплантацию каждому человеку одного и того же материала, могут давать противоречивые результаты из-за гетерогенности инфекционного статуса среди субъектов. Кроме того, точное количественное определение образования биопленки на материалах in vivo остается сложной задачей, и результаты могут быть ненадежными. Для решения этих проблем в данном исследовании была продемонстрирована уникальная мышиная модель инфекции, связанной с имплантатами, которая позволяет одновременно инкубировать два имплантата с бактериями в закрытой среде в пределах одной мыши, образуя инкапсулированный подкожный абсцесс. Зрелый воздушный мешочек изначально создавался под кожей спины. Две проволоки из нержавеющей стали были соединены и помещены в мешочек, после чего была введена инокуляция Xen 36, биолюминесцентного штамма золотистого стафилококка. Через 14 дней после инокуляции вокруг проводов образовался подкожный абсцесс. Биопленка была полностью удалена с поверхности каждой проволоки, а растворенные бактериальные суспензии были точно измерены с использованием оптимизированных методов для оценки образования биопленки на имплантате, определения колониеобразующих единиц и выполнения количественного анализа полимеразной цепной реакции. Используя lux-оперон биолюминесцентных бактерий, относительные уровни экспрессии luxA и 16S рРНК были использованы для определения бактериальной нагрузки внутри биопленки на каждом проводе. Этот оптимизированный сравнительный аналитический подход позволяет точно оценить образование биопленки на двух проводах в однородных условиях инфекции в рамках одной модели мыши и может способствовать продвижению биоматериалов с антибактериальными свойствами.

Инфекции, связанные с имплантатами, остаются серьезной проблемой в клинических условиях, поскольку они могут вызывать высокие показатели заболеваемости и смертности в ортопедической хирургии, несмотря на достижения в области хирургической техники^{и дизайна} имплантатов. Несмотря на то, что частота инфекций, связанных с хирургическими имплантатами, значительно снизилась благодаря современным стандартам асептического контроля в условиях операционной и соответствующим протоколам периоперационной антибиотикопрофилактики, частота инфекций, связанных с имплантатами, в первичной хирургии остается на уровне 2-5%².

Основным механизмом инфекций, связанных с имплантатами, является образование биопленки на поверхности имплантата, которая защищает микроорганизмы от антибиотиков и иммунную систему, что затрудняет искоренение инфекции ^3,4. Поскольку адгезия бактерий к поверхности имплантата имеет решающее значение на первой стадии формирования биопленки, сведение к минимуму бактериальной адгезии и последующего образования биопленки является важной стратегией для снижения риска инфекций, связанных с имплантатами. Несмотря на антибактериальные свойства различных технологий имплантатов, они не получили широкого клинического применения из-за побочных эффектов, таких как токсичность клеток и аллергия 5,6,7,8. Таким образом, все еще существует неудовлетворенная клиническая потребность в антибактериальных имплантатах, которые гармонизируют безопасность, эффективность, стабильность и долговечность для снижения риска инфекций, связанных с имплантатами. Исследования и разработка имплантатов с антибактериальными свойствами могут продвинуть хирургические технологии для преодоления этих проблем.

Оценка антибактериальных свойств различных биоматериалов с использованием моделей мелких животных имеет важное значение до перехода к более крупным животным моделям и клиническим испытаниям⁹. Многочисленные исследования показали применимость мышиных моделей инфекций, связанных с имплантатами, с использованием биолюминесцентной бактерии, которая содержит оперон luxABCDE 10,11,12,13,14,15. Хотя эти модели ускоряют исследования в области разработки антибактериальных имплантатов или технологий, они имеют определенные ограничения. Во-первых, для непосредственной и точной оценки бактериальной нагрузки на имплантаты, размещенные в моделях мышей, часто требуются передовые знания и специализированное оборудование, такое как рентгеновские аппараты или специализированные системы визуализации. Во-вторых, в то время как собранные имплантаты обычно оценивают одиночный имплантат в одном месте инфекции у каждого животного, условия инфекции и иммунологические реакции могут варьироваться у разных особей, что потенциально может привести к вариабельности результатов сравнительных оценок. Поэтому при сравнении антибактериальных эффектов различных биоматериалов in vivo имплантация и инокуляция их бактериями в единых условиях более выгодна для решения этих вопросов. Кроме того, важно оптимизировать текущую методологию и проводить количественные оценки с воспроизводимостью и точностью, используя характеристики животной модели и используемых бактерий.

В этом исследовании представлен новый экспериментальный подход к инфекциям, связанным с имплантатами in vivo , который позволяет проводить точные измерения для оценки образования биопленки на поверхностях двух имплантатов в одной мышиной модели с помощью сравнительных меж- и внутрииндивидуальных аналитических методов. Биопленка на каждом имплантате может быть количественно определена с помощью оптимизированных методов визуализации биопленки на имплантате, определения колониеобразующих единиц (КОЕ) и количественного анализа полимеразной цепной реакции (qPCR) биолюминесцентного штамма Staphylococcus aureus, Xen 36. Предыдущее исследование показало, что имплантат из нового металла обладает многообещающей антибактериальной эффективностью in vivo против золотистого стафилококка при использовании этого комплексного подхода¹⁶. Эта методология может быть легко реализована в стандартных лабораторных условиях и может ускорить исследования по разработке антибактериальных биоматериалов.

Все процедуры с животными одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Калифорнийском университете в Сан-Франциско (UCSF) и выполняются в учреждении BSL2 после консультаций и одобрения Программы UCSF по биобезопасности и рискам, администрируемой UCSF Environmental Health and Safety. Использовали самцов и самок мышей C57BL/6 (в возрасте 12-16 недель, 25-50 мг). Подробная информация об используемых реагентах и оборудовании приведена в Таблице материалов.

1. Подготовка бактерий

1. В качестве возбудителя используют биолюминесцентный золотистый стафилококк Xen36 (ATCC49525).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот штамм получен из American Type Culture Collection (Манассас, Вирджиния) и уникально использует оперон luxABCDE , который оптимизирован и интегрирован в нативную плазмиду хозяина. Xen36 также использует ген устойчивости к канамицину, связанный с опероном люкса .
2. Добавьте небольшое количество замороженного глицеринового бульона Xen 36 и добавьте кусочки в 5 мл триптического соевого бульона (TSB), содержащего 200 мкг/мл канамицина.
3. Инкубируйте культуру в течение ночи при температуре 37 °C в встряхивающем инкубаторе (200 об/мин).
4. Нанесите Xen36 на агаровые планшеты TSB (TSB в агаре 1,5%), содержащие 200 мкг/мл канамицина, и инкубируйте в течение ночи при 37 °C.
5. Выделите отдельные колонии Xen36 и культуру в 5 мл TSB, содержащего 200 мкг/мл канамицина, в течение ночи при 37 °C в встряхивающем инкубаторе (200 об/мин).
6. Измерьте абсорбцию полученной культуры при 630 нм.
7. Разбавьте культуру и получите культуру Xen36 в концентрации 1,0 x 10⁸ КОЕ/мл в расчете на абсорбцию при длине волны 630 нм.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Измерение поглощения на длине волны 630 нм (по сравнению с заготовкой TSB) 0,5 примерно эквивалентно 1,0 x 10⁸ КОЕ/мл Xen36.
8. Разбавьте культуру и сделайте культуру Xen36 1,0 x 10⁵ КОЕ/мл.

2. Препарирование соединенных имплантатов

1. Используйте две проволоки в форме стержня, изготовленные из имеющейся в продаже хирургической нержавеющей стали (SUS316L), каждая длиной 8 мм и диаметром 0,5 мм.
2. Соедините два провода вертикально, вставив их в оба конца наконечника пипетки объемом 20 μл, обрезанного до длины примерно 3 мм.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Вставьте вертикально соединенные провода в кончик иглы 18 G (Рисунок 1). Убедитесь, что провода надежно закреплены наконечником пипетки, чтобы предотвратить отсоединение.
3. Автоклавируйте провода перед хирургическим путем имплантации их мышам.

3. Создание зрелого подкожного мешочка

ПРИМЕЧАНИЕ: За 7 дней до бактериального посева создайте воздушный мешочек следующим образом:

1. Обезболивайте мышь (C57BL/6) 2% изофлураном путем ингаляции (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Оцените подходящий уровень анестезии, наблюдая за частотой дыхания, мышечным тонусом, защемлением пальцев ног, роговичным рефлексом и цветом слизистых оболочек. Используйте офтальмологическую мазь для глаз, чтобы предотвратить сухость во время пребывания под анестезией.
2. Перенесите мышь, находящуюся под наркозом, на операционную кровать и побрейте дорсальную шейную/грудную область мыши.
3. Промазать и стерилизовать всю область с 70% этанолом и повидон-йодом.
4. Наполните шприц объемом 10 мл стерильным воздухом и прикрепите к выходу иглу 27 G.
5. Аккуратно сожмите и приподнимите основание шеи мыши, чтобы создать пространство между подкожной клетчаткой и фасцией.
6. Поместите иглу по средней линии между лопатками мыши и введите 3 мл стерильного воздуха подкожно, чтобы создать воздушный мешочек (рисунок 2).
   ПРИМЕЧАНИЕ: При впрыске воздуха удерживайте обе стороны спины противоположной рукой, чтобы воздух распространялся к центру спины, создавая мешочек посередине.
7. Верните мышь в клетку, утепленную термопрокладкой, и внимательно следите за ней, пока она не оправится от анестезии.
8. Вводите 3 мл стерильного воздуха, как описано выше, чтобы поддерживать надувание полости и создавать зрелый стомный мешок каждые 2 дня.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перед каждым надуванием отсасывайте воздух из мешка, чтобы убедиться в правильном размещении кончика иглы. Осторожно извлеките шприц из иглы, оставив кончик иглы в мешочке. Снова надуйте мешочек 3 мл стерильного воздуха.

4. Имплантация подключенных проводов и бактериальный посев

1. Через 7 дней после первой инъекции воздуха обезболите мышь, как описано в шаге 3.1.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Во время хирургического вмешательства постоянно проверяйте, дышит ли мышь и находится под наркозом. Вся хирургическая процедура обычно занимает 10-15 минут при выполнении квалифицированным хирургом. Анестезия поддерживается путем помещения трубки, доставляющей 2% изофлуран, смешанного с кислородом, рядом с мордой мыши.
2. Промазать и стерилизовать всю область с 70% этанолом и повидон-йодом.
3. Вводите бупивакаин подкожно непосредственно перед операцией.
4. Сделайте продольный разрез по средней линии диаметром 3 мм в верхней части мешка.
5. Введите иглу 18 G, содержащую соединенные провода, в мешочек через отверстие и вытолкните провода с помощью внутреннего шприца спинномозговой иглы 25 G (рис. 3A, B).
6. Оставив кончик иглы 18 G внутри пакета, осторожно извлеките внутренний цилиндр и введите 3 мл культуры Xen36 1,0 x 10⁵ КОЕ/мл с помощью шприца (рис. 3C, D).
7. Осторожно удалите все иглы, закройте кожу с помощью зажима для раны и заклейте местным клеем для кожи (рис. 3E, F).
8. Убедитесь в отсутствии протечек, верните мышь в индивидуальную клетку, утепленную термопрокладкой, и контролируйте, как и раньше.

5. Извлечение имплантатов из подкожного абсцесса

1. После эвтаназии с помощью передозировки изофторана побрейте спинную шейную, грудную и поясничную области мыши, а также возьмите мазок и простерилизуйте всю область с помощью 70% этанола и повидон-йода (рисунок 4A).
   Примечание: Эвтаназия проводилась в соответствии с Рекомендациями Американской ветеринарной медицинской ассоциации (AVMA) по эвтаназии животных.
2. Сделайте разрез по средней линии в поясничной области на 2 см и аккуратно отшелушите подкожную клетчатку с помощью ножниц.
3. Удлините разрез и подкожную диссекцию проксимально и отделите прилегающую ткань, окружающую абсцесс (Рисунок 4B - D).
4. Иссекаем весь подкожный абсцесс (рисунок 4E).
5. Разрежьте гнойник и осторожно извлеките проволоку из внутренней части гнойника (рисунок 4F).

6. Количественное определение образовавшейся биопленки на поверхностях имплантатов

1. Проба кристаллической фиалки
   1. Поместите провода, извлеченные из абсцесса, в отдельные лунки 24-луночного планшета, содержащего 1 мл деионизированной (DI) воды.
   2. Перенесите провода в новые лунки, содержащие 1 мл деионизионной воды, чтобы удалить все слабо прилипшие бактерии с поверхности проводов.
   3. Закрепите биопленку на проводах со 100% этанолом на 1 минуту и дайте им высохнуть.
   4. Перенесите провода в новые лунки, содержащие 1 мл 0,1% кристаллического фиолетового реактива.
   5. После 15 минут окрашивания дважды аккуратно промойте провода деионизированной водой, чтобы удалить излишки красителя.
   6. Поместите имплантат в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл, содержащую 250 мкл 33% уксусной кислоты, на 15 минут; Растворите кристалл фиалки, прилипший к биопленке на имплантате, с последующим вортексированием в течение 1 мин.
   7. Перенесите 200 мкл суспензии на 96-луночный планшет и измерьте поглощение при наружном диаметре_{630 нм} с помощью считывателя микропланшетов. Все измерения выполняются в трех экземплярах.
2. Подсчет колониеобразующих единиц (КОЕ)
   1. Удалите все слабо прилипшие бактерии с поверхности проводов, как описано в шаге 6.1.2.
   2. Поместите имплантат в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл, содержащую 200 мкл 10-кратного трипсина, и инкубируйте при 37 °C в течение 1 ч.
   3. Вортекс в течение 1 мин и ультразвуком на водяной бане при 100 Вт в течение 5 мин с последующим дополнительным вортексированием в течение 30 с для отрыва биопленки от суспензии.
   4. Инокулировать 10 мкл последовательно разведенной суспензии на агаровые пластины TSB (TSB в агаре 1,5%) 200 мкг/мл канамицина.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте эту процедуру в трех экземплярах для каждого раствора.
   5. После инкубации планшетов при 37 °C в течение 24 ч подсчитайте колонии на планшетах и рассчитайте количество бактериальных клеток в исходной культуре, используя среднее количество колоний¹⁷.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы убедиться, что все бактерии удалены с проводов, что имеет решающее значение для точного измерения, окрасьте провода кристаллическим фиолетовым цветом и наблюдайте за ними после нанесения суспензии на пластины. В предварительных экспериментах комбинация вышеуказанной механической и химической диссоциации успешно удалила все биопленки Xen36 с поверхностей обычной проволоки из нержавеющей стали (рис. 5).
3. Количественный анализ полимеразной цепной реакции (кПЦР)
   1. Удалите все слабо прилипшие бактерии с поверхности проводов, как описано в шаге 6.1.2.
   2. Поместите имплантат в микротрубку объемом 1,5 мл, содержащую 600 мкл TSB.
   3. Извлечение ДНК с помощью модифицированной системы щелочного лизиса^{без гранул 16}.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Конечный объем элюированной ДНК составляет 20 μл.
   4. Разбавьте ДНК в соотношении 1:10 и храните при температуре -20 °C.
   5. Проведите кПЦР для генов luxA и 16S рРНК ¹⁶.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все реакции количественной ПЦР проводятся в трех экземплярах. Общий объем реакционной смеси составляет 10 мкл, содержит 3 мкл матрицы ДНК, 5 мкл SYBR Green, 1 мкл воды, не содержащей нуклеаз, и 0,5 мкл каждого праймера. Праймерами для гена luxA являются 5'- GAGCATCATTTCACGGAGTTTG -3' и 5'- ATAGCGGCAGTTCCTACATTC -3'. Праймерами для гена 16S рРНК являются 5'- GTGGAGGGTCATTGGAAACT - 3' и 5'- CACTGGTGTTCTCTCCATATCTC - 3'. Условия ПЦР следующие: начальная денатурация в течение 2 мин при 94 °С, затем 40 циклов по 15 с при 94 °С, 30 с при 60 °С и 30 с при 72 °С, и окончательное продление при 72 °С в течение 5 мин.
   6. График среднего значения порогового значения за три цикла (Ct) строится относительно калибровочной кривой, созданной с помощью ДНК, очищенной непосредственно из серийно разбавленных чистых культур Xen36, для оценки бактериальной нагрузки на имплантат (рис. 6).

В этом исследовании оценивалась надежность комплексного подхода с использованием новой мышиной модели инфекции, связанной с имплантатами, с оптимизированными количественными оценками образования биопленки на поверхностях имплантатов, которая использовалась в предыдущем исследовании^. Два идентичных имплантата были использованы для изучения биопленки, образованной на их поверхности, с целью убедиться, что оба имплантата могут быть инкубированы одновременно в однородных условиях инфекции в одиночном подкожном пространстве на одной мышиной модели. Мышам проводили процедуру создания подкожного мешка (рис. 2), а через 7 дней в зрелый мешочек имплантировали соединенные провода из нержавеющей стали с последующей инокуляцией Staphylococcus aureus Xen36 (рис. 3). Через 14 дней после инокуляции инкапсулированный абсцесс размером примерно 2 см в длину и 1 см в ширину, содержащий соединенные провода, образуются в мешочном мешке (рис. 4). Проволоки извлекали из абсцесса, а биопленку, образовавшуюся на каждой проволоке, оценивали с помощью кристаллического фиолетового окрашивания, подсчета КОЕ и количественного ПЦР-анализа. Провода, окрашенные кристаллическим фиолетовым цветом, показали последовательное образование биопленки на поверхностях, без заметных изменений между обоими проводами (рис. 7A). Точные измерения для оценки образования биопленки с помощью сравнительных меж- и внутрииндивидуальных аналитических методов показали, что измерения абсорбции анализа растворенного кристаллического фиолета (Рисунок 7B), подсчета КОЕ (Рисунок 7C) и анализа количественной ПЦР (Рисунок 7D) не показали статистически значимых различий в бактериальной нагрузке внутри биопленки на обоих проводах. Эти результаты свидетельствуют о том, что оба провода были одновременно инкубированы в идентичных условиях инфекции в единственном подкожном мешочке в пределах одной модели мыши.

Рисунок 1: Подготовка соединенных проводов для имплантации подкожного мешочка. (A) Репрезентативное изображение одного имплантата, состоящего из двух соединенных проводов из нержавеющей стали (длина: 8 мм, диаметр: 0,5 мм). (B) Наконечник наконечника пипетки объемом 20 мкл служит соединением для двух проводов. (C) Соединенные провода впоследствии вставляются в наконечник иглы 18 G для имплантации в зрелый подкожный мешочек. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Создание зрелого подкожного мешка для имплантации и инокуляции. (А) вид сбоку и (Б) вид сверху полностью сформированного подкожного мешка сразу после впрыска воздуха. Подкожный мешочек создается на спине модели мыши путем введения иглы 27 G в кожу по средней линии между лопатками и подкожного введения 3 мл стерильного воздуха. После этого 3 мл стерильного воздуха вводят через день в течение 7 дней, чтобы облегчить созревание подкожного мешка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Имплантация соединенных проводов и бактериальный инокуляционный ввод в зрелый подкожный мешочек. (А) Вид сбоку и (Б) вид сверху на процедуру введения иглы в зрелый подкожный мешочек. Соединенные провода помещаются в кончик иглы 18 G, а внутренний шприц спинальной иглы 25 G используется для выталкивания проводов. Они вводятся в зрелый подкожный мешочек через отверстие для кожи. Впоследствии спицы помещаются в мешочек с помощью спинальной иглы 25 G. Бактериальный посев в мешочек при виде сбоку (C) и сверху (D). После присоединения шприца, содержащего бактериальный раствор, к игле 18 G в мешочек вводят 3 мл культуры Xen36 (1,0 x 10⁵ КОЕ/мл). После извлечения иглы 18 G место введения закрывается, при этом утечка не обнаруживается ни при виде сбоку (E), ни при виде сверху (F). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Скопление соединенных проводов в подкожном абсцессе. (A) Боковой вид мышиной модели на предмет инфекций, связанных с имплантатами, через 14 дней после прививки. (Б) вид сбоку, (В) вид сверху и (Г) вид снизу подкожного абсцесса с окружающими хорошо развитыми кровеносными сосудами после разделения адгезивных тканей. (E) подкожный абсцесс полностью инкапсулирован, и (F) подключенные провода полностью оболваны им. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 5: Удаление биопленки, образовавшейся на проволоке, для оценки КОЕ. (A) Биопленка, образовавшаяся на поверхности каждой проволоки, последовательно окрашивается кристаллическим фиолетовым цветом через 14 дней после инокуляции in vitro. (B) Окрашенная биопленка уменьшается с помощью вортексинга и ультразвука. (В) Он полностью устраняется путем добавления лечения трипсином. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 6: Калибровочная кривая генов 16S рРНК и luxA у золотистого стафилококка. Калибровочная кривая преобразует значения Ct в эквивалентную бактериальную нагрузку в КОЕ. Создается серийное разведение чистой культуры Staphylococcus aureus Xen36 (от 10⁸ до^{10 1} КОЕ). Высокий коэффициент корреляции Пирсона получен для 16S рРНК (R² = 0,951) и luxA (R² = 0,985), что указывает на линейные стандартные кривые. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 7: Количественные оценки образования биопленки на соединенных проводах в мышиной модели. (A) Репрезентативные изображения одного имплантата, состоящего из двух соединенных проводов из нержавеющей стали для имплантации подкожного мешочка (слева) и кристаллической биопленки, окрашенной фиолетовым цветом, образованной на поверхностях каждого провода (проволока 1 или проволока 2) через 14 дней после инокуляции (справа). Измерения для оценки биопленки с использованием сравнительных меж- и внутрииндивидуальных аналитических методов выполняются для каждого провода в модели мыши (всего n = 12), включая (B) измерение поглощения кристаллической биопленки, окрашенной фиолетовым цветом (n = 4; круглая точка указывает на Мышь #1; треугольная точка указывает на Мышь #2; квадратная точка указывает на Мышь #3; ромбовидная точка указывает на Мышь #4). (C) подсчет КОЕ (n = 4; круглая точка указывает на Мышь #5; треугольная точка указывает на Мышь #6; квадратная точка указывает на Мышь #7; ромбовидная точка указывает на Мышь #8) и (D) анализ количественной ПЦР (n = 4; круглая точка обозначает Мышь #9; треугольная точка указывает на Мышь #10; квадратная точка указывает на Мышь #11; ромбовидная точка указывает на Мышь #12). Различия между группами проводов оцениваются с помощью одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA). Все данные представлены в виде средней ± стандартной погрешности. Статистически значимые значения были определены как p < 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Это исследование продемонстрировало комплексный подход к точной количественной оценке образования биопленки на нескольких имплантатах с использованием новой модели мыши и оптимизированных методов анализа инфекций, связанных с имплантатами. Чтобы гарантировать, что два имплантата были инкубированы в идентичных условиях инфекции у одного и того же субъекта, в пределах одной мыши был создан зрелый подкожный мешочек путем повторных инъекций воздуха. Эта модель обеспечивала закрытую и стабильную среду, в которой два соединенных имплантата могли инкубироваться в идентичных условиях инфекции, даже при движении мыши. После инокуляции Staphylococcus aureus развился одиночный инкапсулированный подкожный абсцесс, примерно 2 см в длину, полностью охватывающий обе проволоки и очень напоминающий характеристики клинических инфекций, связанных с имплантатами. Обе проволоки были извлечены из абсцесса, и биопленка была удалена с каждой поверхности с помощью механической и химической диссоциации. Растворенный бактериальный раствор использовали для количественного анализа бактериальной нагрузки внутри биопленки на каждой проволоке. Для количественной оценки был проведен сравнительный меж- и внутрииндивидуальный аналитический анализ множественных проводов между двумя типами групп проводов. Кроме того, оба провода, помещенные в одну и ту же мышь, были сравнительно измерены для более точной оценки, поскольку они одновременно инкубировались с однородной инфекцией. Для количественной оценки в кПЦР-анализе использовались относительные уровни экспрессии гена 16S рРНК и люкс-оперона, который кодирует люциферазу в биолюминесцентном золотистом стафилококке. Это исследование с участием двух идентичных проволок не привело к существенным различиям во всех количественных оценках образования биопленки между группами проволоки у нескольких мышей или между проволоками у одной мыши. Между тем, предыдущее исследование показало значительные различия в количественных оценках образования биопленки между двумя различными группами проволоки у^{нескольких мышей}. Таким образом, этот комплексный подход оптимизирует мышиную модель и аналитические методы для минимизации изменчивости результатов, потенциально повышая точность и воспроизводимость количественных оценок образования биопленки на нескольких биоматериалах.

Для оценки антимикробной эффективности^{биоматериалов} 9,18,19,20 было создано несколько in vivo моделей инфекций, связанных с имплантатами. В этих моделях один имплантат обычно помещается в большеберцовую кость, бедренную кость или спинномозговой отросток для каждого животного вместе с бактериальной инокуляцией. Поскольку абсцесс развивается вокруг имплантата или рядом с ним после инокуляции, точно имитируя клинические особенности, эти модели полезны для изучения in vivo инфекции, связанной с имплантатом. Тем не менее, результаты количественных оценок могут быть противоречивыми из-за одного имплантата на субъекта, прививки в неидеально закрытое пространство, а также вариабельности иммунных реакций и инфекционных состояний среди субъектов. Кроме того, количественные оценки в этих моделях часто требуют специальных знаний и специального измерительного оборудования, что ограничивает их применимость. Несмотря на то, что размер имплантата в этой модели мыши ограничен, эти проблемы могут быть решены с помощью атрибутов этой комплексной методологии, которая включает в себя одновременную инкубацию нескольких имплантатов с бактериями в идентичных условиях инфекции в пределах одной мыши.

Наиболее важным этапом в этом подходе является удаление образовавшейся биопленки с имплантата. Репрезентативным методом количественной оценки биопленки является подсчет по КОЕ, который требует отделения бактерий от биопленки, их суспензии в среде и последующего осаждения¹¹. В то время как методы механического воздействия, включающие ультразвуковую обработку и вортексирование, обычно используются для отделения биопленки во многих исследованиях, существуют опасения по поводу их достаточности для полного удаления всей биопленки с имплантатов. Если эти методы окажутся недостаточными, надежность результатов может быть поставлена под угрозу. Это исследование показало, что механическая стимуляция сама по себе не может полностью отделить биопленку. Таким образом, интеграция химической обработки с трипсином и механической стимуляцией необходима для достижения более надежной бактериальной дислойции и точного количественного определения живой бактериальной нагрузки в биопленке²¹.

Анализ количественной ПЦР обычно используется в исследованиях микробиома для оценки общей бактериальной нагрузки в биопленке. Этот анализ, вероятно, является более точным методом количественной оценки, чем анализ кристаллического фиалки²². Создавая калибровочную кривую с плазмидной ДНК, очищенной непосредственно из чистых бактериальных культур, можно точно определить бактериальную нагрузку в биопленке. Учитывая, что ген 16S рРНК является рибосомной субъединицей, присутствующей у всех бактерий, кПЦР, нацеленная на ген 16S рРНК, широко используется для количественного определения бактерий, а экспрессия гена 16S рРНК относительно стабильна во время роста Staphylococcus aureus^23,24. Ген luxA является компонентом lux-оперона в биолюминесцентном штамме Staphylococcus aureus Xen 36. Это исследование показало, что кПЦР для гена luxA также эффективна для количественной оценки образования биопленки после инокуляции Xen 36. Таким образом, количественная оценка образования биопленки может быть оптимизирована путем инокуляции биолюминесцентной бактерии и использования анализа экспрессии генов люкс-оперона. Эта процедура относительно проста в реализации, воспроизводима и позволяет исследователям анализировать несколько образцов одновременно. Кроме того, он экономичен и не требует специального оборудования, что делает его приемлемым выбором для любой лаборатории.

Этот комплексный подход имеет некоторые ограничения. Во-первых, это исследование в первую очередь направлено на оценку образования биопленки на имплантатах в локализованной и закрытой среде, что делает его недостаточным для оценки влияния биоматериалов на системные инфекции. Во-вторых, бактериальная нагрузка, необходимая для формирования хорошо развитого абсцесса в этой модели мыши, значительно выше, чем в альтернативных моделях, что может создать сложную среду для оценки устойчивости биоматериалов к^{биопленке25}. Однако для формирования абсцесса, полностью окружающего имплантаты и культивирующие имплантаты в идентичных условиях бактериальной инфекции, требовалась более высокая доза бактериологического культивирования. В-третьих, эту модель нельзя использовать, если один из имплантатов выделяет соединения, так как они могут повлиять на другой имплантат. В-четвертых, наконечник для пипетки, используемый для соединения двух имплантатов, может влиять на течение инфекции, хотя использование общедоступного наконечника для пипетки упрощает реализацию модели в любых лабораторных условиях.

В заключение, в этом исследовании представлена новая мышиная модель инфекции, связанной с имплантатами, и оптимизированные аналитические методы для точной количественной оценки образования биопленки. Ожидается, что этот комплексный подход повысит точность, воспроизводимость и универсальность показателей результатов для сравнительного количественного определения биопленки на хирургических имплантатах за счет использования ее свойств, тем самым способствуя будущему развитию антимикробных имплантатов.

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Это исследование было частично профинансировано Программой совместных исследований промышленности и университетов NSF под названием «Центр прорывных инноваций в области опорно-двигательного аппарата» (IIP-1916629), Komatsuseiki Kosakusho Co., Ltd. и Rosies Base, LLC.